Содержание к диссертации
Введение
2. Апатит-(СаР)-органические композиты - основа твердых тканей современных и ископаемых организмов (обзор литературы) . 10
2.1. Изоморфные замещения в кристаллической структуре карбонатсодержащего ап атита- (С aF). 10
2.2. Морфология, иерархическая структура и механизмы образования апатит- (СаР)-органических композитов . 21
2.2.1 Современные представления о структуре вещества твердых тканей живых организмов. 21
2.2.2. Вещество фоссилизованлых твердых тканей элементов ротового аппарата коиодонтов. 29
2.2.3. Биомиметические апатит-(CaF)-желатиновые нанокомпозиты — модельная система для изучения биоминерализации in vitro. 56
3. Использованные методы и подходы. 68
3.1. Объекты исследования. 68
3.2. Биомиметический синтез апатит-(СаР)-желатиновых композитов (аналогов вещества биологических твердых тканей). 70
3.3. Методы и подходы, использованные при изучении природных и синтетических апатито-органических композитов. 72
3.3.1. Определение элементного состава. 74
3.3.2 Рентгенография. 75
3.3.3 Колебательная спектроскопия. 77
3.3.4. Световая микроскопия. 78
3.3.5. Электрономикроскопические методы. 79
3.3.6. Растворение агрегатов и определение особенностей распределения органической составляющей. 84
3.3.7. Статистическая обработка экспериментальных данных 85
4. Вещество твердых тканей S-элементов конодонтов рода Polygnathus . 87
4.1. Морфология и нанокомпозитная структура 87
4.2. Элементный и фазовый состав. Изоморфизм апатита . 114
5. Вещество биомиметических карбонатсодержащих апатит- (СаР)-желатиновых композитов . 129
5.1. Элементный и фазовый состав. 129
5.2. Изоморфные замещения в карбонатсодержащем апатите-(СаР). 136
6. Морфогенезис биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых композитов . 145
6.1. Начальная стадия (до формирования гексагонально-призматических «зародышей»). 145
6.2. Влияние карбонат-иона на морфогенетические особенности биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых композитов. 156
7. Сравнение синтезированных композитов с веществом биологических твердых тканей . 177
8. Заключение. 181
9. Список литературы. 183
- Морфология, иерархическая структура и механизмы образования апатит- (СаР)-органических композитов
- Биомиметический синтез апатит-(СаР)-желатиновых композитов (аналогов вещества биологических твердых тканей).
- Методы и подходы, использованные при изучении природных и синтетических апатито-органических композитов.
- Элементный и фазовый состав. Изоморфизм апатита
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение особенностей строения и образования вещества биологических твердых тканей имеет фундаментальное значение для выяснения механизмов коэволюции минеральной и органической материи, приведших к формированию биосферы, которая стала мощным фактором, влияющим на геохимические процессы в литосфере, гидросфере и атмосфере (Вернадский, 1926, 1935; Самойлов, 1929; Лапо, 1987; Юшкин, 1988, 1993,2002 и др.). Исследования в этой области открывают новые возможности для решения широкого круга геологических задач, связанных с разработкой методов биостратиграфического картирования, поиском и оценкой перспективности месторождений полезных ископаемых. Кроме того, результаты этих исследований широко применяются при создании современных биосовместимых материалов медицинского назначения.
Образующиеся в живых организмах физиогенные органо-минеральные композиты (кости, зубы, иголки, скорлупа яиц, экзоскелеты моллюсков и др.) характеризуются особой иерархической самоорганизующейся структурой (Кораго, 1992; Landis et al, 1996; Glimcher, 2006). Согласно современным представлениям, вещество твердых тканей ряда живых организмов (морских ежей, моллюсков, кораллов, фораминифер и др.) представляет собой особый тип наноструктурированных материалов, называемых мезокристаллами (Coelfen, Antonietti, 2008; Zhou, Brien, 2008). Основным минеральным компонентом твердых тканей костей и зубов человека и многих живых организмов является нестехиометрический по составу карбонатсо держащий апатит-(СаОН), который, в процессе фоссилизации превращается в карбонатсо держащий anaTHT-(CaF) (Elliott, 1994, 2002; Frank-Kamenetskaya, 2008 и др.). В ряде случаев карбонатсодержащий anaTHT-(CaF) может составлять основу твердых тканей живых организмов, примером этого является эмалеподобная ткань зубов акулы и рыбы-кабана.
Вещество биологических твердых тканей, в том числе кристаллохимические особенности апатита биогенного происхождения, исследованы недостаточно. Известно, что особенности зарождения и роста апатита в биологических системах контролируются не только значениями температуры, давления и рН среды, но и спецификой присутствующего органического вещества, которое существенно влияет и на структуру агрегата в целом. Механизм этого сложного биокосного взаимодействия, а также всего процесса биоминерализации, в настоящее время являются дискуссионным. Предложено несколько феноменологических моделей формирования твердых тканей живых организмов (Кораго, 1992; Landis et al, 1996; Gross, Berndt, 2002; Glimcher, 2006), которые, однако, не вполне объясняют ключевые закономерности этого сложного процесса. В последние годы существенный прогресс в изучении механизмов биоминерализации достигнут при моделировании образования апатито-
органических агрегатов в условиях, имитирующих биологический процесс при биомиметическом синтезе (Kniep, Busch, 1996; Kniep, Simon, 2006, 2008). Проведение новых исследований в данной области имеет как научное, так и практическое значение.
