Введение к работе
Актуальность проблемы.
Успехи, достигнутые в области пептидного синтеза, позволившие автоматизировать процессы получения и очистки, разработать способы одновременного множественного синтеза, сделали доступным широкое использование пептидов в лабораторных и клинических исследованиях.
Идентификация антителосвязывающих сайтов и синтез олигопепти-дов, способных имитировать соответствующие им антигенные участки вирусных белков, - путь к созданию новых диагностических и вакцинных препаратов. Анализ структурной организации белковых антигенов способствует пониманию природы взаимодействий антиген-антитело на молекулярном уровне. С помощью синтетических пептидов стало возможным решение целого комплекса проблем, связанных с исследованием антигенной структуры белков, включающих:
картирование линейных (последовательных) В-эпитопов и хел-перных Т-эпитопов на поверхности белка;
получение моноклональных антител к определенным участкам белковой последовательности;
определение роли отдельных аминокислотных остатков (а.о.) в процессе взаимодействия антигенов со специфическими антителами и формировании антигенной детерминанты;
получение аналогов эпитопов, обладающих равной или большей специфичностью и устойчивостью комплексов антиген-антитело.
Другое важное применение синтетических пептидов связано с их способностью вызывать выработку антител, служащих инструментом для выделения и характеризации рекомбинантных белков.
Исследования последних лет продемонстрировали широкое распространение и огромную медицинскую значимость инфекций, вызываемых вирусами гепатитов А (ВГА), В (ВГВ), С (ВГС), D (ВГД), Е (ВГЕ) и опасность быстрораспространяющейся инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) на территории Российской Федерации. Эти факты говорят о необходимости проведения исследований по различным аспектам проблемы вирусных гепатитов и СПИДа в нашей стране. Одним из наиболее актуальных направлений исследований представляется изучение антигенной композиции вирусов гепатита и ВИЧ-1 и особенностей иммунитета, вызываемого этими агентами. Данные направления важны для создания современных диагностических, лечебных и профилактических препаратов.
Цель и задачи исследования.
Целью исследования является поиск пептидных антигенов - фрагментов белков вирусов гепатита и ВИЧ-1 - для анализа структурной организации вирусных В-эпитопов и создания диагностических тест-систем для определения антител к вирусам гепатита и ВИЧ-1.
В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:
Осуществить выбор на основе расчетных методов анализа и данных литературы потенциальных антителосвязыващих участков иммунодо-минантных белков вирусов гепатита В, С, D, Е, А и ВИЧ-1. Синтезировать пептиды, сответствующие выбранным участкам, их укороченные и перекрывающиеся фрагменты.
Выявить пептиды, которые в свободном состоянии или в виде коныогатов с белками-носителями способны индуцировать образование антител у лабораторных животных - мышей и кроликов, для выявления и характеризации соответствующих нативных или рекомбинантных белков.
Провести сравнительное исследование антигенной активности синтезированных пептидов в твердофазном ИФА путем изучения антигенного профиля сывороток крови больных с вирусными гепатитами и ВИЧ-1 инфекцией.
Идентифицировать антителосвязывающие сайты в составе анти-генноактивных участков и определить роль отдельных остатков в процессе взаимодействия пептидов со специфическими антителами.
Использовать наиболее перспективные в антигенном отношении пептиды для усовершенствования и модификации способов иммунофер-ментной диагностики вирусных гепатитов и ВИЧ-1 инфекции.
Научная новизна работы.
Изучена антигенная структура районов, ограниченных аминокислотными остатками (а. о.) 73-89 core-белка ВГВ и а. о. 24-41 полипептида preSl. кодируемого геном pre-S ВГВ; а.о. 20-34 и 39-75 белка core, а. о. 1689-1732 и 1921-1940 белка NS4 ВГС; а. о. 65-80 белка Р27 ВГД; а. о. 92-123 белка 0RF3 ВГЕ. Продемонстрированы возможности выявления соответствующих антивирусных антител с помощью пептидов -фрагментов исследованных областей.
В работе впервые были синтезированы и охарактеризованы В-эпи-топы в составе белка core ВГВ и полипептидов preSl и preS2 кодируемых геном pre-S ВГВ, а также в составе белка нуклеокапсида и неструктурных белков NS3 и NS5 ВГС, которые содержат консенсусный мотив -Asp-Pro-x-y-Arg- в аминокислотной последовательности, обладают
сходной вторичной структурой и одинаковой длиной. 6-7 а. о.
Впервые идентифицирована антигенная детерминанта в С-концевой части белка NS4 на участке, частично перекрывающемся с областью ре-комбинантного антигена сЮО-3. и показана высокая диагностическая ценность данного района.
Выявлен иммунодоминантный участок белка Р27 ВГД меаду 65-м и 80-м а. о. Результаты исследования указывают на наличие в этом районе HDAg нелинейной антигенной детерминанты или набора высокоиммуно-генных эпитопов.
