Изоморфизм, условия образования и свойства биогенного апатита и ассоциирующих с ним ортофосфатов Николаев Антон Михайлович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Биогенные апатиты и ассоциирующие с ними ортофосфаты (обзор литературы) . 11

1.1. Фосфаты биогенного происхождения. Классификация, местонахождение в природе 11

1.2. Апатит: кристаллическая структура, изоморфизм и свойства

1.2.1. Кристаллическая структура 14

1.2.2. Ионные замещения 18

1.2.2.1.Общие представления 18

1.2.2.2 Изоморфные замещения и связанные с ними свойства Sr и РЗЭ-апатитов 20

1.2.2.3.Ионные замещения в апатитах, образующихся в живых организмах 24

1.3. Иерархическая структура, вещественный состав и механизмы образования костной ткани современных позвоночных 26

1.4. Патогенная биоминерализация 36

Глава 2. Подходы и методы, использованные в работе 39

2.1. Объекты исследования. Пробоподготовка 39

2.2. Синтез апатитов, допированных примесями 42

2.3. Модельные эксперименты

2.3.1. Биомиметический синтез фосфата кальция при низких температурах 44

2.3.2. Биомиметический синтез апатита плазмы крови человека 45

2.3.3.Биомиметический синтез фосфатов кальция и магния мочевых камней 46

2.4. Методы исследования 49

Глава 3. Минеральная компонента костной ткани ледяной рыбы и возможность психрофильной фосфатной биоминерализации 54

3.1. Результаты исследования минеральной компоненты костной ткани ледяной рыбы Champsocephalus gunnari 54

3.2. Результаты низкотемпературного биомиметического синтеза 58

3.3. Обсуждение полученных результатов 60

Глава 4. Апатит кальцификатов сердечных клапанов человека (кардиолитов) 64

4.1. Характеризация продуктов биомиметического синтеза 64

4.1.1. Результаты исследования 64

4.1.2 Обсуждение полученных результатов 66

4.2. Характеризация минеральной компоненты кардиолитов 68

4.2.1. Результаты исследования .68

4.2.2 Обсуждение полученных результатов 73

Глава 5. Образование фосфатов кальция и магния мочевых камней (по результатам модельных экспериментов) 76

5.1. Фазообразование в фосфатной системе 76

5.2. Результаты биомиметического синтеза фосфатов кальция и магния из растворов, моделирующих состав мочи человека по неорганическим компонентам 79

5.3. Результаты биомиметического синтеза фосфатов кальция и магния из растворов, моделирующих состав мочи человека по неорганическим компонентам, в присутствии белкового вещества и болезнетворных бактерий .82

5.4. Обсуждение полученных результатов 86

Глава 6. Влияние карбонат-иона в среде кристаллизации на образование и химический состав CaГАП–SrГАП твёрдых растворов 90

6.1. Характеризация синтезированного материала .90

6.2. Распределение стронция в системе «раствор-кристалл» 97

6.3. Ионные замещения и нестехиометрия синтетических CaHA-SrHA

твёрдых растворов .100

Глава 7. РЗЭ-содержащие гидроксилапатиты и их люминесцентные свойства . 103

7.1. Характеризация апатитов с примесями широкого ряда редкоземельных элементов (Lа, Ce, Pr, Nd , Eu, Gd, Dy, Ho, Er) .103

7.1.1 Результаты исследования 103

7.1.2 Обсуждение полученных результатов .107

7.2. Характеризация синтетических гидроксилапатитов с различным содержанием ионов Eu3+ и Се3 109

7.2.1. Результаты исследования Eu-содержащих апатитов 109

7.2.2. Результаты исследования Ce-содержащих апатитов 119

7.3. Обсуждение полученных результатов 124

Заключение .126

Список литературы

• Иерархическая структура, вещественный состав и механизмы образования костной ткани современных позвоночных
• Биомиметический синтез апатита плазмы крови человека
• Результаты низкотемпературного биомиметического синтеза
• Характеризация минеральной компоненты кардиолитов

Введение к работе

Актуальность исследования.

Академик А. Е. Ферсман (1934) назвал фосфор, который
играет исключительно важную роль в биогеохимических процессах,
связанных с жизнедеятельностью живых организмов, "элементом
жизни и мысли". В литосфере фосфор присутствует в виде солей
ортофосфорной кислоты (ортофосфатов), среди которых наиболее
распространен фосфат кальция апатит. Фторапатит является

полигенным минералом, образующимся как в глубинных, так и гипергенных (в том числе биогенных) геологических процессах. Он широко используется в народном хозяйстве в качестве сырья для производства фосфорных удобрений, фосфора и фосфорной кислоты, а также в черной и цветной металлургии, в производстве керамики и стекла. Гидроксилапатит (ГАП), которому посвящена настоящая работа, является основным минеральным компонентом костной и зубной тканей человека и других позвоночных (животных, рыб, птиц). Вместе с другими ортофосфатами кальция и магния (брушитом, струвитом, Mg-витлокитом и не имеющим минерального аналога октакальцийфосфатом) апатит очень распространен и в патогенных минеральных агрегатах, образующихся в живом организме (в почечных, слюнных, зубных и других камнях, а также в кальцификатах, образующихся на сердечных клапанах, в сосудах, мышцах, селезенке и др.).

Постоянно возрастающий интерес научной общественности к изучению биогенного апатита и ассоциирующих с ним фосфатов связан, в первую очередь, с тем, что их синтетические аналоги широко используются для создания инновационных материалов медицинского назначения (имплантов, биометок, скаффолдов, средств доставки лекарств и др.) (Баринов и Комлев 2005; Баринов 2010; Zhang 2013). Кроме того, изучение механизмов образования ортофосфатов в живом организме позволяет продвинуться в разработке новых подходов профилактики и лечения ряда социально значимых заболеваний, таких как мочекаменная болезнь, атеросклероз, остеопороз и др.

