Введение к работе
Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВЯЧ I) является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) - тяжелого расстройства иммунной системы, сопровождающегося развитием оппортунистических инфекций и неопластнческих образований, неизбежно приводящих к. летальному походу.
В настоящее время-в число основных задач медицинской вирусологии входят создание эффективных тест-систем, позволяющих своевременно выявлять больных и вирусоносигелей, и разработка подходов к созданию анти-ВИЧ-вакцины. Так как домен наружного оелка вирішна, отвечающий за образование вирус-нейтрализущих антител в высоких титрах, представляет собой гипервариабельную последовательность и эти антитела обладают типовой специфичностью, аффективной может предполагаться вакцина, содержащая главный нейтрализующий домен нескольких вариантов вируса. Появившиеся в последнее время данные показывают наличие географической специфичности вариабельных эпитопов поверхностных гли-коїіротеїінов. В связи с этим получение отдельных фрагментов <н>ї'Л) представляет интерес для использования их при типирова-Ш1И ВИЧ позитивних сывороток крови.
Получение препаративных количеств белков вирусных частиц для серологических исследований является, однако, трудоемким, дорогостоящим и небезопасным процессом. Одним из способов преодоления указанных затруднений является конструирование штампов микроорганизмов, способных синтезировать вирусспецнфичас-ки« іюлішептидьі с использованием современных методов генной инженерии. Такие рекомбинантные антигены могут быть использованы не только для создания диагностических препаратов, но также являться основой для получения вакцин и сывороток.
Пел» и задачи исследования. Основной целью настоящей ра-оогы было получение ракомбиналтиш плазмпд, способных обеспечить синтез рекомбинантных белков, содержащих в своем составе отдельные антигенные детерминанты области env ВИЧ-І, исследование антигенных и иымуногенных свойств этих полипептидов,
учение возможности их использования ДЛЯ ЛИЯ ГНОСТИКИ СИНоро к кропи на наличии антител к вирусу, л тпкже для выявления тнтел к отдельным фрагментам дрТбО.
В связи с этим в задачи исследования входило:
-
Конструирование рекомбинянтных плазмид, содержащих агмонтн ДИК области, env, детерминирующих синтез нирусоиеии ЧЄСКИХ последовательностей.
-
Научение экспрессии гибридных плазмид, содержащих нос дователыюсти вирусного генома, в бактериях E.colt.
-
Исследование иммунологических свойств полученных гиб диых белков, а также возможности их использования дли обип жения антител в сыворотках крови вирусоноситэлеЯ.
-
Использование полученных гибридных белков дня изучении ітительного ответе ВИЧ-инфицированных лиц и шляп лени л раз ли їй данного ответа в пределах СССР.
Научная новизна работы. В результате проведенной работы т получен набор рекомбинянтных плазмид, содержащих фрагменты на env под промотором гена В-галактозидязы (lacZ) в составе іазмидпого вектора pi)R290. Анализ экспрессии гибридных плаз ід pRC, pR2 pV3jR, рВЗ, рЕ4 и pF6 позволил установить, что в ж.териях f . сої I происходит синтез гибридных полииептидов, со фж.зших яирусспенифичяский последовательности в С-конце П га Ж.ТОЗИДЯЗМ. Полученные полипептиды обладают антигоншлщ *оііствами вирусных белков и способны связываться с антителами ВИЧ-Т. Кроме того, антитела, полученные при иммунизации *и )тных этими рекомбннантными белками, способны вапимодеГютво іть с белками вирусных частиц.
Гибридные белки, синтезирующиеся в боктеричх E.coli, one >вляют не менее 15% от тотального белка клетки и образуют так ізмваепме тельца включения, что значительно упрощает их вы ионию и очистку для дальнейших исследований.
Практическое значение работы заключается R использовании
- з -полученных рекомбннантних белков для изучения антительного ответа ШЧ-инфицированных: лиц методом непрямого ИФА.
lb защиту выносятся следующие положення:
-
Сконструированные рекомбинантіше плаэмиды pEt, рЕ2, pV3jh, pt3, рЕ4 и рЕ6, содержащие фрагменты генома ВИЧ-І, детерминируют синтез гибридных белков, способных специфически взаимодействовать с антителами к этому вирусу. Уровень синтеза рекомбннантних иолииептидов составлял не менее 15 от тотального белка клетки, и они накапливаются в бактериях E.colt в виде но растворимых телец включения.
-
Иммунизация кроликов гибридными белками, содержащими ліітшчішіш детерминанты продуктов гена env ВИЧ-І, приводит к иОр;ізоьанию специфических антител, способных взаимодействовать о натнвными вирусными env-белками.
-
Гекоыбинаитные полипептиды пригодны для создания диагностических тест-систем на антитела к ВИЧ-І.
-
С помощью метода твердофазного имыуноферментного анализа (1Н>А) с использованием полученных полипептидов, а также синтетических олигопептидов выявлены различия частоты встречаемости антител к. фрагментам реісомбинантного дрІбО в сыворотках различного географического происхождения.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на Всесоюзних конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пу-щшю на-Оке, 1990), "Новые методы диагностики СПИД, других вирусных и бактериальных инфекций в практике инфекционной и противоэпидемической службы" (Алушта, 1990), на I болгаро- советском симпозиуме по вирусным инфекциям (Варна, 1990).
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем работы составляет 133 страницы машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 7 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает