Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины как индукторы иммунопатологических реакций Козловский, Виктор Николаевич

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. До настоящего времени туляремия и бруцеллез остаются в числе заболеваний, представляющих серьезную опасность для человека и животных. Широкое распространение природных очагов этих инфекций, постоянная активность эпизоотии, захватывающих обширные территории с животноводческой ориентацией, устойчивость возбудителей во внешней среде, тяжесть клинических проявлений вызываемых ими у человека заболеваний, высокий процент случаев инвалидности среди больных и отсутствие полноценной иммунной защиты вакцинированных контингентов обусловливают необходимость изучения механизмов иммуногенеза при туляремии и бруцеллезе. Определение механизмов формирования иммунного ответа и причин нарушения функционирования иммунной системы должно способствовать усовершенствованию специфической профилактики и оптимизации терапии с помощью адекватной иммунокоррекции фармакологическими препаратами. Шеющиеся на сегодняшний день препараты для профилактической вакцинации людей, с одной стороны, как в случае туляремии, не позволяют добиться стопроцентной невосприимчивости вакцинируемых не только к заражению высоковирулентными штаммами американского подвида, но и к заражению штаммами F. tularcnsis. распространенными в природных очагах России, особенно при аэрогенном пути инфицирования (Олсуфьев Н.Г., 1975; Павлович Н.В., 1993; Anthony L.S.D. et al., 1987; Bell J. F., 1981; Hood A.M., 1977; Tarnvik A., 1989). С другой стороны, как в случае бруцеллеза, вакцинация сопряжена с высоким уровнем аллергизации макроорганизма, приводящим к существенным сдвигам иммуногомеостаза вплоть до развития парадоксальных реакций на инфицирование или ревакцинацию с развитием тяжелых клинических форм болезни и переходом ее в хроническую форму (Беклемишев Н. Д., 1965, 1975,1979,1986; Белозеров Е.С., 1985; Вершилова П. А. и др., 1972, 1974; Грекова Н. А., 1968; Елылина Г. А. и др., 1991; Ременцова -М.М., 1991; Суходоева Г.С. и др.. 1971.1980; Таран И. Ф. и др., 1996; ТихенкоН. И. и др.. 1983; Цирельсон Л. Е. и др., 1977; Моп-taraz J.A. et al., 1986; Patterson J.M. et al., 1976; Plommet M. et al., 1983). Известно также, что патогенез склонных к хроничес-

кок}' течение инфекционных болезней, в том числе к бруцеллеза, в первую очередь связан с патологией иммунитета (Беклемишев Н.Д., Ї979,1936; Белозеров Е.С., 1985; Вартазарян Н.Д., 1983). Известно также, что патогенез склонных к хроническому течению инфекционных болезней, в том числе и бруцеллеза, в первую очередь связан с патологией- иммунитета (Беклемишев Н.Д., 1979,1986; Белозеров Е.С, 1985; Вартазарян Н. Д., 1983).

Несмотря на вышеизложенное на сегодняшний день наиболее прочного и длительного иммунитета против инфекционных заболеваний можно добиться только при использовании для вакцинации препаратов на основе живых аттекуированных микробных клеток, а не смесей химически чистых антигенов или убитых микробных клеток. Применение живых вакцин имеет целый ряд преимуществ перед убитыми в отношении силы и продолжительности вакцинального иммунитета. Однако использование этих средств специфической профилактики инфекций, как правило, осложняется их высокой реактогенностью, степень которой сильно варьирует в зависимости от использованного для приготовления вакцины микробного штамма. В последние годы стало очевидным, что различные микроорганизмы способны изменять иммунный ответ зараженного хозяина на последующее или одновременное введение неродственных антигенов, то есть неспецифически модулировать иммунный ответ (Прилепин Н.А. и др.» 1980, 1981; Санин А. В. и др., 1987; Станиславский Е.С, 1976; Kaufmann S.H.E. et al.» 1989). Поствакцинальные осложнения связаны с наличием в составе бактериальной клетки структур (например, ЛПС), обладающих стрессорными, сенсибилизирующими, анафилактогенными и другими неблагоприятными свойствами, и проявляются в виде местных и общих реакций макроорганизма (Брагинская В.П. и др., 1990; Покровская Н.Я. и др., 1981; Соколова А. и др., 1986; Turner-Lowe S., 1991). Наибольшее значение в патологии, обусловленной введением живых вакцин, имеют поствакцинальные осложнения, обусловленные нарушениями иммуного-меостаза. Вместе с тем характер иммунопатологических изменений, вызванных вакцинацией, изучен недостаточно.