Известно, что изоморфные замещения оказывают

существенное влияние на свойства апатита (биосовместимость, антибактериальную активность, люминесценцию и др.) (Lin et. al. 2007, Iconaru et. al. 2013, Zhang 2013, Kaygili et. al. 2014). Закономерности этого явления исследованы недостаточно. В частности, практически отсутствуют данные по влиянию карбонат-иона, замещающего в биологическом гидроксилапатите фосфат-ион, на изоморфные замещения в позиции кальция.

В результате развития модельного подхода в изучении механизмов образования апатита и других минералов в живом организме в настоящее время наметился существенный прогресс (Simon et al. 2009, Xie et al. 2014, Golovanova et al. 2016). Однако многие вопросы биогенного минералообразования по-прежнему остаются нерешёнными. Не изучено влияние низких температур на образование костной ткани позвоночных. Практически не разработана теория бактериального образования патогенных агрегатов.

Цель исследования.

Получение новых знаний об изоморфизме, условиях

образования и свойствах биогенного апатита, а также ассоциирующих с ним ортофосфатов.

Основные задачи.

1. Изучить кристаллохимические особенности
минеральной компоненты костной ткани ледяной рыбы
Champsocephalus gunnari и, привлекая данные биомиметического
синтеза, сделать заключение о возможности фосфатной
биоминерализации при температуре вблизи 0 ^оС.

2. Изучить in vivo и in vitro кристаллохимические
особенности апатита кальцификатов сердечных клапанов человека
(кардиолитов) и выявить его отличия от других патогенных апатитов,
образующихся в организме человека. Осуществить биомиметический
синтез апатита кардиолитов.

3. Изучить в условиях биомиметического синтеза влияние
белкового вещества и болезнетворных бактерий на образование
фосфатов кальция и магния мочевых камней человека.

1. Изучить в условиях эксперимента влияние карбонат-иона в растворе на образование и кристаллохимические особенности CaГАП SrГАП твёрдых растворов.

2. Изучить в условиях эксперимента влияние вхождения примесей трехвалентных редкоземельных элементов на люминесценцию гидроксилапатита и предложить на этой основе способ получения наноразмерного высоколюминесцентного апатита.

Объекты и методы исследования.

Фактическую основу диссертации составляют результаты исследования физиогенных и патогенных апатит-органических агрегатов, образовавшихся в живом организме (костной ткани Ледяной рыбы Champsocephalus gunnari и кальцификатов сердечных клапанов человека), а также продуктов синтезов, в том числе биомиметических. Синтез REE³⁺ и Sr²⁺-содержащих гидрокслапатитов, перспективных для создания материалов медицинского назначения, был проведен

методом осаждения из водных растворов при температуре 90 ^оС, pH =
7 – 12. CaГАП–SrГАП твердые растворы были получены при наличии
карбонат-иона в среде кристаллизации (C/P = 0; 0.05; 0.1; pH = 10 –
12), REE³⁺-гидроксилапатиты (REE³⁺ = La, Ce, Pr, Nd, Eu, Gd, Dy, Ho,
Er) из ратворов с соотношением REE/Ca=0.05 и 0.10, pH= 6 — 8;
Eu³⁺- и Се³⁺-гидроксилапатиты — из растворов с соотношением
REE/Ca = 0 — 0.05, pH = 7. Моделирование фосфатной
биоминерализации в условиях низких температур проводили с
использованием катион- и анион-селективных мембран на

органическом субстрате при температуре 0 и -2 ^оС, рН=7. Биомиметический синтез апатита кальцификатов сердечных клапанов человека — из раствора, моделирующего состав плазмы крови по неорганическим компонентам при значениях пересыщения по фосфату кальция от 25 до 100 и времени эксперимента от 2 до 12 недель (Т= 37^оС, рН= 7). Биомиметический синтез фосфатов кальция и магния мочевых камней человека — из растворов, моделирующих физиологический по неорганическим компонентам (Т= 37^оС, рН = 5.5 — 8.5) в присутствии добавок питательной среды Мюллера-Хинтона (МХС), мясо-пептонного бульона (МПБ) и болезнетворных бактерий: кишечной палочки Escherichia coli K-12 (e), синегнойной палочки Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (ps), Клебсиелла Klebsiella pneumoniae 4140 (kl) и золотистого стафилококка Staphylococcus aureus 474-ВПХ (s).

Костная ткань ледяной рыбы, кардиолиты и продукты
синтезов были исследованы широким комплексом методов:

порошковая рентгенография, колебательная и фотолюминесцентная
спектроскопия, электронная микроскопия, различные химические
анализы. Порошковую рентгенографию применяли для фазового
анализа, в том числе количественного с использованием метода
Ритвельда, а также для определения параметров элементарной ячейки
и размеров ОКР природных и синтетических апатитов; ИК и КР –
спектроскопию – для фазового анализа, а также для определения
наличия молекул воды, гидроксильных групп, гидрофосфат- и
карбонат-ионов в апатите; фотолюминесцентную спектроскопию – для
изучения люминесцентных свойств РЗЭ-апатитов; cканирующую
электронную микроскопию (СЭМ), в том числе высокого разрешения
(field emission SEM) – для характеристики микроморфологии
природных и синтетических кристаллов и их агрегатов;

высокоразрешающую просвечивающую электронную микроскопию (ВРПЭМ) с электронной микродифракцией – для определения размеров и характера распределения кристаллитов апатита в костной

ткани ледяной рыбы. Определение элементного состава исследуемых биоагрегатов и синтезированных осадков проводили путем локального EDX-анализа, содержание карбонат-иона в апатите определяли потенциометрическим методом. При статистической обработке результатов был применен корреляционный анализ.