Цель и задачи исследований.
Цель работы - изучение кристаллохимии и морфогенезиса вещества биологических твердых тканей на основе апатита.
Основные задачи.
1. Изучение морфологии, нанокомпозитной структуры и состава
вещества фоссилизованных твердых тканей элементов ротового аппарата
конодонтов.
Синтез биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых композитов -аналогов вещества биологических твердых тканей.
Изучение морфогенезиса апатит-(СаР)- желатиновых композитов.
4. Выявление влияния карбонат-иона на морфогенетические
особенности, нанокомпозитную структуру и изоморфизм апатита
синтезированных композитов.
Научная новизна. Изучена кристаллохимия и морфогенезис
природных и биомиметических апатит-(СаР)-органических композитов.
Впервые показано, что вещество альбидной и гиалиновой тканей элементов
ротового аппарата конодонтов представляет собой полностью или частично
наноструктурированный материал (мезокристалл). Методом
монокристального рештеноструктурного анализа проведено уточнение кристаллической структуры апатита биогенного происхождения (альбидной ткани зубца конодонтового элемента). Синтезированы карбонатсодержащие апатит-(СаР)-желатиновые композиты, являющиеся аналогами вещества ряда биологических твердых тканей. Экспериментально изучена начальная стадия образования апатит-(СаР)-желатиновых нанокомпозитов. Выявлено, что присутствие карбонат-иона в среде кристаллизации существенно влияет на морфологию и внутреннее строение апатит-(СаР)-желатиновых нанокомпозитов. Показано, что вхождение карбонат-иона в структуру апатита-(СаР) приводит к образованию трех серий твердых растворов, различающихся по нестехиометрии и природе ее возникновения.
Практическое значение. Новые данные о структуре и составе вещества твердых тканей конодонтов можно использовать для уточнения классификации твердых тканей конодонтовых элементов, реконструкции процесса их образования и роста, а также таксономической принадлежности этих организмов. Результаты биомиметического синтеза аналогов вещества биологических твердых тканей имеют важное значение для создания биосовместимых материалов медицинского назначения. Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах «Кристаллическое вещество в живых организмах» и «Биоминералогия и органическая минералогия» (пилотный проект «Молекулярная геохимия и
биогеохимия») для студентов геологического факультета СПбГУ, а также в курсе «Основы биологической минералогии» для студентов кафедры геологии и геоэкологии географического факультета РГПУ им. А.И.Герцена.
Объекты и методы исследования. Фактическую основу диссертации составляют результаты изучения состава, строения и морфологических особенностей вещества природных и синтетических апатито-органических композитов. Было исследовано вещество твердых тканей S-элементов ротового аппарата конодонтов рода Polygnathus (отряда Ozarkodinida) из девонских отложений в районе озера Ильмень (Новгородская область), характеризующееся хорошей сохранностью твердых тканей. Образцы были получены от к.г.-м.н. А.В. Журавлева (ВНИГРИ, Санкт-Петербург). Кроме того, методом встречной диффузии в желатиновом геле были синтезированы биомиметические апатит-(СаР)-желатиновые композиты. Кристаллизацию осуществляли в U-образной трубке-ячейке, в колена которой помещали растворы реагентов, разделенные цилиндрической колонкой из желатинового геля (концентрация желатина 10 мас.%). Колена ячейки заполняли растворами СаС12 (0.1333 М) и Na2HP04, Na2C03, NaF. Исходное соотношение молярных концентраций СаС12: Na2HP04: Na2C03:NaF = 5:5:х:1, значения х варьировали в диапазоне от 0 до 9 (шаг 0.5, 1). В качестве буфера для исходных растворов использовали трис-(гидроксиметил)-метиламин; рН , используя 2 М раствор НС1, доводили до значения 7.40(2), которое близко к таковому в плазме крови человека. Начальное значение рН желатинового геля составляло 3.0(2). Синтез проводили в течение 3-21 суток при температуре 25 С. В ходе эксперимента в желатиновом геле наблюдалось образование пространственно разделенных областей (колец Лизеганга С, М, Р) в которых образование продуктов реакции происходило наиболее интенсивно. Детальное изучение вещества природных и синтетических апатито-органических композитов было проведено методами порошковой и монокристальной рентгенографии, ИК- и КР-спектроскопии, различными методами химического анализа (атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно-связанной плазмой, потенциометрия; метод сожжения, комбинированный с горячей газовой экстракцией; энергодисперсионный рештеноспектральный микроанализ (ЭДС)), а также гистохимическим методом. Для определения содержания карбонат-ионов и желатина в синтетических биомиметических композитах впервые была использована методика, основанная на расчете их концентраций по данным о соотношении и содержании углерода и азота в чистом желатине и в исследуемом образце. Для однозначного определения присутствия в апатите композита гидрофосфат-иона и позиции карбонат-иона была разработана методика, основанная на совместном использовании ИК- и КР-спектров; получены зависимости для оценки количества карбонат-иона. Изучение морфологии и иерархической структуры природных и
синтетических композитов проводили с привлечением широкого спектра различных методов сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (СЭМ, ПЭМ). При детальном исследовании структуры агрегатов на нанометровом уровне применяли методы высокоразрешающей ПЭМ (ВР-ПЭМ) и электронной дифракции (ЭД). Приготовление ультратонких срезов для ПЭМ исследований осуществляли ультрамикротомическим методом и методом ионного травления с использованием фокусированного ионного пучка. При изучении электрических свойств частиц синтетических композитов, а также для определения их толщины привлекали метод электронной голографии. При обработке экспериментальных данных использовали статистические методы (метод анализа главных компонент, кластерный и регрессионный анализы).