Несмотря на неослабевающий интерес исследователей к изучению иммунологических сдвигов, происходящих в зараженном макроорганизме как в отношении бруцеллеза, так и в отношении туляремии, до настоящего времени нет единой точки зрения на механизмы иммуноло-

гической перестройки макроорганизма при инфицировании или вакцинации и формировании иммунной защиты. Нет четкого представления о роли различных субпопуляций ИКК б процессе иммуногенеза, о нарушениях функциональной активности одних и активации других клеточных элементов, неясна роль индуцируемых в значительных количествах и'сохраняющихся десятилетиями сывороточных антител (Белозёров Е.С., 1985; Борсук Г. И. и др., 1993 Вершилова П.А. и др., 1974.; Корзекко В.Н., 1974,1980; Anthony L.S.D. etal., 1987; Koskela P., 1985, 1982; Tarnvik A., 1989), недостаточно изучены вопросы биологической целесообразности и функциональной нагрузки наблюдаемых феноменов антителообразования и ГЗТ. Мало изучены процессы взаимодействия туляремийного и бруцеллезного микробов с МФ ин-тактных и иммунизированных животных, отсутствуют данные об изменениях рецепторного аппарата МФ и их корреляции с напряженностью противоинфекционного иммунитета. Констатируемое G. Sandstrom положение о ведущей роли Т-ЛФЦ в защите от туляремии - лишь вершина айсберга. Очевидна необходимость расширенной аргументации, основанной на изучении взаимосвязей Т-ЛФЦ с другими лимфоидными клетками и МФ, определяющими характер реагирования этих клеток. Известно, что активация Т-ЛФЦ (и выполнение ими каких-либо эффек-торных функций) не может быть осуществлена антигеном напрямую. В связи с этим нарушение функций антигенпрезентирующих клеток не может не сказаться на уровне активации Т-ЛФЦ. Феноменология этого явления, как и многих других иммунных процессов, способствующих или препятствующих формированию иммунологической защиты от туляремии и бруцеллеза, до настоящего времени остается неизученной. Изложенное свидетельствует о том, что многие вопросы иммуногенеза туляремии на сегодняшний день не могут считаться разрешенными, что в той асе степени может быть отнесено и к бруцеллезу. Получение ответов на поставленные вопросы позволит определить эффективные пути воздействия на отдельные этапы иммуногенеза с целью коррекции иммунологических реакций и предотвращения развития иммунопатологии.

Таким образом, очевидно, что в ряду актуальных задач в области изучения инфекционной патологии, вызываемой возбудителями особо опасных инфекций, одно из ведущих мест занимает совершенствование методов специфической профилактики туляремии и бруцелле-

за, основанное на изучении антигенного строения микробных клеток и механизмов взаимодействия микро- и макроорганизмов и формирования иммунной защиты макроэргачизма при его инфицировании, исследований функциональной активности различных популяций ИКК и их роли в процессе деградации и злшжнации возбудителя, функциях антител (в том числе и моноклональных), продуцируемых в ответ на различные микробные антигенные субстанции, в ишуно- и патогенезе инфекции (Каральник Б. В. и др., 1990, 1 993; Козловский Б.Н., 1989-1992; Кормилицына и др., 1996; Мещерякова И. С, 1968,1970,1995; Олсуфьев Н.Г.. 1975; Салмаков К.М. и др., 1989,1990; Студенцова В.К. и др., 1991; Сухарь В.В., 1965-1987; Хлебников B.C. и др., 1992,1993; Bascoul S. et al., 1978; Bell J.F., 1981; Bundesen R.G. etal., 1985; Bundle D.R. etal., 1984,1989; Cannat A. etal., 1978; Chin J. etal., 1989; Cloecka-ert A. et al., 1992; Fulop M.J. et al., 1991; Golovliov I. et al.. 1995; HolmanP.J. etal., 1985; Hood A.M., 1977; Khlebnikov V.S. etal., 1991; Lilliehook B. etal., 1989; Limet J. etal., 1987,1989; MeikleP.J. etal., 1989; MontarazJ.A. etal., 1986; Pardon P. etal., 1977; Patterson J. M. etal., 1976; Phillips M. etal., 1989; Plommet M. etal., 1983,1987; Roop R.M. etal., 1987; Sandstrom G. etal., 1984-1994; Sulitzeanu D., 1955; Tarn-vik A., 1989; Vendrell J.P., 1985-1992; Vizcaino N. etal., 1992).