Научная новизна.

Впервые кристаллохимически охарактеризованы минеральные
компоненты костной ткани ледяной рыбы и кальцификатов сердечных
клапанов человека; изучено влияние белкового вещества и

болезнетворных бактерий на образование фосфатов кальция и магния мочевых камней человека, а также влияние карбонат-иона в среде кристаллизации на вхождение ионов Sr²⁺ в апатит; для Ce³⁺- и Eu³⁺-апатитов получены зависимости интенсивности люминесценции от содержания РЗЭ. Доказана возможность психрофильной фосфатной биоминерализации, внесён вклад в развитие бактериальной теории патогенного минералообразования в живых организмах.

Практическое значение.

Разработаны способы получения наноразмерных

высоколюминесцентных РЗЭ-апатитов (РЗЭ – Eu³⁺, Ce³⁺), которые
является перспективными материалами для создания биометок при
биологических и медицинских исследованиях. В настоящее время Eu-
апатит с максимальной люминесценцией проходит апробацию в
РНИИТО им. Вредена (Санкт-Петербург). Синтезированные Sr-, Ce- и
Eu-апатиты с различной концентрацией примесей являются

перспективными биоматериалами и в настоящий момент проходят
проверку на антибактериальную активность на кафедре

микробиологии Военно-Медицинской Академии им. С.М. Кирова.

Результаты изучения костной ткани ледяной рыбы и апатитов
кальцификатов сердечных клапанов, а также результаты

биомиметических синтезов мочевых камней и кардиолитов могут быть в дальнейшем использованы при разработке новых подходов профилактики и лечения таких социально значимых заболеваний как остеопороз, атеросклероз и мочекаменная болезнь.

Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах «Кристаллическое вещество в живых организмах» и «Биоминералогия и органическая минералогия» для студентов Института наук о Земле СПбГУ.

Защищаемые положения.

1. Минеральная компонента костной ткани ледяной рыбы
Champsocephalus gunnari, обитающей в водах Южного Океана в
интервале температур -1.9 — +4 ^оС, представляет собой
нестехиометрический водосодержащий карбонатфторгидроксилапатит
В-типа, что наряду с получением фосфата кальция в
низкотемпературном модельном эксперименте демонстрирует
возможность психрофильной фосфатной биоминерализации.

2. Гидроксилапатит кальцификатов сердечных клапанов
человека отличается от других патогенных апатитов повышенным
содержанием карбонат-иона (до ~6 масс %), что приводит к более
существенному по сравнению с водой и другими примесями влиянию
CO₃^2--иона на параметры элементарной ячейки (а уменьшается, с
увеличивается). Разброс значений параметров элементарной ячейки
апатита кардиолитов меньше, чем у других патогенных апатитов, что
обусловлено менее значительными вариациями состава среды
кристаллизации.

3. Добавление в раствор, моделирующий мочу по
неорганическим компонентам (С(Са)7 ммоль/л), белковой среды и
патогенных бактерий приводит к появлению (или увеличению
количества) апатита и струвита, а также к смещению границ их
кристаллизации в более кислую область, а брушита — в более
щелочную.

3. Присутствие карбонат-иона в среде кристаллизации (С/Р = 0.05; 0.10) приводит к более интенсивному вхождению стронция в апатит при величине атомного соотношения Sr/(Sr+Ca) в растворе от 0.40 до 0.85. Образующиеся в этом диапазоне концентраций стронция твёрдые растворы более дефектны по сравнению с высокостронциевыми и высококальциевыми апатитами, так как содержат большее количество карбонат-ионов, молекул воды и вакансий в позициях кальция, а также характеризуются кристаллитами меньшего размера.

4. При отношении атомов REE/Ca в растворе 0.05 ионы Ce³⁺ входят в гидроксилапатит более интенсивно, чем ионы Eu³⁺. Зависимости интенсивности люминесценции апатита от содержания РЗЭ-элементов имеют максимумы при соотношениях Се³⁺/Ca = 0.003 и Eu³⁺/Ca = 0.02.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих научных совещаниях: Первый российский кристаллографический конгресс "От конвергенции наук к природоподобным технологиям" (Москва, 2016),

12й и 13й Международые Симпозиумы по биоминерализации
(Фрайберг, 2013 и Гранада, 2015), Международный симпозиум
«Chemistry for biological, medical, ecological and agricultural purposes»
(Санкт-Петербург, 2015), 3я Международная конференция по
кристаллогенезису и минералогии (Новосибирск, 2013), Всероссийская
научно-практическая конференция «Микробиология: от микроскопа до
нанотехнологий» (Санкт-Петербург, 2013), IV Российское совещание с
международным участием «Органическая минералогия»

(Черноголовка, 2013), Федоровская сессия (Санкт-Петербург, 2012),
Европейское совещание по росту кристаллов (Глазго, 2012),
Конференция STRANN2011 (Санкт-Петербург, 2011), Международная
конференция ICAM-2011 (Норвегия, Трондхейм, 2011),

Международный симпозиум «Биокосные взаимодействия в природных и антропогенных системах – 2011» (Санкт-Петербург, 2011), XIV Национальная конференция по росту кристаллов НКРК-2010 (Москва, 2010), Научно-практическая конференция молодых ученых МГМСУ (Москва 2009), Юбилейная научно-практическая конференция под редакцией проф. Т.И. Ибрагимова (Москва, 2009), 3е Российское совещание по органической минералогии (Сыктывкар, 2009), Международная научная конференция «Радиация и экосистемы» (Гомель, 2008).

