Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 5
Основной принципы врожденного и приобретенного иммунитета 6
Рецепторы и лиганды, вовлеченные в неклональныи иммунный ответ 7
Гуморальный иммунный ответ 13
Опухолевые антигены, кодируемые нормальными клеточными генами 14
Опухолевые антигены, кодируемые мутантными клеточными генами 17
Опухолевые антигены, кодируемые вирусными генами 19
Клеточный иммунный ответ 23
T лимфоциты 24
Натуральные киллеры и лимфокин-активированные киллеры 26
Макрофаги 27
Факторы, ограничивающие эффективность действия противоопухолевого иммунитета 28
Клональные делеции и игнорирование 29
Изменения в экспресии молекул MHCI 29
Селективная потеря антигена или эпитопных вариантов 30
Антигенная модуляция 31
Иммунологическое усиливание и блокирующие факторы 31
Агрессивное поведение самой опухоли 32
Белковые факторы, продуцируемые в процессе иммунного ответа: сигналы опасности 34
Прямое цитолитическое действие на чужеродный антиген 34
Хемоаттракция (хемотаксис) 38
Стимуляция клональных Т- и В- лимфоцитов и клеток врожденного иммунитета 38
Общая характеристика и свойства цитокинов 40
Семейство интерферонов 42
Семейство фактора некроза опухоли 51
Генная терапия и генная терапия опухолевых заболеваний 59
Системы переноса генов 61
Клинические исследования: мишени, результаты и извлеченные уроки 62
Клинические исследования 63
Клиническая и техническая применимость 65
Использование генов для терапии опухолевых заболеваний 66
Материалы и методы исследования 70
Ферменты и реактивы 70
Клеточные линии и первичные культуры клеток 70
Выделение нейтрофилов и лимфоцитов человека 71
Плазмидные и фаговые векторы 72
Штаммы бактерий 72
Трансформация клеток Е. Coli 72
Выделение плазмидной ДНК 74
Определение первичной последовательности ДНК 75
Выделение тотальной РНК 76
Реакция обратной транскрипции и амплификация фрагментов KflHKtag7 76
Нозерн- и Саузерн- блот гибридизационный анализ 79
Экспрессия рекомбинантного белка 82
Получение поликлональной антисыворотки и очистка антител 82
Иммунопреципитация белка Тад7 из клеточных лизатов и кондиционной среды83
Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блот- анализ 83
Анализ мультимерной структуры белка Тад7 84
Иммуногистохимический анализ 85
Определение цитотоксической активности 87
Электронно-микроскопический анализ опухолевых срезов 88
Получение стабильно трансфецированных клонов 88
Получение клеточной вакцины, модифицированной генами in vitro 89
Анализ скорости роста опухолей in vivo 90
Результаты исследования и их обсуждение 92
Клонирование и изучение генов tag7 млекопитающих 92
Новое семейство генов млекопитающих, имеющих лизоцим-подобный домен 124
Разработка моделей генной терапии опухолей 130
Разработка противоопухолевой вакцины на основе аутологичных клеток, модифицированных геном tag7 на мышиных моделях 141
Протокол клинических испытаний I фазы 148
Выводы 170
Благодарности 172
Список литературы 173
- Опухолевые антигены, кодируемые вирусными генами
- Семейство фактора некроза опухоли
- Клонирование и изучение генов tag7 млекопитающих
- Протокол клинических испытаний I фазы
Опухолевые антигены, кодируемые вирусными генами
Целый ряд ДНК содержащих онкогенных вирусов ассоциирован с человеческими опухолями. Вирусные белки области ранней транскрипции ДНК-содержащих вирусов связаны с опухолевым фенотипом и с установлением злокачественного поведения клеток, а также являются специфическими антигенами опухолей, вызванных данным типом вирусов. Например, вирусы полиомы и SV40 кодируют функционально сходные, но антигенно отличные белки, необходимые для опухолевой трансформации. Эти кодируемые вирусами антигены представлены во всех типах опухолей, вызванных данными вирусами, независимо от вида организма или типа ткани из которого возникла опухоль (65; 66). Такие белки представлены, в основном, как ядерные антигены, однако, те же гены кодируют вирус-специфические трансплантационные антигены, экспонированные на клеточной поверхности (67). Ряд человеческих вирусов папиломы ассоциирован с цервикальными опухолями. Онкопротеин Е7, полученный из вируса человеческой папиломы 16 (HPV16), представлен в качестве антигена на большинстве цервикальных карцином (68). Антигены, кодируемые вирусом гепатита В, представлены на большинстве первичных опухолей печени (69). Вирус EBV ассоциирован с эндемичной лимфомой Беркета и другими В-клеточными лимфомами, а также с назофарингиальными карциномами (70, 71).