Защищаемые положения.
1 .Нанокомпозитная структура вещества исследованных твердых тканей конодонтовых элементов различается по степени разориентировки кристаллитов карбонатсодержащего апатита В-типа, содержанию органической компоненты и микроэлементов, а также размеру и распределению пор. Вещество альбидной и гиалиновой ткани представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал (мезо кристалл).
2. Формирование биомиметических апатит-(СаР)-желатиновых
нанокомпозитов начинается с образования мозаичной структуры из
нанопластинок апатита вдоль макромолекул желатина, проходит стадию
образования упорядоченных гексагонально-призматических композитных
частиц (мезокристаллов), сопровождающуюся формированием
сверхструктуры нанокомпозита и его внутреннего электрического поля, и заканчивается образованием сферолитов (путем расщепления частиц через серию гантелеобразных форм).
З.С увеличением концентрации карбонат-ионов в среде кристаллизации их содержание в апатите растет (за счет замещения фосфат-ионов), что приводит к увеличению числа вакансий в позициях кальция и фтора. Параллельно разориентировка кристаллитов апатита увеличивается, их размеры уменьшаются, призматические грани мезокристаллов замещаются округлыми поверхностями, характер расщепления частиц изменяется.
4. Синтезированные апатит-(СаР)-желатиновые агрегаты по нанокомпозитной структуре, содержанию белковой компоненты и особенностям изоморфизма апатита являются аналогами вещества твердых тканей ряда современных и ископаемых организмов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях: «Федоровские сессии» (Санкт-Петербург, 2006, 2008), «The 11th European Conference on Solid State Chemistry» (Кан, Франция, 2007),
«CRTD Summer Conference on Regenerative Medicine» (Дрезден, Германия, 2007), «3nd Bilateral Workshop MPI CPfS and Кос University» (Стамбул, Турция, 2008), «Минералогические музеи» (Санкт-Петербург, 2008), «БЮМІНЕРАЛОГГЯ - 2008» (Луцк, Украина, 2008), «III Российское совещание по органической минералогии» (Сыктывкар, 2009). По теме диссертации по приглашению проф. В. Депмайера в 2008 г была прочитана лекция в Университете им. Христиана Альбрехта (Киль, Германия).
По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 7 статей (из них 6 в журналах, входящих в список ВАК).
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант №06-05- 65165) и Германского исследовательского фонда (DFG-Biomineralisation: KN 150/14-1 и BR 306/34-1). Отдельные разделы работы отмечены дипломами Российского минералогического общества: диплом победителя конкурса докладов молодых ученых России на международной конференции «Федоровская сессия» (октябрь, 2008); диплом первой степени в конкурсе научных работ молодых ученых России (октябрь, 2009).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка литературы. Общий объем диссертации 209 страниц, включая 105 рисунков, 17 таблиц и библиографию из 371 наименований.