По теме диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 3 главы в коллективных монографиях и 5 статей (5 публикаций из списка ВАК; 4 - вошли в международные базы данных Web of Science и Scopus).

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (08-05-
00957, 10-05-00881-а, 11-05-00151-а, 11-05-90425-Укр_ф _а, 13-05-
90432 Укр_ф _а), гранта СПбГУ 3.38.243.2015 и программы «Дмитрий
Менделеев» DAAD на базе ресурсных центров СПбГУ:

«Рентгендифракционные методы исследования», «Нанотехнологии», «Геомодель», «ОЛМИВ».

Объем и структура работы.

Иерархическая структура, вещественный состав и механизмы образования костной ткани современных позвоночных

Гидроксилапатит, стабильный и биосовместимый материал для терапии костной ткани, обладает большим количеством возможных изоморфных замещений и гибкой стехиометрией (Elliott 1994; Rakovan & Hughes 2002; Frank-Kamenetskaya et al. 2011). Sr-содержащий апатит Стронций — один из элементов, способных замещать кальций в структуре апатита (Collin 1959, 1960; Heijligers 1979). Collin (1959, 1960) показал, что непрерывный ряд твёрдых растворов существует для апатита на всём диапазоне между CaHA и SrHA. Он обнаружил, что содержание стронция в осадке меньше, чем в исходном растворе, и описал линейную зависимость параметров элементарной ячейки от содержания стронция в апатите. Heijligers с соавторами (1979) синтезировали твёрдые растворы Ca-Sr апатитов твердофазным методом и также получили линейные уравнения для параметров элементарной ячейки. Они предположили, что отсутствие отклонений от линейной зависимости указывает на отсутствие предпочтения стронцием одной из кристаллографических позиций. Они также обнаружили, что при высоком содержании стронция (отношение Sr/(Sr+Ca) более 80%), помимо апатита, образуется также небольшое количество Sr3(PO4)2. Позже было обнаружено небольшое предпочтение стронцием кристаллографической позиции Ca2 в апатите (Bigi et.al. 1998; Terra et.al. 2009).

Интерес к закономерностям вхождения стронция в апатит связан с тем фактом, что изотоп 90Sr является одним из долгоживущих искусственных радиоактивных загрязнителей и представляет из-за этого высокую опасность. Обширные территории были загрязнены этим изотопом после испытания ядерного оружия и аварий на атомных электростанциях (Noshkin et.al. 1981). С этой точки зрения вхождение стронция в гидроксилапатит костей и зубов человека может нанести серьёзный вред здоровью, поскольку изотоп 90Sr способен вызывать радиоактивное облучение организма (Смагин 2007). В областях с аномально высоким содержанием стронция интенсивное вхождение этого элемента в организм может вызывать патологии и в отрыве от радиоактивности (т. н. Урова болезнь) (Авцын 1972). Также стронций может вызывать рахит, кариес и осложняет побочные эффекты цинги (Heijligers et.al. 1979).

Однако влияние стронция на живые организмы может быть не только негативным. В случае присутствия в концентрации чуть выше нормальной стронций оказывает благотворное влияние на человека. Помимо антирезорбцивной активности, стронций обладает анаболической активностью в костной ткани, что может положительно сказываться на балансе нормальной и остеопенической (слабоминерализованной) костью (Marie et.al. 2001). Кроме того, стронциевый апатит обладает антибактериальными свойствами (Yingguang et.al. 2008).

В наши дни созданию стронций-содержащих пероральных препаратов для лечения остеопении уделяется большое внимание (Oliveira et.al. 2012, Rossi et.al.2014). Для этой цели проводилось изучение in vivo поведения стронция в организме животных. Oliveira с соавторами (2012) оценивали вхождение стронция в зубы и кости и показали, что в живом организме стронций может заменять вплоть до одного из десяти атомов кальция в кристаллической решётке апатита. Rossi с соавторами (2014) обнаружили, что крысы, накормленные ранелатом стронция, имеют больше карбонатных групп в костях, чем крысы, которым препарат не вводился. Также стронций находит своё применение в составе биоактивных покрытий на основе гидроксилапатита (Zhang 2013). Oliveira с соавторами (2007) получили покрытие из Sr-замещённого апатита на Ti6Al4V в ходе биомиметического синтеза, которое обладало костеподобной структурой и улучшало процессы костеобразования и интеграции.

Известно, что биологические апатиты содержат карбонат-ион, замещающий фосфат-ион (замещение В-типа) (Elliott 1994; Frank-Kamenetskaya 2008; Frank-Kamenetskaya et.al. 2011), что увеличивает растворимость апатита (Budz et.al. 1987). Li с соавторами (2007) показали, что при отношении Sr/(Sr+Ca) 15% стронций ведёт к увеличению количества захваченного из воздуха карбонат-иона. Landi с соавторами (2008) создали материал на базе стронций-содержащего карбонатапатита, который был способен выпускать в кость in situ большее количество Sr в день, чем апатит, не содержащий карбонат-иона. Тем не менее, детальное изучение влияния карбонат-иона, находящегося в среде кристаллизации, на формирование твёрдых растворов Ca-Sr апатитов, не проводилось. РЗЭ-содержащие апатиты В мировой экономике на данный момент наблюдается тенденция к увеличению потребления редкоземельных элементов (РЗЭ) (Javier, 2012). Апатиты являются хорошими концентраторами РЗЭ (Rakonav and Hughes, 2002). В природных фторапатитах Ca10(PO4)6F2 вхождение трёхвалентных РЗЭ компенсируется в основном за счёт замещения PO43- на SiO44- и Ca2+ на Na+, и при практически полном замещении PO43- на SiO44- образуется минерал бритолит (REE,Ca)10(SiO4,PO4)6(F,OH)2, количество редкоземельных элементов в котором может достигать 68 масс.% (в оксидной форме), т. е. 8.6 атомов на ячейку (Мельников с соавт., 2012). Природные фторапатиты при содержании РЗЭ 1 масс% являются рудой на них (Сарычев с соавт., 2013). Редкоземельные элементы в ограниченных количествах часто присутствуют в биогенных гидроксил- и фторапатитах. Максимальное содержание каждого из самых распространенных элементов этого ряда (Y, La, Ce, Pr, Nd) в апатитах фосфоритов и фоссилий не превышает 0.21 – 0.63 ат.%, а суммарное содержание - 1.9 ат.% (Панова с соавт., 2001). В гидроксилапатите зубной и костной тканей человека лантаноиды встречаются на уровне ppm (Pikhur et. al., 2010).