Все опухоли, индуцированные ДНК содержащими онкогенными вирусами, отличаются обширной иммунологической кросс-реактивностью, поэтому достаточно эффективным подходом для терапии данного типа заболеваний является применение моноклональных опухоле-специфических антител, полученных против антигенов данного типа (72).
Геном РНК-содержащих вирусов кодирует как нормальные вирусные белки, так может нести вирусные онкогены, кодирующие химерные белки, которые определяют трансформирующую способность вируса и содержат фрагменты клеточных белков. О подобных химерных антигенах говорилось выше.
Большое количество РНК-содержащих онкогенных вирусов ассоциированны с различными типами опухолей у млекопитающих (73 ). С опухолями человека ассоциировано несколько онкорнавирусов, однако, наиболее четкая связь показана для HTLV-1 (human Т-lymphotropic virus 1), который ассоциирован с ATLL (adult T-cell leukemia-lymphoma) (74).
В качестве антигенов опухолей, индуцированных РНК-содержащими вирусами, представлены вирусные коровые белки, суперантигены, кодируемые открытой рамкой считывания LTR MMTV (75) или gag геном MuMLV, и другие белки (76).
Все опухоли, несущие данные антигены, также отличаются обширной иммунологической кросс-реактивностью, несмотря на их индукцию различными группами вирусов и вид организма.
Данные, демонстрирующие наличие гуморального иммунного ответа, направленного против опухолевых клеток, были получены преимущественно в экспериментах in vitro. Тем не менее, гуморальный иммунно-эффекторный механизм играет важную роль во взаимодействии организма с опухолевыми клетками (22).
Лизис опухолевых клеток опосредован антителами и комплементом, так антитела IgM и IgG типов обладают способностью опосредовать разрушение опухолевых клеток in vitro в присутствии комплемента (22). Эксперименты, проведенные с клетками TL лейкемии, показали, что in vitro в присутствии гетерологичного комплемента специфические противоопухолевые антитела достаточно эффективно действуют против опухолевых клеток (77). Мышиные моноклональные антитела Lym-1 также эффективно действуют против злокачественных В-клеточных лимфом в присутствии комплемента, при этом происходит активация ADCC (antibody-dependent cell mediated cytotoxicity) с помощью мононуклеарных клеток переферической крови (78).
Гуморальный иммунный ответ является наиболее эффективным против дисперсных опухолей. Тем не менее, было показано, что моноклональные антитела специфично действуют против клеток солидных опухолей (79). Эксперименты на животных показали, что специфичные для опухолевых клеток моноклональные антитела обладают способностью ингибировать рост опухолей в бестимусных мышах (80 , 81). В экспериментах in vitro и in vivo было продемонстрировано, что клетки солидных опухолей уничтожаются в результате действия ADCC, инициируемой узнаванием опухолевых клеток специфическими антителами, при участии макрофагов, натуральных киллеров и нейтрофилов (82).
Как известно, для метастатической активности различных типов опухолей необходимы изменения специфичности адгезии опухолевых клеток. Биспецифические антитела, действующие против поверхности опухолевых клеток, могут интерферировать с адгезивными свойствами опухолевых клеток и супрессировать процесс метастазирования (83). Несмотря на то, что in vivo механизмы действия гуморального противоопухолевого иммунного ответа недостаточно ясны, противоопухолевая терапия с использованием специфичных к опухолевым клеткам моноклональных антител является достаточно эффективной и широко используется в клинической практике (84; 85; 86; 87). Одним из подходов для индукции гуморального ответа является иммунизация in vivo опухолевыми антигенами с использованием различного типа вакцин (88). Также достаточно эффективным подходом для ингибирования роста опухолей является использование моноклональных антител к рецепторам ростовых факторов на поверхности трансформированных клеток, в частности, к рецептору, кодируемому лей-онкогеном (89; 90) или рецептору IL-2 (91). Так как антитела оказывают только маргинальный терапевтический эффект, то они часто используются в противоопухолевой терапии как носители для различных цитотоксических агентов (природные токсины, радиохимические и химиотерапевтические агенты) (92, 93).
