Введение к работе
Актуальность проблемы. Геномы живых организмов содержат разнообразные по структуре мобильные элементы (транспозоны). Так, например, у дрозофилы их известно более 30 видов. Перемещения транспозопов могут вызывать хромосомные перестройки, а также мутации в генах-мишенях, вследствие этого они оказывают большое влияние на изменчивость видов. Так, более половины спонтанных мутаций, изученных у дрозофилы, индуцированы мобильными элементами. Многие наследственные заболевания человека имеют аналогичное происхождение. Кроме того, мобильные элементы находят все большее применение как удобные инструменты для манипуляции с геномами с целью изучения закономерностей протекания различных генетических процессов и создания генно-инженерных конструкций. У дрозофилы для этих целей наиболее удобным оказался Р элемент, на основе которого созданы самые популярные вектора. Р элемент также широко используется для сайт-направленного мутагенеза in vivo и получения новых доступных для клонирования мутаций. Другим интенсивно изучаемым мобильным элементом дрозофилы является ретрогранспозон МДГ-4. В его составе бьш обнаружен первый из нескольких известных на сегодняшний день инсуляторов - последовательностей ,, которые' способны блокировать взаимодействия между энхансером и промотором гена в случае нахождения между ними. Выяснение механизмов действия инсуляторов представляет интерес как в научном, так и в прикладном плане - для создания векторов с независимой от окружающих последовательностей экспрессией генов. Однако, несмотря на многочисленные работы, ведущиеся в этом направлении, полностью доказанной модели, описывающей механизм функционирования инсуляторов, на данный момент не создано. Также остается открытым целый ряд вопросов, касающихся закономерностей
транспозиций и способов индукции мобильными элементами мутаций, не оценен их вклад в быструю эволюцию регуляторных систем гена.
Все вышеперечисленные проблемы нашли свое отражение в настоящем исследовании. С этой целью в нашей лаборатории на базе локуса yellow, являющегося горячей точкой инсерции транспозонов, в частности Р элемента и МДГ-4, был создан ряд модельных систем для изучения механизмов транспозиций мобильных элементов и их роли в регуляции экспрессии гена-мишени. Удобство имеющихся систем заключается в том, что экспрессию гена yellow, определяющего окраску кутикулы и ее производных структур, легко оценивать визуально; кроме того, данный ген не является жизненно необходимым, что дает возможность получать любые его перестройки.
Цель и задачи исследования. Основными целями настоящего исследования являются выявление с помощью модельных систем новых механизмов влияния регуляторных последовательностей Р элемента и МДГ-4 на транскрипцию гена-мишени и описание паттернов вырезания Р элемента в различных условиях.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
изучить паттерны вырезания Р элемента из локуса yellow и выявить роль в этом процессе окружающих последовательностей и цитотипа линий;
-
локализовать последовательности в Р элементе, которые активируют транскрипцию гена yellow;
-
определить роль последовательностей МДГ-4 , отличных от его su(Hw)-связьгвающего района, в регуляции экспрессии гена-мишени;
-
исследовать инсуляторные свойства Би(Н\\0-связывак>щего района МДГ-4 на фоне ослабленных взаимодействий между энхансером и промотором.
Научная новизна и практическое значение работы. Изучены паттерны вырезания Р элемента в разных экспериментальных условиях in vivo. Показано, что полученную
систему можно в дальнейшем использовать для изучения влияния различных факторов на характер вырезания Р элемента. Идентифицирован новый регуляторний район гена yellow, ответственный за активацию его транскрипции. Установлено, что инсерция Р элемента в положение -69 компенсирует делению этого района и восстанавливает транскрипцию гена yellow. Картированы два участка внутри Р элемента, ответственные за активацию транскрипции гена yellow. Таким образом, показано, что инсерция Р элемента в ген-мишень может усиливать его экспрессию. Полученные результаты могут быть использованы для усовершенствования систем Р-индуцировашюто мутагенза.
Впервые выявлена негативная роль последовательностей мобильного элемента МДГ-4, не входящих в состав его 5и(Н\у)-связывающего района, в регуляции транскрипции гена yellow. Обнаружено, что при определенных условиях, su(Hw)-инсулятор может блокировать взаимодействия между энхансером щетинок и промотором гена yellow, пе находясь в положении между ними. Этот результат предполагает пересмотр существующих моделей, касающихся механизмов действия инсулятора, понимание которых необходимо ' для эффективного использования инсуляторных последовательностей при получении трансгенных животных и растений.
Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены: на летней школе Европейского биохимического общества (Спецаи, Греция, 1996), на 38-й и 39-й Ежегодных конференциях по исследованию на дрозофиле (Чикаго, США, 1997; Вашингтон, США, 1998), на отчетных конференциях Института медицинских исследований при университете г. Осло 1996 и 1997 гг. (Москва) и на межлабораторном семинаре (1998) ИБГ РАН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано три печатные работы.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на <.<т.<Г страницах, включая . таблиц, ..о- рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы из4;!.7. наименований.