Благодаря биосовместимости и антибактериальным свойствам апатит широко используется в медицине (Zhang, 2013). Присутствие примесей РЗЭ придаёт апатитам дополнительные полезные свойства, позволяющие расширить область их применения (Shalika et al. 2015). Апатиты с примесью всех редкоземельных элементов обладают люминесцентными свойствами (Blasse, 1975), что позволяет их использовать для недеструктивных исследований состояния имплантатов в живом организме (Rao et. al., 2007; Iconaru et. al., 2013; De Araujo et. al., 2007; Graeve et. al., 2010; Jagannathan et. al., 1995). Апатиты с примесями радиоактивных изотопов 90Y, 165Dy, 166Ho, 169Er применяются при проведении радиосиновектомии (Chattopadhyay et. al., 2008; van der Zant et. al., 2009). Известно, что примесь иттрия повышает адгезию остеобластов на поверхности апатита (Wei et. al., 2012). Примесь лантана повышает термическую стабильность апатита, его прочность на изгиб, снижает растворимость и обеспечивает приемлемую цитотоксичность (Guo et. al., 2009), а также замедляет выделение кислоты бактериями зубного налёта (Deng et. al. 2014). Апатиты с примесью церия и европия обладают антибактериальными свойствами (Lin et. al., 2007; Iconaru et. al., 2013), а Ce-апатит также стимулирует метаболизм (Kaygili et. al., 2014). Неодим способен стабилизировать структуру апатита зубной эмали (Kiss et. al., 1994).

Ещё одной областью применения апатитов является создание на их основе керамик для захоронения радиоактивных отходов (Ewing, 1999; Burakov et. al., 2011). Так как изучение поведения радиоактивных элементов в апатитовых керамиках сопряжено с большими трудностями, эти работы проводят с использованием геохимических аналогов актинидов – с Ce и Eu (Catalette et.al., 1998; Letho, 2009; Matrin et. al., 2003; Guo et. al., 2014).

Кроме того, апатиты с примесями празеодима, неодима и гольмия, также являются перспективными материалами для изготовления лазеров (Steinbruegge et. al., 1972; Dhiraj et. al., 2002).

Таким образом, апатиты, допированные РЗЭ, имеют очень широкий спектр применения. Однако имеющиеся к настоящему времени данные характеризуют апатиты с примесями отдельных элементов, что не позволяет провести сравнение свойств апатитов всего ряда РЗЭ.

Биомиметический синтез апатита плазмы крови человека

Формирование патогенных агрегатов происходит при широком спектре заболеваний: различные виды литиаза, атеро- и артериосклероз (Кораго 1992; Тиктинский и Александров 2000; Голованова 2006; Нигматулина с соавт. 2004; Пальчик и Столповская, 1998; Lowenstam & Weiner 1989). Изучение состава этих агрегатов позволяет выявить условия их образования способствует разработке методов лечения связанных с ними болезней. Теории образования физиогенных биоминералов (биоминерализация) тесно связаны с живым веществом (см. раздел 1.3). Живой организм обладает очень небольшим влиянием на характер осаждающихся фаз, поскольку химизм среды, значения рН и состав органических примесей не могут варьироваться в широких пределах. Биоминерализация разделяется на биологически индуцированную и биологически контролируемую (см. раздел 1.3), причём последняя в случае физиогенной минерализации в организме человека и животных является более распространённой, поскольку подразумевает непосредственное участие организма в процессе (Weiner & Dove 2003). В случае патогенной биоминерализации, напротив, влияние живых клеток организма на процесс минимально. В настоящее время существует множество теорий, объясняющих причины и механизмы патогенного камнеобразования (Тиктинский и Александров, 2000; Кораго 1992; Голованова, 2006; Fleming et al., 2001; Balaji & Menon, 1997; Grases et al., 1998; Weiner & Dove 2003; Waltona et al., 2005).

Среди теорий, основанных на изменении состава биологической жидкости, выделяют коллоидную и органическую теории.

Коллоидная теория основана на смещении равновесия в составе мочи. В норме моча человека пересыщена по неорганическим компонентам (кристаллоидам)), а присутствие некоторых органических примесей (коллоидов — альбуминов, глобулинов и др.) препятствует кристаллизации минералов из раствора. При нарушении качественных и количественных соотношений между коллоидами и кристаллоидами последние могут начать коагулироваться и осаждаться, выступая таким образом центрами кристаллизации для биоминералов. Эта теория хорошо описывает патогенную минерализацию в слюнной жидкости и желчи. Представление мочи человека как коллоидного раствора, содержащего большое количество мелкодисперсных белков, однако, ставится под сомнение (Тиктинский и Александров 2000). Органическая теория предполагает, что патогенные органо-неорганические агрегаты образуются при непосредственном участии органического вещества — либо на матрице из отложившегося органического вещества (биологически индуцированная биоминерализация, см. раздел 1.3), либо свободное отложение веществ из физиологической жидкости одновременно с органическим веществом (Кораго 1992; Тиктинский и Александров 2000). В настоящее время данная теория применяется для описания образования фаз мочевых камней.