Клеточный иммунный ответ.
Клеточный иммунный ответ опосредован определенными субпопуляциями Т-лимфоцитов. Для осуществления данного типа иммунного ответа необходимо присутствие антигена и молекулы MHCI на поверхности клеток. Определенную роль в клеточно-опосредованном иммунитете играют неспецифические эффекторные клетки, такие как натуральные киллеры (NK) и активированные макрофаги (20).
Семейство фактора некроза опухоли
Семейство фактора некроза опухоли составляет группа цитокинов, являющихся медиаторами и модуляторами иммунного ответа, которых объединяют на основании их структурной гомологии. Члены данного семейства лигандов фактора некроза опухоли (230, 231) существуют преимущественно в мембрано-связанной форме и представляют собой трансмембранные гликопротеины II типа. Исключение составляет лимфотоксина-альфа (LTa, LT или TNFb), который обнаружен только в секретируемои форме. Другие члены данного семейства, такие как фактор некроза опухоли (ФНО или TNFa) (232) и Fas лиганд (233), также имеют биологически активные растворимые формы. Для ряда представитей этого семейства характерно образование тримеров, состоящих из идентичных субъединиц, как было показано для TNFa (234) и LTa (235). Исключением является мембраносвязанный LTb, который образует два различных гетеротримерных комплекса совместно с LTa с различной стохиометрией компонентов (236).
Семейству лигандов фактора некроза опухоли соответствует суперсемейство рецепторов (230), в которое входит ряд трансмембранных белков I типа, обладающих характерной гомологией в цистеин-богатой области внеклеточного домена. Каждому лиганду семейства ФНО соответствует уникальный клеточный рецептор, за исключением TNFa и LTa, которые взаимодействуют с двумя типами рецепторов (55кД и 75кД) (237).
Члены ФНО семейства экспрессируются, в основном, в клетках иммунной системы (В- и Т-лимфоцитах, моноцитах, нейтрофилах, спленоцитах, дендритных клетках), а также в ряде других клеток, включая опухолевые (230).
Члены TNF семейства обладают рядом биологических активностей, опосредованных через соответствующие рецепторы. В частности, их действие связанно с регуляцией клеточной активации, включая иммунный ответ и воспалительные реакции, с регуляцией развития лимфоидной ткани, а также в механизмах, регулирующих программированную клеточную смерть, или апоптоз (230, 231).
NFa и LTa
Одним из наиболее хорошо изученных и давно известных представителей этого семейства является TNFa, который дал название всему семейству цитокинов (238). Его название связано со свойством индуцировать in vivo геморрагический некроз в определенных типах опухолей (239). Независимо он был также назван кахектин, как присутствующий в крови фактор, опосредующий истощение организма в течении паразитических инфекций (240).
Основываясь на способности индуцировать некроз опухолей в мыши, рекомбинантный TNF был применен в клинической практике для терапии опухолей человека (241). Однако, так как TNFa обладает рядом плейотропных эффектов, его использование в противоопухолевой терапии было связано с различными проблемами, что было обусловлено его побочным токсическим действием на организм (242). В дополнение к этому было обнаружено, что супрессивный эффект фактора некроза опухоли не распространяется на все типы опухолевых трансформаций (243). Несмотря на вызываемый токсический эффект при системном применении TNFa, его локальное применение, а также комбинированное действие с другими цитокинами, являются достаточно эффективными в случае терапии некоторых типов опухолей (244).
Первоначально в качестве продуцентов фактора некроза опухоли были описаны фагоциты, активированных липополисахаридом. Позднее было показано, что ФНО продуцируется широким спектром клеток, включая активированные лимфоциты, тучные клетки, фибробласты и другие (245). Он экспрессируется как мембрано-ассоциированный полипептид с молекулярным весом 26 кД, который в последствии может процессироваться в активную растворимую форму с молекулярным весом 17 кД в результате протеолитического расщепления вне клетки (246). Растворимая форма TNFa опосредует различные воспалительные процессы, является медиатором разнообразных иммунных процессов и клеточной смерти, а также обладает гематопоэтическим эффектом (247). В дополнение к действию растворимой формы, мембрано-ассоциированный TNFa также способен убивать клетки-мишени при непосредственном клеточном контакте (174), а также принимает участие в ко-стимуляции В-клеток (248).