Морфология, иерархическая структура и механизмы образования апатит- (СаР)-органических композитов
Эволюционируя в течение миллионов лет, живые организмы совершенствовали и оптимизировали создание биологических функциональных природных материалов. Помимо того, что эти материалы обладают рядом уникальных физико-химических свойств, их формирование протекает в достаточно мягких условиях, а именно при низких значениях температуры и давления (являющихся физиологически нормальными для организма) (Кораго, 1992; Elliott, 1994, 2002; Mann, 2005; Pasphate..., 2002; Biomineralization..., 2003; Medical mieralogy..., 2006; Biomineralization Vol.1-2, 2007; Handbook of biomineralization, Vol. 1-3, 2007). Известно, что образующиеся в живых организмах биоминераллы могут составлять основу как вещества физиогенных твердых тканей (костей, зубов, раковин и т.д.), так и патогенных новообразований (почечные, зубные, слюнные камни и т.д.) (Кораго, 1992; Elliott, 1994, 2002; Pikhur et al., 2008 и др.). Однако, в этом разделе мы остановимся на описании только вещества некотрых физиогенных вердых ткане организмов. Образование твердых тканей в живых организмах является сложным многоступенчатым процессом, важную роль в котором играют специфические клетки (например, в костной ткани остеобласты, остеокласты и др.), которые контролируют формирование и резорбцию твердых тканей (Handbook of biomineralization, Vol. 1-3, 2007). Экспериментальные данные показывают, что образующиеся в живых организмах физиогенные твердые ткани (кости, зубы, иголки, скорлупа яиц, экзоскелеты моллюсков и др.) характеризуются особой иерархической самоорганизующейся структурой (Кораго, 1992; Landis et al., 1996; Glimcher, 2006) и являются наноструктурированными органо-минеральными композитами. Согласно современным представлениям, вещество твердых тканей ряда живых организмов (морских ежей, моллюсков, кораллов, фораминифер и др.) представляет собой особый тип наноструктурированных материалов, называемых мезокристаллами (Coelfen, Antonietti, 2008; Zhou, Brien, 2008). «Мезокристаллы» представляют собой упорядоченные системы (коллоидные кристаллы), которые состоят из наноблоков (кристаллитов), имеющих определенную кристаллографическую ориентацию.
Часто мезокристаллы проявляют дифракционные свойства, характерные для монокристаллов. Однако, их строение и некоторые физико-химические свойства существенно отличаются от таковых для классических монокристаллов. Мезокристаллы представляют собой метастабильные структуры, включающие в себя непрерывный набор переходных структур между монокристаллами и поликристаллическими агрегатами. Так, например, кальцитные иглы современных морских ежей состоят из пористого материала, проявляющего дифракционные свойства характерные для монокристалла (рис.2.4). Вещество костных и зубных тканей хордовых животных (в том числе и человека) представляют собой апатито-оранический композит и характеризуется особой иерархической структурой. Костная ткань в организме представлена в двух видах: компактная и губчатая. Отличительной особенностью структуры костной ткани является большое количество межклеточного вещества при сравнительно малом числе костных клеток. В межклеточном веществе преобладают неорганические соединения. В компактной кости т.н. органической матрице составляет около 20%, апатит - 70% и вода -10%. В губчатой кости преобладают органические компоненты ( 50%), на долю неорганических приходится 35-40%. Основным компонентом органической матрицы костей является фибриллярный белок - коллаген. В настоящее время установлено, что нуклеация и рост апатита происходят непосредственно на фибриллах коллагена, при этом наблюдается строго ориентированный эпитаксиальный рост нанокристаллов апатита вдоль волокон коллагена (рис. 2.5) (Landis et al., 1996; Glimcher, 2006). Таким образом, образование минеральной фазы твердых тканей - апатита, как правило, протекает под матричным контролем коллагена. Волокна коллагена состоят из различимых в электронном микроскопе фибрилл, которые построены из вытянутых в длину макромолекул тропоколлагена (состоящих из трех полипептидных цепей) длиной около 300 нм. В фибриллах тропоколлаген располагается рядами, последовательно смещенными на 67-68 нм относительно друг друга. Между концами макромолекул имеется промежуток длиной около 30 нм и диаметром около 1.5 нм ("hole zone", "gap region"), в котором по мнению некоторых исследователей начинается нуклеация и рост апатита при формировании кости (Landis et al., 1996; Glimcher, 2006; Страйер, 1984). В ряде работ имеются данные о наличии вдоль коллагеновых фибрилл чередующихся зон различной степени минераллизации с периодом 60-70 нм (Weiner, Wagner, 1998). По данным многих исследователей более половины минеральной фазы костной ткани находится в промежутках между макромолекулами тропоколлагена, при том, что значительная часть нанокристаллов апатита локализована на поверхности фибрилл (Landis, 1995; Landis et al., 1996; Glimcher, 2006). Нанокристаллы апатита-(СаОН) присутствуют в кости в форме пластин с размерами 50x20x5 нм. Таким образом, минерализованные нанокристаллами апатита фибриллы коллагена составляют первый структурный иерархический уровень костной ткани. Всего выделяют до семи уровней организации (архитектуры) костной ткани (рис. 2.6). Основной элемент конструкции костной ткани образуется благодаря соединению фибрилл в пластинки или цилиндрические оболочки, которые носят общее название - ламеллы. В каждой ламелле коллагеновые волокна параллельны друг другу. В компактной, или кортикальной, кости (стенки средних участков -диафизов - длинных трубчатых костей) ламеллы образуют такие типичные конструкции, как остеоны (гаверсовы системы), вставочные (интерстициальные), внешние и внутренние ламеллярные пластинки. Остеон считается самой высшей структурной единицей костной ткани и представляет собой конструкцию из 5-20 концентрически расположенных ламелл с разными направлениями и углами навивки. Коллагеновые фибриллы могут иметь различную ориентацию в остеонах и ламелярных пластинках, хотя преимущественно вытянуты вдоль длинной оси кости. Таким же образом преимущественно ориентированы с осью с и нанокристаллы апатита, что подтверждается данным рентгенографических и электронномикроскопических исследований минерализованных фибрилл коллагена.