Исчерпывающее объяснение теорий биоминерализации осложняет также тот факт, что в норме физиологическая жидкость (моча) пересыщена основными компонентами патогенных минералов, но минералообразования не происходит, а органические примеси, которые могут ингибировать камнеобразование, присутствуют как у здоровых, так и у больных литиазом людей (Тиктинский и Александров, 2000; Кораго 1992).

Помимо теорий, основанных на изменении состава биологической жидкости, выделяют также бактериальные теории, которые предполагают активное влияние бактерий и вирусов на процесс патогенного минералообразования (Каткова 1996; Нигматулина 2004), которые на данный момент активно разрабатываются (Martnez-Ruiz et al. 2010; Konhauser & Riding 2012).

Что касается теорий образования кристаллических фаз в крови человека (например, фосфатов кардиолитов), отсутствие единого мнения на этот счёт объясняется теми же причинами, что и в случае теорий биоминерализации в мочевой системе человека. Во-первых, кровь, как и моча, обладает сложным химическим составом и содержит помимо большого количества неорганических ионов (H+, K+, Na+, Ca2+, H2PO4-, HPO42-, PO43-, HCO3-, SO42-) также органические соединения (такие, как белки или хелаты) (Березов 2002; Dorozhkina & Dorozhkin 2003; Титов 2000). А, во-вторых, образование образование минеральной компоненты кардиолитов зачастую связано с другими болезнями, что увеличивает количество потенциальных факторов, влияющих на биоминерализацию (Verberckmoes 2007; O Neill 2007; Louvet 2015). В отличие от мочевой системы, в крови не могут присутствовать в большом количестве болезнетворные бактерии, что исключает существенное влияние бактериального фактора на механизм их образования, знание которого необходимо для совершенствования методов лечения атеро- и артериосклероза (Cottignoli et al. 2015).

В целом, несмотря на многообразие теорий патогенного минералообразования в организме человека, ни одна из них не является в настоящее время доминирующей и универсальной, что обулавливает необходимость дальнейших исследований. Существенный прогресс в изучении закономерностей патогенного фазообразования в организме человека и животных намечается в результате модельных экспериментов по кристаллизации аналогов патогенных фаз в присутствии органических веществ, а также бактерий и вирусов (Каткова, 1996; Jan et al., 2008; Borghi et al., 2012; Голованова, 2006; Голованова с соавт. 2010; Golovanova et al. 2016).

Результаты низкотемпературного биомиметического синтеза

Размеры кристаллитов вдоль оси [001] (для апатитов с примесью Sr) рассчитывали при помощи уравнения Дебая-Шеррера с использованием интегральной полуширины отражения 002. В качестве внешнего стандарта для определения инструментального вклада в уширение пиков использовали фторапатит из месторождения Слюдянка. Съемку осуществляли на дифрактометре Rigaku MiniFlexII. Параметры съёмки: 2 = 23 – 28о, шаг 0.02о, выдержка 1 сек.

Сканирующая электронная микроскопия и рентгеноспектральный микроанализ Сканирующую электронную микроскопию с контролем элементного состава с помощью EDX–анализа применяли для изучения структуры биоагрегатов, а также для выявления микрогетерогенности состава синтезированных осадков и определения размеров и морфологии синтетических кристаллов. Исследования проводили на сканирующих электронных микроскопах снабженных энергодисперсионными аналитическими приставками: Zeiss Merlin, МРЦ «Нанотехнологии», СПбГУ (ускоряющее напряжение — 20 kV, ток зонда менялся от 125 pA до 7,1 nA, рабочее расстояние менялось от 3,1 мм до 10,2 мм, размер области сканирования менялся от 300 нм до 100 мкм) и ESEM FEI Quanta 200 FEGi, Дрезден, Германия (ускоряющее напряжение 15-25 kV). Также были получены изображения в режиме bse (обратно-рассеянные электроны), с материальным и топографическим контрастом.

Для количественного определения основного элементного состава природных и синтетических образцов также использовали EDX–анализ. Исследования проводили на приборах CamScan4, Радиевый институт им. В.Г.Хлопина (аналитик Ю.Л. Крейцер) и Hitachi S-3400N, Ресурсный центр «ГЕОМОДЕЛЬ», СПбГУ (аналитик Шиловских В.В.), оборудованном микроанализатором EDX — AzTec Energy 350 (ускоряющее напряжение 20 кВ, диаметр пучка 1 m). При количественном микроанализе в качестве стандартов использовали аттестованные природные и искусственные соединения. В случае изучения апатитов. Достоверность результатов химического анализа апатита определяли по двум критериям: суммарное количество определяемых элементов не должно сильно отличаться от 100% и отношение суммы атомных количеств катионов к сумме атомных количеств серы и фосфора должно быть немного меньше, чем 1.67 (значение этого отношения в стехиометрических апатитах).

Просвечивающая электронная микроскопия и микродифракция.

Высокоразрешающую просвечивающую электронную микроскопию (ВПЭМ) использовали для изучения нанокомпозитной структуры костной ткани ледяной рыбы (определение размеров кристаллитов апатита и их взаимное расположение). Дифракционные картины рассчитывали по данным ВПЭМ путем Фурье-преобразования и получали путем дифракции электронов. Съемку проводили на приборах Zeiss Libra 200FE (МРЦ «Нанотехнологии», СПбГУ) и JEM-2200FS, Фрайберг, Германия (ускоряющее напряжение 200 kV, аналитики Убыйвовк Е.В. и Мотыленко М.).