Лимфотоксин-альфа, или лимфотоксин, был открыт в 1968 году двумя независимыми группами как фактор, продуцируемый лимфоцитами и токсичный для сингенных эмбриональных фибробластов и клеток линии L929, и получил название лимфотоксин (LT) (249).
Спектр типов клеток, экспрессирующих лимфотоксина-альфа, в отличие от ФНО, достаточно ограничен. Он продуцируется как растворимая молекула с молекулярным весом 25 кД (250) только активированными Т- и В-клетками, а также рядом Т- и В-клеточных лимфом (251). Некоторые трансформированные В-клеточные линии продуцируют лимфотоксин, выполняющий в этих случаях роль аутокринного ростового фактора. При сравнении аминокислотных последовательностей LT и TNF было обнаружено, что гомология между ними составляет около 35% (252). Также были обнаружены и некоторые общие для них биологические активности, включая цитотоксическое действие по отношению к клеткам линии L929, индукцию некроза саркомы Meth A in vivo (253), активацию полиморфоядерных лейкоцитов и ряд других (254), что дало лимфотоксину еще одно название - TNFb.
Как упоминалось ранее, для TNFa и LTa характерно образование гомотримерных комплексов (255;235). Такой гомотримерный лиганд способен связываться с тремя молекулами рецептора, вызывая их кластеризацию на клеточной мембране, что, в свою очередь, обуславливает передачу сигнала внутрь клетки (256; 257). Для фактора некроза опухоли клонированы и охарактеризованы два типа рецепторов TNFRI (с молекулярным весом 55кД) и TNFRII (с молекулярным весом 75кД), с которыми также связывается и LTa (257). Более подробная характеризация рецепторов показала, что такие биологические активности как цитотоксичность, стимуляция пролиферации фибробластов, антивирусная активность, активация экспрессии молекул адгезии и синтеза простагландинов опосредуются TNFRI (258; 259; 260). При этом важную роль в процессе индукции экспрессии различных генов играет активация транскрипционного фактора NFkB, контролируемая рецептором первого типа. Также важной особенностью TNFRI является наличие специфического домена в цитоплазматической части рецептора, вовлеченного в процесс передачи сигнала цитотоксичности, и названного "домен смерти" (death domain) (261). Для TNFRII показана специфическая роль в стимуляции пролиферации тимоцитов и зрелых Т-клеток(262).
-LTb
Лимфотоксин-бета был впервые обнаружен как белок с молекулярной массой ЗЗкД, который детектировался в комплексе с LTa на поверхности клеточной мембраны (236). После клонирования кДНК этого белка и сопоставления соответствующей ей последовательности аминокислотных остатков с последовательностями других белков -представителей семейства ФНО было обнаружено, что аминокислотная последовательность LTb гомологична как TNFa, так и LTa (236), и что и послужило основанием для названия белка. Ген LTb находится в том же локусе, где расположены гены TNFa и 1_Та (263).
Высокая консервативность аминокислотных остатков, принимающих участие в формировании третичной структуры, у всех трех представителей семейства позволила предположить сходство третичной структуры белков, и, как следствие, возможность образования гетеротримерных комплексов между LTa и LTb. Теоретически LTa и LTb могут образовывать два разных гетеротримера LTa2/b1 или LTa1/b2. Позднее с помощью специфических антител к LTa и LTb было показано, что на клеточной мембране существуют оба комплекса: минорный LTa2/b1 и основной LTa1/b2 (264).
Большинство клеточных линий, секретирующих LTa, экспрессируют также и мембранный LTb (252). Анализ экспрессии мРНК LTb в различных органах и тканях человека показал его специфическую экспрессию в тимусе и селезенке, а также в лимфоцитах переферической крови. При этом уровень экспрессии LTb значительно увеличивался после их индукции (265).
Для LTb существует специфический рецептор, с которым связывается преобладающий гетеротримерный комплекс LTa1/b2 (266). Этот рецептор обладает обширной гомологией с TNFRI и TNFRII рецепторами (252). Кроме того, для рецептора LTb характерны сходные с другими членами семейства рецепторов структура и свойства.
