Введение к работе
С момента открытия в 1979 г ядерный фосфопротеин р53 и кодирующий его ген являются обьектами пристального изучения. Об актуальности проблемы в настоящее время свидетельствует тот факт, что в 1994 году журналом "Science" р53 был отмечен как 'молекула года". Сейчас стало очевидным, что р53 находится на перекрестке сигнальных, регуляторных и метаболических путей в клетке и играет существенную роль в ансамбле клеточных процессов.
Белок р53 дикого типа человека является сиквенс-специфическим ДНК-связывающим гетрамерным транскрипционным фактором, каждая субьединица которого содержит 393 аминокислотных остатка (а.о.). ДНК-связывающий домен мономера белка расположен между 90 и 290 а.о., N-концевая область белка содержит трансактивационный домен, а С-концевая область содержит олигомеризационный домен, несколько сигналов ядерной локализации, а также регулирует ДНК-связывающую активность белка.
р53 способен специфически узнавать в регуляторных областях генов и связываться с цимерами палиндромных последовательностей типа: 5'-RRRCWWGYYY-3" (El-Deiry et al,92; Funk et al,92), получившими название р53-респонсивных элементов. В настоящее время подобные последовательности обнаружены почти в двух десятках различных генов. Одно из направлений данной работы заключалось в поиске и функциональном анализе канонических р53-респонсивных элементов в генах - потенциальных мишенях р53.
р53 дикого типа, но не мутантный р53 способен подавлять клеточную трансформацию in vitro и in vivo, что позволило считать ген р53 геном-супрессором злокачественного роста (Lane et al.,1990). С этой биологической ролью белка р53 можно связать по крайней мере цве его важных активности, проявляющихся, в частности, при повреждениях клеточной ЦНК.
Во-первых, когда масштабы таких повреждений не слишком значительны, р53 способен арестовывать клетки на границе Gi-фазы и S-фазы клеточного цикла (Mercer et al., 1990), тем самым позволяя репарационным механизмам ликвидировать повреждения в ДНК прежде, чем начнется репликация клеточного генома. За данную функцию р53 в частности ответственна его способность позитивно регулировать экспрессию гена, кодирующего белок WAF1 - ингибитор Gi -циклинзависимых протеинкиназ (El-Deiry et al, 1993), причем длительность Gi -ареста клеточного цикла по-видимому может зависеть от регуляции экспрессии белком р53 другой его мишени - гена mdm2, белковый продукт которого способен взаимодействовать с р53 и тем самым блокировать часть активного р53 в клетке.
Во-вторых, когда такие повреждения, вызванные например радиацией или химиотерапевгическими агентами слишком обширны, чтобы быть отрепарированными, белок р53 может индуцировать программированную клеточную смерть (апоптоз) (Fisher, 1994). Возможно, что эта функция р53 опосредована координированной активацией/репрессией экспрессии р53-респонсивных генов Ьах и bcl-2, кодирующих гомологичные белки с антагонистическими функциями, первый из которых ускоряет, а второй блокирует апоптоз (Reed et al.,1995).
Таким образом, потеря р53 может приводить к дестабилизации клеточного генома являющейся результатом как накопления мутаций при репликации неотрепарированної ДНК, так и повышения выживаемости клеток с изменениями в геноме.
Инактивация или мутация гена р53 является наиболее общим изменением в геноме прі туморогенезе (Hollstein et al., 1991), которое наблюдается более чем в половине случаеі опухолей у человека (Friend et al., 1994). Наиболее частыми изменениями гена р53 і опухолях являются миссенс-мутации, т.е. замены одного аминокислотного остатка н; другой, что может быть связано с появлением у таких мутантных вариантов белка р5: одной или нескольких новых функциональных активностей, не характерных для р53 дикоп типа.
Анализ спектров миссенс-мутаций р53 из различных опухолей выявил, чті подавляющее большинство аминокислотных замен происходит в консервативны: областях белка, формирующих ДНК-связывающий домен р53 (Cho et al., 1994). Пс видимому, именно изменения специфической ДНК-связывающей активности как ключево функции р53 могут быть причиной аномальных биологических свойств мутантов р53 прі туморогенезе. Результатом таких изменении ДНК-связывания может быть как смен: спектра последовательностей ДНК, узнаваемых р53, проявляющаяся например і появлении способности мутантов связываться с новыми классами респонсивны элементов, так и понижение или повышение аффинности мутантного белка к известныг р53-респонсивным элементам с канонической последовательностью.