Биомиметический синтез апатит-(СаР)-желатиновых композитов (аналогов вещества биологических твердых тканей).
Синтез в условиях имитирующих биологическую минерализация (биомиметический синетез) апатит-(СаР)-желатиновых композитов проводили в гелевой среде методом встречной диффузии по ранее разработанной методике, подробно описанной в (Kniep, Busch, 1996; Kniep, Simon, 2006; Rosseeva et al., 2008, Россеева и др., 2009) в условиях имитирующих биологическую минерализацию в живых организмах. Кристаллизацию осуществляли в U-образной трубке-ячейке, в колена которой помещали растворы реагентов, разделенные цилиндрической мембранной из желатинового геля (pig-skin gelatine, 300 bloom, Aldrich; концентрация в гелеЮ мас.-%, гель готовили при Т=60С). Длина желатиновой колонки составляла 5 см, а объем 120 см3. Колена ячейки заполняли растворами СаСЬ (0.1333 М, объем 250 мл) и NaaHPO , Na2C03, NaF, соответственно. Исходное соотношение молярных концентраций СаСЬ: Na2HP04." Na2CC 3:NaF = 5:5:.т:1, х варьировали в диапазоне от 0 до 9 (шаг 0.5, 1). Растворы исходных реагентов готовились с добавлением консервирующих реагентов н-пропил-4- гидроксибензоата, сорбиновой кислоты и бензойной кислоты с концентрацией 0.167 г/л, для предотвращения размножения в желатиновом геле бактерий и других микроорганизмов во время проведения кристаллизации. Концентрации исходных компонентов были подобраны эмпирически таким образом, чтобы продукты синтеза представляли собой апатито-желатиновые композиты (без примеси флюорита и других фаз). В качестве буфера для растворов использовали трис-(гидроксиметил)-метиламин (концентрация 29 г/л), рН доводили до значения 7.40(2)(близко к таковому в плазме крови человека) используя 2 М НС1. Начальное значение рН желатинового геля составляла 3.0(2) (для предотвращения образования на начальной стадии Саг, а также замедления процесса кристаллизации). По истечении нескольких дней рН геля повышалась до 6-7. Синтез проводили в течение 21 дня при температуре 25 С.
После завершения эксперимента желатиновый гель, в котором наблюдались пространственно разделенные области (кольца Лизеганга С, М, Р, рис.3.3), разрезали на сегменты, соответствующие этим областям, в которых кристаллизация продуктов реакции происходило наиболее интенсивно. Потом их промывали в дистиллированной воде при температуре 40С и центрифугировали для отделения несвязанного (не вошедшего в состав композитов) желатина. Процедуру промывки повторяли 5-6 раз. Полученные порошковые образцы сушили в течение 24 часов при температуре 40С и затем исследовали комплексом методов. Морфология кристаллических агрегатов в разных кольцах Лизеганга различается и зависит от положения кольца реакционном пространстве (желатиновой колонке) Нами были исследованы продукты полученные во всех кольцах, однако наиболее детально исследовались продукты синтеза из М-колец, так как количество материала полученного из С и Р-колец оказалось не достаточно для проведения детального анализа, Детальное изучение и характеристика структуры агрегатов на начальных стадиях роста являются важным для понимания принципов их строения и организации, а также механизма морфогенезиса в целом. С целью экспериментального обнаружения ранней стадии формирования композитов нами был приготовлен ультратонкий срез, приготовленный ультрамикротомическим способом высушенного замораживанием (freeze dry) желатинового геля в области непосредственно перед кольцом Лизиганга, где следовало ожидать присутствие агрегатов на ранней стадии морфогенезиса. Для получения более яркого контраста при ПЭМ исследовании образцов, приготовленные ультратонкие срезы были обработаны раствором уранил ацетата. Для исследования апатит-(СаР)-желатиновых агрегатов на ранней стадии образования. Синтез осуществляли в течение 3-6 дней. Для выделения продуктов синтеза после проведения первого этапа центрифугирования (как было описано выше), отделенный желатиновый раствор (элюат), содержащий мелкие частицы синтезированных композитов, заливали 20% раствором Н2О2 (соотношение 2:1) и оставляли на 2-3 суток. После практически полного окисления желатина (не вошедшего в состав композитов) раствор промывали в дистиллированной воде при температуре 40С и центрифугировали. Процедуру промывки повторяли 3-4 раз. Полученные порошковые образцы сушили в течение 24 часов при температуре 40С и затем исследовали. Детальное изучение состава, строения и морфологических особенностей природных и синтетических твердых тканей (апатито-органических композитов) с привлечением широкого комплекса современных инструментальных методов (электронная микроскопия, рентгенография, колебательная спектроскопия, различные методы химического анализа и др.), позволяющих изучать, как апатит, так и органическую составляющую агрегатов. Изучение изоморфных замещений в природных и синтетических композитах проводили с использованием монокристальных и порошковых рентгендифракционныйх методов, привлекая ИК- и КР-спектроскопию, данные химических анализов и методы статистической обработки. Уточнение кристаллохимической формулы апатита альбидной ткани