Клонирование и изучение генов tag7 млекопитающих
Первой задачей исследования являлась обнаружение и исследование генов, которые могут быт использованы для целей генной терапии. Для этого был выбран подход основанный на сравнении картины экспрессии генов в опухолях с противоположными метастатическими свойствами. Для практического осуществления этой цели существует целый ряд подходов. Одни из них основаны на дифференциальной гибридизации кДНК библиотек с различными меченными мРНК (338), другие на методах истощения мРНК и последующего их анализа (339, 340). В дальнейшем был предложен простой и достаточно эффективный метод, получивший название дифференциального дисплея РНК (341). Преимуществом данного метода является то, что он за короткое время и используя небольшие количества первичного материала позволяет идентифицировать фрагменты мРНК, уровень экспрессии которых различается в выбранных образцах. Для исследования были выбраны перевивные опухолевые и соответствующие им клеточные линии ВМР-0 и ВМР-П (342). Опухоли являлись перевивной аденокарциномой молочной железы мыши, ВМР-0 являлась низко метастазирующей, а ВМР-П давала обильные метастазы в основном в печень. Для мРНК, выделенных из опухолевой ткани, была применена процедура дифференциального дисплея, которая позволила обнаружить целый ряд диффернциально экспрессирующихся последовательностей мРНК. Из них были выбраны фрагменты, которые имели повышенный уровень экспрессии в опухоли ВМР-П. Часть из них была взята на дальнейший анализ с помощью Нозерн-блот гибридизации. Один из фрагментов при гибридизации с тотальной РНК давал сильный гибридизационный сигнал с РНК из опухоли ВМР-П, но не гибридизовался с РНК опухоли ВМР-0. Ген, соответствующий полученному фрагменту, получил название tag7 (аббревиатура от Tumor Associated Gene) (343). Для клонирования полноразмерного гена была сконструирована библиотека из опухоли ВМР-П. Скрининг библиотеки позволил выделить полноразмерный ген, последовательность которого была помещена в базу данных ( Gene Bank, Х86374). Единственная гомология в структурной части гена обнаруживалась с фаговыми лизоцимами. На рисі, приведено сравнение аминокислотных последовательностей лизоцима фага Т7 и белка Тад7. Как видно из рисунка гомология наблюдается на протяжении всего белка и составляла 31%. Моделирование третичной структуры подтвердило структурное сходство белков (рис 1Б). Фаговые лизоцимы имеют две функции. Первая- это их амидазная активность. Для проявления амидазной активности необходимо связывание ионов цинка гистидинами в позиции 17 и 122, тирозином в позиции 46 и цистеином в позиции 130. Как видно из рисунка, в белке Тад7 эти аминокислоты не консервативны и, таким образом, не способны связывать ионы цинка, что приводит к отсутствию амидазной активности белка. Другой функцией фаговых лизоцимов является ингибирование Т7 РНК полимеразы. Эта функции реализуется через чисто физическое и структурное взаимодействие.
Как показало компьютерное моделирование, это условие выполняется и, таким образом, белок Тад7 может ингибировать ТЗ, SP6, Т7 РНК полимеразы прокариот. Однако, необходимо отметить, что РНК полимеразы прокариот имеют высокую степень гомологии с митохондриальными РНК полимеразами млекопитающих. Так, митохондриальная РНК полимераза человека (U75370) на 27% идентична Т7 РНК полимеразе по всей ее длине. Таким образом, на основании структурной гомологии не исключено, что белок Тад7 может ингибировать транскрипцию с митохондриальной ДНК высших организмов. Чтобы выявить, присутствует ли в составе генома человека гомолог мышиного гена tag7 был проведен Саузерн-блот гибридизационный анализ геномной ДНК человека с пробой кДНК tag7 мыши. Гибридизационный анализ, проведенный в формамид-содержащем буфере при температуре 42С позволил детектировать ряд сигналов, которые свидетельствовали о том, что существует человеческий гомолог гена, представленный как минимум двумя экзонами.