В связи с этим одним из направлений данной работы было с одной стороні рассмотрение взаимодействия р53 дикого типа с рядом р53-респонсивных элементов и известных генов - мишеней р53, а с другой - исследование взаимодействия различны мутантных вариантов белка с консенсусной последовательностью р53-респонсивноп элемента.
Способность к взаимодействию белка р53 с ДНК зависит от ряда структурне функциональных характеристик белка, к которым кроме мутационных изменени структуры относятся конформационное состояние молекулы, способность р53 переходит в неактивное мультимерное состояние (Hupp et al., 1992), а также внутримолекулярно взаимодействие с ингибиторным доменом (Clore et al.,1994). Две последние возможност связаны в основном с соответствующими структурами С-концевой области белка р53 по-видимому могут быть блокированы различными агентами, например монокпональным антителами к С-концу молекулы (Hupp et al.,1992). Часть настоящей работы посвящен исследованию влияния этих свойств р53 на его взаимодействие с ДНК.
Поскольку биологические эффекты р53 как супрессора клеточной трансформаци опосредованы его ключевой биохимической активностью - специфически! взаимодействием с ДНК, то с коррекцией данной активности могут быть связаны терапевтические аспекты проблемы онкогенеза. Такой генотерапевтический подход може включать в себя введение в регуляторные области определенных генов р5: респонсивных элементов с различными функциональными свойствами, блокировани известных регуляторных р53-респонсивных сайтов антисмысловыми полинуклеотидамі использование генноинженерных вариантов белка р53 или его фрагментов модифицированной ДНК-связывающей активностью, а также применение биохимически зондов на основе моноклональных антител к р53.
Целью данной работы являлось изучение различных аспектов специфического ізаимодействия белка р53 с ДНК in vitro. В частности были поставлены следующие адачи:
- выявить новые потенциальные р53-зависимые гены, содержащие канонические р53-вязывающие последовательности ДНК;
охарактеризовать взаимодействие белка р53 дикого типа с р53-респонсивными ДНК-ілементами из регуляторных областей различных генов-мишеней р53, а также с юкусственными вариантами р53-респонсивного элемента;
изучить с помощью панели различных моноклональных антител к р53: а) влияние модификации антителами С-концевой области белка на регуляцию его ДНК-зязывающей активности;
б) зависимость ДНК-связывающих свойств белка р53 от его конформационного юстояния, детектируемого антителами, специфичными к конкретным конформациям іелка; исследовать ДНК-связывающую активность некоторых мутантных вариантов белка р53.
Впервые обнаружен и функционально охарактеризован р53-респонсивный элемент из -го интрона гена человека, кодирующего фермент аденозиндезаминаэу.
Проведен анализ взаимодействия р53 с р53-респонсивными элементами из различных енов и искусственными вариантами консенсусной последовательности. Выявлена :иквенс-зависимость интенсивности взаимодействия р53 дикого типа с респонсивными лементами из различных генов-мишеней р53, что предполагает существование иерархии ІНК-злементов, специфически взаимодействующих с р53.
Разработана методика подробного титрования р53-содержащих ДНК-белковых омплексов в нуклеопротеиновом геле, позволяющая анализировать влияние различных гоноклональных антител к р53 на взаимодействие р53 с ДНК. Получены данные о влиянии онформационного состояния р53 и модификации С-концевой области р53 юноклональными антителами на его ДНК-связывающие свойства. Получен ряд клонов рансформированных N-ras фибробластов мыши, экспрессирующих активные в ітношении ДНК-связывания мутанты р53. Обнаружена способность ряда мутантов р53 к пецифическому взаимодействию с ДНК in vitro, а также повышенная по сравнению с іругими мутантами интенсивность взаимодействия с ДНК мутанта р53 175(Arg->His), что івляется существенным для понимания функциональных особенностей некоторых іутантов р53 при туморогенезе.
Материалы диссертации были изложены на межлабораторном коллоквиуме іаборатории пролиферации клеток Института молекулярной биологии им. (АЭнгельгардта РАН и лаборатории цитогенетики опухолей Института канцерогенеза ісеросийского онкологического центра им. Н. Н. Блохина РАМН (Москва, 1995 г.),
на молодежной научной школе "Молекулярная биология конец XX века (г. Черноголовка,1995 г.), на 7-м Международном научном симпозиуме по р53 (Канада
1994 г.), на международном семинаре молодых ученых: "Детекция молекулярны
взаимодействий, контролирующих экспрессию генов " (Швеция, 1994 г.), н
международном семинаре молодых ученых по проблемам клеточной биологии (Дания
1995 г.).
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