конодонтового элемента проводили на основании заселенностей кристаллографических позиций, полученных в результате монокристального структурного исследования. Особенности замещений в структуре синтезированного апатита выявляли на основании данных по его химическому составу с учетом известных закономерностей влияния изоморфных компонентов на параметры элементарной ячейки (LeGeros, 1967; Shannon, 1976; LeGeros, Bonel, Legros, 1978; LeGeros et al., 1969; LeGeros, 1967, 1981; Elliot, 1994, 2002; Кольцов и др., 2000; Vignoles, 1988; Wilson et al., 1999, 2004, 2005, 2006; De Maeyer, Verbeeck, Naessens, 1993, 1994; Pieters, De Maeyer, Verbeeck, 1996, 1998; Frank-Kamenetskaya, 2008). При расчете кристаллохимической формулы биомиметического карбонатсодержащего апатита В-типа в соответствии с результатами структурных исследований (Elliott, 1994, 2002; Fleet, Liu, 2008 и др.) предполагали, что вакансии в позиции фосфора отсутствуют, т.е. что суммарное количество атомов фосфора и углерода в элементарной ячейке равно 6. Количество групп [НРСч]2" рассчитывали по балансу зарядов. При расчете формул апатита образцов с избытком анионов F" (относительно стехиометрического состава апатита-(СаР)) предполагали, что число анионов фтора в элементарной ячейке равняется двум. При этом считали, что избыток F" ионов возникает за счет присутствия следовых количеств флюорита, не фиксируемых по данным рентгенофазового анализа (РФА). Для выявления связей между содержанием изоморфных компонентов, а также между реальным составом апатита и параметрами элементарной ячейки использовали различные статистические методы (анализ главных компонент (АГК), регрессионный анализ).
Методы и подходы, использованные при изучении природных и синтетических апатито-органических композитов.
При расчете формул апатита образцов с избытком анионов F" (относительно стехиометрического состава апатита-(СаР)) предполагали, что число анионов фтора в элементарной ячейке равняется двум. При этом считали, что избыток F" ионов возникает за счет присутствия следовых количеств флюорита, не фиксируемых по данным рентгенофазового анализа (РФА). Для выявления связей между содержанием изоморфных компонентов, а также между реальным составом апатита и параметрами элементарной ячейки использовали различные статистические методы (анализ главных компонент (АГК), регрессионный анализ). Поскольку размеры исследованных нами природных и синтетических образцов, а также их структурных элементов очень малы (от нескольких мм до нескольких нм, соответвенно), детальное изучение их морфологических особенностей и строения проводили с использованием современных методов электронной микроскопии. Изучение морфологии образцов и иерархической структуры вещества композитов от микрометрового до нанометрового уровня проводили с применением световой и электронной микроскопии, используя различные способы пробоподготовки образцов.
Сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) использовали при изучении морфологических особенностей образцов, в том числе рельефа их поверхности, а также их внутренней структуры на микрометровом уровне (ориентация микроблоков, слоистость, наличие и распределение пор и т.д.). Просвечивающую электронную микроскопию (ПЭМ) в том числе высокого разрешения (ВРПЭМ) в сочетании с электронной дифракцией и электронной голографией применяли для изучения внутренней структуры на нанометровом уровне (размеры и ориентация кристаллитов, распределение пор, и минерализованных фибрилл органического вещества и т.д.) и выявления внутреннего электрического поля. На основании полученных результатов делали выводы о механизмах образования и роста апатито-органических агрегатов. Для того чтобы получить наиболее объективную информацию о процессе образования таких сложных систем, как синтезированные биомиметические апатит-(СаР)-желатиновыс нанокомпозиты, нами был использован дуалистических подход, основанный на сочетании принципов как «классических» (Петров и др., 1967, 1983; Краснова, Петров, 1997; Пунин, Штукенберг, 2008 и др.), так, и «неклассических» (Coelfen, Antonietti, 2008; Zhou, Brien, 2008; Kniep, Simon, 2007) механизмов кристаллизации. 3.3.1. Определение элементного состава
Энергодисперсионный рентгеноспектральний микроанализ (ЭДС) использовали для определения элементного состава (Са, Р, F, Na, Mg, Sr, Si, S, CI) различных твердых тканей конодонтовых элементов, а также частиц синтезированных апатит-(СаР)-желатиновых композитов (на начальной стадии морфогенезиса). ЭДС проводили на сканирующем электронном микроскопе ESEM FEI Quanta 200 FEGi (FEI company, Eindhoven, NL), оборудованного системой "Genesis 2000" (EDAX, AMETEK, Wiesbaden, Germany), в условиях высокого вакуума при ускоряющем напряжении 25 kV. Перед анализом образцы напыляли золотом в течение 30-60 секунд для увеличения электропроводности поверхности. Диаметр зонда составлял 0.5-10 мкм. Всего было детально изучено два образца конодонтовых элементов. При проведении ЭДС анализа твердые ткани анализировали в трех областях элемента: 1 - на зубцах (альбидная ткань), 2 - в верхней части