Близость филогенетического происхождения возбудителей туляремии и бруцеллеза, общность проявления различных иммунологических феноменов, антигенное родство, проявляющееся в высокой степени перекрестной реактивности туляремийных и бруцеллезных сывороток (Желудков М.М., 1980; Олсуфьев Н. Г., 1975; Behan К.A. etal., 1982; Tarnvik А., 1989) обусловили необходимость проведения параллельных исследований механизмов иммуногенеза обеих инфекций.

Таким образом, выяснение роли отдельных популяций и субпопуляций ИКК, а также определение функций, выполняемых индивидуальными антителами, при иммунологической перестройке, вызванной возбудителями бруцеллеза и туляремии, являются актуальными, так как будут способствовать расшифровке некоторых аспектов противотуля-ремийного и противобруцеллезного иммунитета и служить основой для разработки направленной иммунокоррекции вакцинального иммуногене-

за, в том числе и с помощью фармакологических средств.

Представленные в диссертации материалы исследований являются результатом работы по 4 плановым темам, выполнявшимся в рамках КИР РПЧИ:

Исследование антигенных детерминант возбудителей чумы и туляремии на основе набора моноклональных антител; номер государственной регистрации 01.88.0. 053371;

Создание панели моноклональных антител к антигенам возбудителей чумы и туляремии; номер" государственной регистрации 01.09.10. 053231;

Получение набора моноклональных антител к антигенам возбудителя бруцеллеза; номер государственной регистрации 003543 01.9.50

Влияние антигенов вакцинного штамма В. abortus 19-ВА на функциональную активность иимунокомлетентных клеток животных; номер государственной регистрации 114-3-96.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: изучение функциональной активности различных иимунокомлетентных клеток и роли гуморальных антител в формировании иммунитета у животных, иммунизированных вакцинными штаммами возбудителей туляремии и бруцеллеза, а также нарушений иммуногомеостаза в результате иммунизации и возможности их фармакологической коррекции.

1. Оценить количественные изменения, пролиферативную и синтетическую активность Т-, В-ЛФЦ и макрофагов (МФ) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза при введении вакцинных штаммов F.tularensis 15 (ЖТВ) и В.abortus 19-ВА 0КБВ).

2. Изучить баланс системы интерлейкинов 2,4, 5 и 6, продуцируемых лимфоидными клетками, в регуляции иммунного ответа на антигены (АГ) указанных микроорганизмов.

3. Исследовать кинетику образования регуляторных клеток при иммунизации мышей F.tularensis" 15 и В. abortus' 19-ВА.

4. Оценить^In vitro и in vivo взаимодействие указанных штаммов микроорганизмов с МФ интактных и иммунизированных животных и изучить функциональную активность этих клеток в процессе иммуно-

генеза с определением баланса монокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ПГЕ₂ и ФНО-а.

5. Получить набор гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) к различным поверхностным АГ возбудителей туляремии и бруцеллеза.

6. Определить серологическую специфичность и функциональную роль индивидуальных МКА в реализации противоинфекционного иммунитета, в том числе их протективный эффект и влияние на эффективность фагоцитоза.

7. Изучить влияние ишунокорригирующих препаратов на течение вакцинального процесса in vivo и в модельных опытах in vitro.

1. Продемонстрированы колебания отвечаемости ЛФЦ иммунизированных животных на поликлональные митогены и гетерологичные АГ, количественные и качественные изменения "иммунокомлетентных клеток (ИКК) мышей в процессе поствакцинального иммуногенеза.

2. Показано, что при введении экспериментальным животным ИВ наблюдается преимущественное образование антител (AT) с высокой аффинностью, в то время как живые бруцеллезные бактерии индуцируют существенные количества низкоаффинньк AT.

3. Определена функциональная значимость AT в реализации защиты против туляремии и бруцеллеза.

4. Показано влияние AT на взаимодействие живых микробных клеток F.tularensis 15 и В.abortus 19-ВА с леритонеальными макрофагами (ПМ) иммунизированных животных.

5. Подтверждена возможность получения МКА определенной специфичности методом направленной иммуносупрессии с помощью цикло-фосфана.

6. Установлена эффективность некоторых фармакологических препаратов при коррекции поствачцинальных нарушений ишуногомеос-таза иммунизированных животных.