Результаты Саузерн-блот-гибридизационного анализа позволили предположить высокую степень гомологии между геном tag7 мыши и его человеческим аналогом. В лаборатории молекулярной генетики рака имелся большой набор праймеров к кодирующей части гена tag7 мыши. Это позволило попытаться осуществить амплификацию человеческого гомолога с помощью реакции РТ-ПЦР с гетерологичными праймерами в мягких условиях. В качестве матрицы в реакции РТ была использована тотальная РНК, выделенная из лейкоцитов пациентов с Т-клеточной лейкемией. Для амплификации было использовано 8 пар праймеров. 5 из праймеров (1ок2, 2ок, Зок, 4ок, ЗМ) комплементарны кодирующей части гена tag7 мыши и один (NGp) представляет собой рассеянную затравку, содержащую сайт Xhol для последующего клонирования. Последовательности праймеров: 1ок2- 5 CGGCAGCTTCTGCAAC 3 , 2ок- 5 GCCAATAGACATGGGA 3 , Зок-5 GTCCTTTGACTTCATA 3 , 4ок- 5 GGATCTCAGGAAG 3 , ЗМ- 5 TTCCTTATTGGAGA 3 , NGp: 5 CTGATCCTCGAG(AT)12 З . Использованные пары: 1ок2+2ок, 1ок2+Зок, 1ок2+4ок, ЗМ+Зок, ЗМ+4ок, NGp+2oK, NGp+Зок, NGp+4oK. Пониженная температура отжига (37С) позволяла ожидать, что гетерологичные праймера отожгутся на матрицу человеческой кДНК.
Для элонгации вместо Tag-полимеразы была использована Pfu полимераза, высокая 3 - экзонуклеазная активность которой позволяет изъять неспарившиеся нуклеотиды на 3 конце праймера и повысить специфичность полимеразной реакции. Было амплифицировано несколько фрагментов. Гибридизационный анализ с a32[P]dATP- меченой пробой полученных фрагментов с человеческой и мышиной мРНК и геномной ДНК позволил выбрать среди них фрагмент размером 195 п.н., который соответствовал по молекулярной массе аналогичному фрагменту мышиного гена tag7. Этот фрагмент был субклонирован в плазмидный вектор pGEM-7Z и секвенирован. Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с банком данных выявило высокую степень гомологии (порядка 85%) с мышиным tag7 (рис.2). Фрагмент фланкирован праймерами 1ок2 (прямой праймер) и 2ок (обратный праймер)) (344).. На 3 -конце обратного праймера показана замена Т в нуклеотидной последовательности мышиного tag7 на С в последовательности человеческого гена, что является результатом работы Pfu полимеразы.
Полученный фрагмент был использован для идентификации полноразмерной кДНК гена tagl. С этой целью была проанализирована коммерческая библиотека кДНК клеток костного мозга человека, клонированная в векторе X Zap (Stratagene). . С помощью плазмидных праймеров ТЗ и Т7 был проведен анализ нуклеотидной последовательности. Клон, обозначенный как #6, протяженностью 672 п.н., содержал полноразмерную копию кДНК tag7 (рис.3).
Протокол клинических испытаний I фазы
Противоопухолевой терапии методом трансплантации аутологичных клеток меланомы и рака яичников, модифицированных генами tag7 и GM-CSF in vitro. Руководители проекта:
1. Гарин A.M., д.м.н., профессор, академик РАЕН, заведующий отделением клинической фармакологии и химиотерапии НИИ Клинической Онкологии РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (НИИ КО)
2. Барышников А.Ю. д.м.н., профессор, академик РБА, директор НИИ Экспериментальной Диагностики и Терапии Опухолей РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (НИИ ЭДиТО).
3. Георгиев Г.П., академик РАН, директор Института биологии гена РАН.
Ответственный исполнитель: Козлов A.M., д.м.н., заведующий лабораторией экспериментальной терапии метастазов НИИ ЭДиТО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Исполнители:
1. Палкина Т.И., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии НИИ ЭДиТО РОНЦ.
2. Михайлова И.Н., к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии НИИ ЭДиТО РОНЦ.
3. Вайнсон А.А., д.б.н, заведующий лабораторией радиобиологии НИИ ЭДиТО РОНЦ.
4,Мещерикова В.В., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории радиобиологии НИИ ЭДиТО РОНЦ.
5. Михайлова Л.М.,д.б.н., заведующая лабораторией фармакологии и токсикологии НИИ ЭДиТО РОНЦ.
6. Ермакова Н.П., к.м.н., старший научный сотрудник лаборатории фармакологии и токсикологии НИИ ЭДиТО РОНЦ.
7. Перетолчина Н.М., к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории экспериментальной терапии метастазов НИИ ЭДиТО РОНЦ.