стержня между зубцами (гиалиновая ткань и переходная область между альбидной и гиалиновой тканями), 3 - в нижней части стрежней в области близкой к базальной полости (гиалиновая). Схема расположения точек в которых проводился ЭДС анализ представлена на рис. 4.34. Как было показано ранее (Россеева и др., 2009, см. раздел 5) компенсация дисбаланса заряда, возникающая при вхождении в структуру anaraTa-(CaF) карбонат иона (при низких концентрациях) осуществляется в основном по схеме с участием одновалентного катиона щелочного металла. По данным ЭДС анализа в состав апатита твердых тканей конодонтов также входит SO4 ". При расчете концентрации карбонат иона в апатите-(СаР) твердых тканей конодонтовых элементов предполагалось, что компенсация дисбаланса зарядов при вхождении в структуру апатита-(СаР) ионов S042" и СОз2 происходит по схеме 10 с участием ионов Na+. Результаты расчета показали, что содержание карбонат-иона в твердых тканях варьирует от 0.1 до 2.3 мас.%, что согласуется с результатами КР-спектроскопии и РСА . Элементный состав синтезированных биомиметических композитов исследовали методами атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой, потенциометрии, а также методом сожжения, комбинированного с горячей газовой экстракцией. Пред проведением анализа синтезированных апатит-(СаР)-желатиновых композитов, образцы тщательно растирали для приготовления однородного порошка и затем промывали три раза в дистиллированной воде при температуре 40С (для отделения адсорбированного на частицах желатина, не вошедшего в состав композитов), центрифугировали и сушили при температуре 40С. Количественное определение содержания в апатит-(СаР)-желатиновых композитов кальция, фосфора и натрия проводили методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (АЭС ИСП, Inductively Coupled Plasma - Optical Emission Spectrometry, ICP-OES) (Varian Vista RL спектрометр). Для этого 10 мг порошкового образца растворяли в 4 мл 2 М раствора НС1, после чего бидистиллированной водой доводили объем раствора до 100 мл и проводили анализ. Для каждого образца готовили три раствора. Среднее значение концентрации элементов определяли по результатам трех измерений. Содержание фторид-ионов определяли в тех же расторах потенциометрическим методом с использованием F-ион-селективного электрода (Mettler Toledo Inc., Wilmington, MA, USA). Повторность опыта - трехкратная. Содержание углерода и азота в образцах определяли методом сожжения комбинированного с горячей газовой экстракцией на CHNS-анализаторе 932 (LECO, USA). Для этого 2 мг образца сжигали в оловянных тиглях в Ог атмосфере. Для определения содержание карбонат-ионов и желатина в синтетических биомиметических композитах впервые была использована методика основанная, на расчете их концентраций по данным о соотношении и содержании углерода и азота в чистом желатине и в исследуемом образце. По результатам анализа содержание С и N в чистом желатине составляет 17.0(1) и 45.3(1) мас.%, соответственно. Содержание желатина в синтезированных агрегатах рассчитывали по количеству азота [N], следующем образом: [Желатин](мас.%)=[Ы]»5.88. Содержание карбонат-иона (С.,_2.) определяли из разницы общего количества углерода [С] в образце и углерода, содержащегося в желатиновой компоненте. При этом, расчет производили следующим образом: Са;2. (мас.%)= 5-([С] -[N] -2.67) (Rosseeva et.al., 2008).
Элементный и фазовый состав. Изоморфизм апатита
Результаты рентгено- и электронографии, дополненные данными элементного анализа и колебательной спектроскопии показали, что минеральная компонента всех тканей исследованных конодонтовых элементов конодонтов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) представлена карбонатсодержащим апатитом-(СаР).
Результаты гистохимических исследований конодонтовых элементов, протравленных в присутствии Coomassie Blue (0.005%), указывают на то, что после растворения минерального вещества, органический остаток гиалиновой ткани содержит вещества белковой природы или продукты их разложения (синее окрашивание) (рис.4.31). Ядра зубцов, состоящие из альбидной ткани, после растворения минеральной компоненты не дают специфической реакции на белковые соединения, что может быть обусловлено их малым количеством, или присутствием органического вещества небелковой природы.
В целом, результаты проведенных нами гистохимических исследований тканей элементов конодонтов рода Polygnathus аналогичны данным, полученным для конодонтов других родов (Kemp, Nicoll, 1997; Donoghue, 1998; Kemp,2002). Несомненно, такие исследования дают только общие представления о природе органического вещества и характере его распределения в твердых тканях конодонтового элемента. Для определения более точного состава органической матрицы элементов необходимо проводить дополнительные исследования (например ВЭЖХ, электрофорез и т.д.). Таким образом, наличие в исследованных нами конодонтовых элементах матрицы из органического вещества белковой природы, а также минеральной - апатита-(СаР) позволяет рассматривать их твердую ткань как апатит-(СаР)-органический композит.