Получена серия ранее неописанных перекрывающихся пептидов из С-концевой части белка, кодируемого открытой рамкой считывания 3 (0RF 3) ВГЕ, и идентифицированы фрагменты белка, обладающие высокой антигенной активностью.
В крови ВИЧ-инфицированных лиц юга России обнаружены антитела, способные узнавать синтезированые пептиды, соответствующие вариантам области петли V3 поверхностного гликопротеида gpl20 штамма ВИЧ-1, циркулирующего в этом регионе.
Практическая ценность работы.
Выявлены пептиды, способные индуцировать антитела, необходимые для определения уровня экспрессии рекомбинантных и гибридных белков - продуктов генов C,P,pre-S ВГВ и генов VIF.P ВИЧ-1.
Получены пептидные антигены - фрагменты белков ВГС для создания иммуноферментной диагностической тест-системы для определения в крови антител к ВГС.
Синтетические пептида, соответствующие участкам 65-80 а.о. белка Р27 ВГД, 99-119 а.о. белка 0RF3 ВГЕ и 10-23 а.о. из области петли V3 gpl20 ВИЧ-1, рекомендованы для использования с целью выявления соответственно анти-ВГД антител, анти-ВГЕ антител и анти-УЗ gpl20 ВИЧ-1 антител в клинической практике.
Основные полозения, выносимые на защиту.
-
Стратегия химического синтеза и исследования антигенных свойств 106 олигопептидов с длиной пептидной цепи от 6 до 37 а.о. из состава белков вирусов гепатита В, С, Д. Е, А и ВИЧ-1.
-
Принципы отбора антигенов и создания композиций для диагностических тест-систем на основе иммунологически активных олигопептидов из состава иммунодоминантных белков вирусов гепатита В. С, Д, Е и ВИЧ-1.
-
Большинство проанализированных антителосвязывающих участков
имеют сложную организацию, так как обладают дискретным характером антигенной структуры и (или) содержат в своем составе несколько перекрывающихся эпитопов.
-
Консенсусний мотив -Asp-Pro-x-y-Arg-, где" х" и" у" - остатки белковых аминокислот, в последовательности белка указывает на наличие в этом районе потенциального антителосвязывающего сайта.
-
Моноклональные антитела (МКА) 18/7 к preSl-области ВГВ специфически взаимодействуют в ИФА с фрагментом 31-36 этого белка.
-
Анти-НВе-антитела узнают на участке а. о. 73-89 HBcAg более протяженные аминокислотные последовательности (73-84, 74-89) по сравнению с анти-НВс-антителами. которым для взаимодействия достаточно наличия фрагмента 78-83.
-
Участки в составе белка core (а. о. 73-84), полипептидов preSl (а. о. 24-41) и preS2 (а. о. 133-143), белка pot (а. о. 25-36 и 816-832) ВГВ; в составе белка Р27 (а.о. 65-80 и 169-179) ВГД; в составе белка р34, рої (а. о. 941-950) и белка Vlf (а. о. 155-168) ВИЧ-1 являются иммуногенными. Антитела, вырабатываемые к пептидам, гомологичным данным районам, специфически реагируют с соответствующими рекомбинантными или нативными белками.
Апробация работы.
Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были обсуждены и доложены на VII Всесоюзном симпозиуме по химии белков и пептидов, Таллин, 1987; Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов, Рига, 1990; Международном симпозиуме "Вирусные гепатиты". Ростов 1990; I Болгаро-Советском симпозиуме по вирусным инфекциям, Варна, 1990; II Всесоюзном симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", Самарканд, 1991; I Съезде иммунологов России. Новосибирск, 1992; Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им.Пастера, Санкт-Петербург, 1993; Международном симпозиуме по вирусным гепатитам и болезням печени, Токио, 1993; IX Международном конгрессе по вирусологии, Глазго, 1993; Международном симпозиуме "Пептиды в иммунологии", Ин-терлакен, Швейцария, 1995; XIV Американском пептидном симпозиуме, Колумбус, 1995.
Публикации.
По результатам работы опубликованы 19 статей и тезисы 20 докладов.
Работа выполнена в плане научных исследований НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (директор - академик РАМН Д.К.Львов) в лаборатории вирусных нуклеиновых кислот и белков (руководитель -д.б.н., профессор В.Д. Смирнов) и лаборатории антигенных детерминант вирусных белков и пептидного синтеза (руководитель - Д.X.н.. профессор В.А. Шибнев). Основные результаты получены в соавторстве с сотрудниками НИИ вирусологии: Карповой В.А.. Фирсовой Т.В., Дементьевой Е. В., Худяковым Ю. Е.. Калининой Т. И., Вязовым С. 0., Яшиной Т. Л., Павлюченковой Р. П., Гараевым М. М., Кузиным С. Н.; МИТХТ им. М.В.Ломоносова: Евстигнеевой Р.П., Прокуроновой Е.И., Желтухи-ной Г.А. Своим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.