Колебательная спектроскопия.

ИК- и КР-спектроскопию использовали для уточнения фазового состава исследуемых объектов и выявления наличия в апатите молекул воды, гидроксильных групп, карбонат- и гидрофосфат-ионов. Ик-спектры получали на спектрометрах Bruker Vertex 70 FTIR (Ресурсный центр «Рентгендифракционные методы исследования») и Nicolet 6700 FTIR, Ресурсный центр «ГЕОМОДЕЛЬ») в диапазоне 300 — 4000 см-1. Пробы готовились таблетированием в KBr (1 мг пробы на 200 мг KBr). При диагностике апатита были использованы следующие диагностические линии: 1115, 1030, 605, 560 и 470 см-1 — P-O связь; 1460, 1420 и 883 см-1 — карбонат-ион; 1600 и 3300 — 3600 см-1 — вода; 640 и 3580 см-1 — ОН-группа; 875см-1 — гидрофосфат-ион (Berzina-Cimdina & Borodajenko 2012). При диагностике брушита: 413, 525, 577, 789, 874, 986, 1063, 1136, 1217, 1651, 2387, 3165, 3280, 3491, 3545 см-1 (Karampas & Kontoyannis 2013).

При исследовании апатита кардиолитов методом ИК-спектроскопии по полученной для эталонных образцов зависимости интенсивности полосы поглощения 883 см-1 от содержания карбонат-иона было определено содержание карбонат-иона.

Рамановскую спектроскопию применяли при исследовании образцов кардиолитов и продуктов низкотемпературного мембранного синтеза. КР-спектры продуктов низкотемпературного мембранного синтеза получали на спектрометре RamanRxn1, Kaiser Optical Systems Inc., совмещённом с оптическим микроскопом DM2500 P, Leica Microsystems GmbH (Горная академия, Фрайберг, Германия). КР-спектры кардиолитов получали на спектрометре Nicolet 6700 FTIR (Ресурсный центр «ГЕОМОДЕЛЬ»). Длина волны возбуждающего излучения составляла 785 nm, размер области сканирования составлял 20 m, съёмка проводилась в диапазоне 200 — 3250 см-1, разрешение составляло 4 см-1. Диагностические линии: 430, 448, 579, 591, 608, 961, 1048 см-1 – P-O связь в апатите, 1075 см-1 – карбонат-ион В-типа (Karampas & Kontoyannis 2013).

Оптическая микроскопия. Световую микроскопию использовали для визуальной предварительной оценки результатов синтезов в экспериментах по фазообразованию в растворах, моделирующих состав мочи человека по неорганическим компонентам.

Газообменный метод. Газообменный потенциометрический метод использовали для определения общего содержания углерода в синтезированных Sr-содержащих карбонатгидроксилапатитах и биомиметических аналагах апатитов кардиолитов. Метод основан на прокаливании навески в токе кислорода при температуре 1250 — 1300 градусов и последующем поглощении образующегося углекислого газа раствором гидрата окиси калия на газоанализаторе. Исследования проводили в аналитическом центре «Механобр Инжиниринг Аналит». Аналитик С.Н. Зимина.

Формулы синтетических карбонатапатитов по результатам количественного EDX– анализа и газообменного метода рассчитывали, исходя из предположения, что вакансия в позиции фосфора отсутствует (P+C=6). При компенсации избыточного отрицательного заряда учитывали возможность замещения трехвалентных фосфатных групп на двухвалентные гидрофосфатные, а также наличие вакансий гидроксильных групп, заполненных молекулами воды. Для оценки дефектности апатитов использовали катионно-анионное отношение (отношение суммы количеств атомов, входящих в позицию кальция, к сумме фосфора, карбонат-иона и серы).

Фотолюминесценция. Спектры люминесценции РЗЭ-апатитов регистрировали на спектрофлуориметре Fluorolog-3 (HORIBA Jobin Yvon), МРЦ ОЛМИВ, СПбГУ (аналитик Колесников И.Е.) при комнатной температуре, источник возбуждения — ксеноновая лампа (450 Вт). Типичная спектральная ширина щелей при измерении — 2,50 нм. Пробы готовили прессованием 5 мг образца в 300 мг KBr.

Характеризация минеральной компоненты кардиолитов

Во всех проведенных экспериментах были получены фосфаты кальция и магния, встречающиеся в составе почечных камней человека (Кораго, 1992; Полиенко и др., 1997; Голованова, 2006). В продуктах синтеза без добавок белкового вещества и бактерий с минимальными концентрациями ионов-примесей (серия 1) до pH=6.86 преобладает брушит, а при более высоких pH кристаллизуется Mg-витлокит (рис. 5.6). В продуктах синтеза с максимальными концентрациями ионов-примесей (серия 2) до pH=7.23 преобладает брушит, а при более высоких pH кристаллизуются струвит вместе с брушитом (рис. 5.8). Эти различия в фазовом составе, вероятнее всего, обусловлены разнонаправленным влиянием на растворимость фосфатов кальция и магния присутствующих в растворах в различных соотношениях неорганических ионов. Ранее Кузьминой с соавторами было установлено, что при кристаллизации брушита величина pH раствора уменьшается существенно больше (Kuz mina et al., 2013), чем при кристаллизации струвита (Кузьмина с соавт., 2009). При этом повышение концентрации ионов калия, натрия и особенно сульфат-ионов увеличивают растворимость струвита. Поэтому отсутствие струвита в продуктах синтеза серии 1 можно объяснить увеличением его растворимости при характерном для мочи человека значительном (по сравнению с ионами магния) содержанием ионов калия, натрия и сульфат-ионов (табл. 2.5). Появление струвита в продуктах синтеза серии 2 связано, вероятнее всего, с большей концентрацией ионов магния (11 ммоль/л по сравнению с 5.3 моль/л, табл. 2.5) при избыточной концентрации ионов аммония и фосфат-ионов, что создает достаточно высокое пересыщение для кристаллизации струвита. Однако благодаря присутствию в растворе ионов калия, натрия и сульфат-ионов, увеличивающих растворимость струвита, граница начала его образования в экспериментах серии 2 без органических добавок смещена по сравнению с наблюдаемой в системе, не содержащей калия, натрия и сульфат-иона (Кузьмина с соавт., 2009), в более щелочную сторону и соответствует pH = 7.20 (вместо 6.70). В целом, полученные на данном этапе работы результаты хорошо согласуются с данными предшествующих модельных экспериментов по образованию минеральных фаз почечных камней (El nikov et al., 2007).