На КР-спектрах, полученных от различных областей (тканей) среза конодонтового элемента (рис.4.32), присутствуют характеристические полосы пропускания, соответствующие валентным и деформационным колебаниям связей [РО4]3", [СОз]2" ионов, а также фрагментов органических молекул. Колебаниям связей [РС 4]3"-ионов на КР-спектрах в выделенном диапазоне соответствуют полосы поглощения 964 CM" (VI); И 1030 см"1 -1080 СМ" (УЗ). На спектрах также присутствует слабая полоса, соответствующая колебаниям связей карбонат-иона В-типа при 1072 см"1 (рис.4.32б). Отсутствие на КР-спектрах полосы 1107 cm", являющейся характеристической для карбонат-иона А-типа, исключает присутствие карбонат ионов в каналах структуры апатита-(СаР) твердых тканей конодонтового элемента. Дополнительно на КР-спектрах присутствуют много широких полос, отвечающих вероятно колебаниям различных фрагментов органической составляющей тканей (или внешним загрязнениям). Так, в области около 1000 см"1 могут быть полосы соответствующие колебаниям связей в С-Н, C-Ph, а также НРО4 " (в апатите). Другие широкие полосы, не относящиеся к колебаниям связей в апатите, могут быть идентифицированы следующим образом 1055 см 1 - С-С, 1090 см"1 С-С, -NH2, 1190 см"1 - C-Ph, NC2 (амин), 1280 см"1 - амид III, С-ОН, 1384 см"1 - СОг", 1480 см 1 -0. По результатам профильного анализа КР-спектров в диапазоне 900 - 1125 см"1 было установлено, что величина полуширины пиков на спектрах, соответствующих колебаниям связей [РО4] " иона, закономерно увеличиваются при последовательном переходе от тканей в области зубца (альбидная ткань -точка 1 FWHM - 8.24 см"1) к основанию зубца (альбидно-гиалиновая ткань - точка 2 FWHM =8.5 см"1) и затем к стержневой области (гиалиновая ткань - точка 3 FWHM = 8.9 см"1) элемента (рис.4.326). С учетом данных электронной микроскопии (раздел 4.1) наблюдаемая закономерность обусловлена, главным образом, уменьшением размеров кристаллитов апатита и увеличением их разороинетировки. Дополнительно, следует отметить, что в этом же направлении на КР-спектрах происходит увеличение относительной интенсивности полосы, соответствующей колебаниям связей карбонат-иона В-типа при 1072 см"1, что говорит о незначительном увеличении его содержании. Сопоставляя интенсивности данной полосы на КР-спектрах твердых тканей конодонтовых элементов и синтезированных нами карбонатсодержащих апатит-(СаР)-желатиновых композитов (рис.5н, раздел 5), можно сделать вывод, что содержание карбонат иона в апатите-(СаР) всех твердых тканей исследованных нами конодонтовых элементов не превышает 2 мас.%. Наиболее детально нами был изучен апатит альбидной ткани зубца конодонтового элемента, который по данным ЭД и ВРПЭМ исследований ультратонких срезов (см. раздел 4.1) представляет собой особый тип мезокристаллических материалов -«пористый монокристалл». Полученные методом монокристалла значения параметров элементарной ячейки двух образцов (а = 9.374(2), 9.376(2); с= 6.882(2) , 6.892(1) А) очень близки между собой и к значениям, характерным для стехиометрического апатита-(СаР) (а = 9.367(1), с = 6.884 (1) A, Sudarsanan et al, 1972).
Таким образом, незначительное, но достоверное увеличение параметра а исследованного апатита относительно стехиометрического (на 0.007, 0.009 А, что составляет 4а) можно объяснить частичным замещением ионов кальция на более крупные ионы стронция (гса=100 A, rsr=118 A, Shannon, 1976). Нельзя также исключить аналогичное влияние замены части анионов фтора на гидроксильные группы или молекулы воды, о возможности такого замещения указывает выявленный по результатам ЭДС незначительный дефицит фтора (менее 3.8 мас.%, что соответствует 2 атомам на эл.яч.). Параметр с достоверно увеличен, только для одного образца (на 0.008А, что составляет 4с). Отсутствие увеличения во втором образце можно объяснить противоположным влиянием на значение этого параметра вакансий в позиции кальция, величина которой по данным химического анализа этого образца, как показано выше составляет 0.4 на эл.яч. Результаты уточнения кристаллической структуры "монокристалла" апатита альбидной ткани зубца (рис. 4.33) методом РСА показали, что координаты атомов, межатомные расстояния и валентные углы в кристаллических структурах исследованного нами апатита-(СаР) альбидной ткани и стехиометрического апатита-(СаР) очень близки (пр. гр. Р63/т) (табл.4.1, 4.2).