8. Тюляндин С.А., д.м.н., главный научный сотрудник отделения клинической фармакологии и химиотерапии НИИ КО РОНЦ.
9. Демидов Л.В., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник хирургического отделения общей онкологии НИИ КО РОНЦ.
10. Кузнецов В.В., д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник от 149
деления хирургической онкогенекологии НИИ КО РОНЦ.
11. Харкевич Г.Ю., к.м.н., старший научный сотрудник группы по испытанию новых противоопухолевых лекарств отдела внешних сношений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.
12. Коржевская Е.В., к.м.н., врач отделения хирургической онкогенекологии НИИ КО РОНЦ.
13. Киселев С.Л., к.б.н., рук.группы в отделе молекулярной генетики рака Института биологии гена. и. Ларин С.С. , аспирант Института биологии гена РАН 15. Суровой А.Ю., к.б.н. рук. группы Института биоорганической химии им Шемякина и Овчинникова РАН Резюме:
Модификация опухолевых клеток с помощью генов цитокинов с целью повышения противоопухолевой резистентности организма интенсивно разрабатывается на экспериментальных моделях и в клинических испытаниях. К настоящему времени клинические испытания проводятся с генами таких цитокинов как интерлейкины 2, 7, 12, макрофагально-гранулоцитарный колонии стимулирующий фактор. Проводятся испытания вакцин разработанных как на основе ауто- так и аллогичных модифицированных опухолевых клеток. При проведении исследований получены убедительные результаты, свидетельствующие, например, что инокуляция мышам опухолевых клеток, трансфецированных геном IL-2, повышает специфический противоопухолевый иммунитет до уровня, достаточного для подавления туморогенности повторной трансплантации дикого типа исходных опухолевых клеток. Основной моделью при клинических испытаниях служит опухоль меланома человека, хотя на животных моделях хорошие результаты получены и для других типов опухолей как моделях рака почки, толстой кишки.
Настоящее исследование предполагается провести с целью оценки эффективности вакцины на основе аутологичных опухолевых клеток человека, модифицированных человеческим геном tag7 или ГМ-КСФ при лечении ограниченного числа больных меланомой и раком яичников в стадии IV, резистентных к хирургическому, химиотерапевтическому и лучевому воздействию.
Вакцина приготовлена на основе аутологичных опухолевых клеток больных, путем введения в них соответствующего гена и инактивированных облучением. Инактивация облучением ингибирует пролиферативную активность клеток, при сохранении клеточного метаболизма.
Больным будут введены две разные дозы вакцины , определенные по результатам токсикологических тестов. После этого будут оценены побочные, а также иммунологические и клинические эффекты.
Задачи исследования:
1. Оценить безопасность повторных инъекций вакцины с интервалом в 2-3 недели ( Побочные эффекты, их выраженность и обратимость).
2. Оценить влияние вакцины на состояние специфического противоопухолевого иммунитета (реакции гиперчувствительности замедленного типа, цитотоксическая активность лимфоцитов).
3. Оценить противоопухолевую активность вакцины по стандартным клиническим критериям (полная, частичная ремиссия, стабилизация и процесса, прогрессирование процесса).
Введение:
Использование результатов фундаментальных исследований в генетике рака в целях разработки новых способов терапии злокачественных новообразований,- одно из интереснейших и многообещающих направлений научных исследований. Более того, результаты таких исследований уже сейчас все настойчивее пробивают дорогу в онкологическую клинику.
Сотрудниками института биологии гена РАН (Kiselev et al, J. Biol. Chem., 1998) обнаружен новый ген, обозначенный термином Tag7. Проведенные исследования показали, что экспрессия гена характерна для клеток иммунной системы и белковый продукт гена вовлечен в систему врожденного иммунитета организма. Было показано, что в подавляющем большинстве трансформированных клеточных линий, опухолевых клеток как лабораторных животных, так и человека, Тад7 вообще не экспрессируется.
При исследовании влияния экспрессии гена Тад7 на рост опухолей показано, что экспрессия гена опухолевыми клетками, которые его в норме не экспрессируют резкое тормозит развитие опухоли после трансплантации модифицированных клеток животным. Более того, формируется иммунный ответ, который тормозит развитие повторно привитой не модифицированной опухоли в отдаленное место (Georgiev et al, Gene Therapy and Мої. Biology).