Как показали результаты проведённых экспериментов, добавка питательных сред и бактерий приводит к изменению фазового состава осадка и смещению границ начала образования фаз (табл. 5.2). Добавление среды Мюллера-Хинтона в модельный раствор с минимальной концентрацией неорганических примесей (вариант 1 серии 3) привело к исчезновению октокальцийфосфата и витлокита и образованию брушита, реже струвита. Та же добавка в модельный раствор с максимальной концентрацией неорганических примесей (вариант 1 серии 4) привела к кристаллизации апатита, наряду с брушитом и струвитом, и к существенному смещению начала образования кристаллического осадка (брушита, апатита) в строну более высоких значений pH раствора ( 7.00).

Добавление мясо-пептонного бульона в модельный раствор с минимальной концентрацией неорганических примесей (вариант 6 серии 3) так же привело к образованию брушита и витлокита, но, кроме того, была зафиксирована кристаллизация струвита при pH = 7.26, то есть произошло смещение фазовой границы образования струвита в этой системе в существенно более кислую сторону. Брушит в этой среде был зафиксирован в более узком интервале pH 7.06. Так как в опытах без органических добавок при таком высоком pH брушит уже не образуется, это позволяет говорить о расширении границы его образования в более щелочную сторону. Та же добавка в модельный раствор с максимальной концентрацией примесей (вариант 6 серии 4) не привела к изменению фазового состава продуктов синтезов. В то же время, можно говорить о том, что граница начала образования брушита сместилась в более щелочную область растворов, а граница начала образования струвита - в более кислую (pH=6.96). Добавка бактерий в соответствующие среды приводит к дополнительным изменениям в составе осадков (табл. 5.2, варианты синтезов 2-5, 7-10). Так в серии 3 появление в среде, содержащей МХС, бактерий Escherichia E.coli и Pseudomonas aeruginosa (варианты 2 и 4) приводит к образованию струвита и смещению границы области его кристаллизации в более кислую область. Смещение границы кристаллизации струвита в более кислую область фиксируется и в продуктах синтезов серии 4 во всех опытах с добавками МХС в присутствии бактерий (варианты 2-5). В синтезах серии 3 (варианты 2, 5, содержащие МХС) проявилось влияние бактерий Escherichia E.coli и Staphylococcus ahrens на кристаллизацию брушита, которое заключается в смещении границ его кристаллизации в более щелочную область. Влияние бактерий на кристаллизацию апатита хорошо видно в серии 3 в среде, содержащей МПБ (варианты 7-10). Их появление способствует началу кристаллизации апатита и смещает границу его образования в более кислую область.

Образование фосфатов в процессе экспериментов сопровождалось измением величины pH растворов (табл. 5.1). В опытах без добавок (серии 1, 2 величина pH растворов в процессе кристаллизации всегда уменьшалась, а с добавками белкового вещества и бактерий (серии 3, 4) могла как увеличиваться, так и уменьшаться (рис. 5.11). В опытах серии 3 добавление МХС способствует значительному изменению величины pH раствора в ходе эксперимента (максимальное рН = 0.75), тогда как добавка МПБ приводит обычно лишь к небольшому уменьшению рН (максимальное рН = -0.25). В опытах серии 4 добавление МХС приводит в основном к уменьшению рН (максимальное рН = -0.60), а добавка МПБ - к увеличению рН (максимальное рН = +0.40).

Добавление бактерий также оказывает влияние на изменение рН в процессе эксперимента. На рис. 5.11 видно, что наиболее сильно уменьшает рН в процессе эксперимента ( на 1.40 единицы) бактерия Staphylococcus ahrens в присутствии МХС (вариант 5, серия 3). Увеличение рН под действием бактерий в процессе эксперимента не превышает 0.75 единиц и вызывается присутствием бактерии Escherichia E.coli в присутствии МХС (вариант 2, серия 3). В целом, в средах с бактериями наблюдается тенденция к уменьшению величины рН.Изменение величины pH раствора в процессе биомиметического синтеза (рис. 5.11), обусловленное как процессом кристаллизации различных фаз, так и дополнительным влиянием добавления белковой среды определенного типа и всех видов использованных бактерий, происходит разнонаправленно. Уменьшение величины рН можно объяснить выпадением в осадок фосфатов, увеличение в системах с бактериями — влиянием продуктов метаболизма. Таким образом, нами показано, что присутствие белковой среды и патогенов в жидкости, моделирующей состав мочи человека, существенно влияет на фазовый состав осадка и положение границ кристаллизации образующихся фаз (струвита, брушита и апатита). Границы кристаллизации струвита и апатита смещаются в более кислую область, а брушита — в более щелочную. Полученные результаты вносят вклад в развитие бактериальной теории патогенного минералообразования в организме человека и создание научной основы для разработки новых методов профилактики мочекаменной болезни.