7. Получен дополнительный к описанному нами ранее набор ач-титуляремийных МКА, направленных к небольшому количеству АГ имму-нодоминантного комплекса F. tularensis 15, ответственных за качественно однообразный спектр AT.

8. Впервые установлено, что ЖТВ индуцирует формирование в организме AT, направленных против АГ соматических клеток.

9. Впервые установлено, что введение ЗСТЕ обусловливает фор
мирование вторичного иммунодефицита по В-системе иммунитета, соп
ровождающегося снижением продукции ИЛ-5 и ИЛ-6.

10. Подтверждено, что воздействие АГ ЖТВ обусловливает в ранний лоствакцннальный период временное нарушение продукции ФНО-а,

11. Впервые установлено, что введение ЖТВ обусловливает формирование преходящего иммунодефицита по Т-системе иммунитета, сопровождающегося фазными колебаниями ответной реакции ЛФЦ на ге-терологичный АГ, увеличением активности супрессорной популяции Т-клеток и продукции ПГЕ₂.

12. Получен оригинальный набор антибруцеллезных МКА, обладающих родо-, грушо- и видоспецифичностью.

13. Показана возможность видовой дифференциации бруцелл с помощью МКА.

14. Подтверждено протективное действие антибруцеллезных AT, способствующих клиренсу крови от введенных бруцелл и уменьшению степени обсемененности селезенок.

15. Впервые установлено, что иммунизация ЖБВ сопровождается развитием глубокого поствакцинального иммунодефицита как по Т-, так и по В-системе иммунитета, заключающегося в подавлении пролиферации ЛФЦ иммунизированных животных в ответ на поликлональные активаторы и гетерологичные АГ.

16. Показано, что относительный дефицит ИЛ-2 в результате иммунизации ЯБВ обусловлен его активной рецепцией стимулированными бруцеллезнымиЛГ В-ЛФЦ.

17. Впервые установлено, что утяжеление относительного дефицита ИЛ-2, обусловленного иммунизацией ЖБВ, связано с заместительной ролью ИЛ-4, увеличением спонтанной продукции ИЛ-1 МФ, активацией продукции ИЛ-6 и ФНО-а и нарастанием количества неспецифических и ЛПС-специфических Т- и В-супрессорных клеток.

18. Показано, что индуцированные ЖБВ опсонины активно способствуют захвату микробов фагоцитами, при этом интенсифицируется процесс внутриклеточного переваривания бруцелл.

19. Подтверждено, что длительная персистенция бруцелл в клетках системы мононуклеарных фагоцитов (СМФ) приводит к формированию низкозонной толерантности, сопровождающейся снижением от-вечаемости В-ЛФЦ на гетерологичный ЛПС.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. В результате впервые проведенного комплексного сравнительного изучения формирования поствакцинального иммунитета получена отсутствовавшая до настоящего времени базисная информация о клеточно-медиаторных взаимоотношениях в процессе иммуногенеза, индуцируемого живыми микробными клетками вакцинных штаммов F. tularensis 15 и В. abortus 19-ВА, включающая сведения об этапности количественных и качественных изменений ИКК, их синтетической и иммукорегуляторной активности, механизмах формирования иммуносупрессии" при бруцеллезе и туляремии и влиянии AT на взаимодействие живых микробных клеток указанных штаммов микроорганизмов с клетками СМФ иммунизированных животных.

Результаты исследования представляют существенный интерес для понимания иммуногенеза туляремии и бруцеллеза и механизмов формирования неполной защиты от них при иммунизации применяющимися в настоящее время живыми вакцинами, что необходимо для решения важной медико-социальной задачи - оптимизации и усовершенствовании специфической профилактики туляремии и бруцеллеза и определения путей коррекции поствакцинальных и инфекционных иммунодефици-тов.

Впервые проведен расширенный анализ интерлейкиновой регуляции иммуногенеза, индуцированного АГ F. tularensis 15 и В. abortus 19-ВА, описаны и оценены продукция, баланс и взаимоотношения мо-но- и лимфокинов,,- в том числе ИЛ-І, ИЛ-2. ИЛ-4, ИЛ-5. ИЛ-6, ПГЕг и ФНО-й, в ходе развития поствакцинального иммунитета.

В экспериментальных условиях моделирования вакцинального и инфекционного процессов изучены клеточные основы гуморального иммунного ответа при воздействии микробных клеток F. tularensis 15 и В.abortus 19-ВА и аффинитет синтезируемых иммуноглобулинов. Определена функциональная значимость AT в реализации защиты против туляремии и бруцеллеза.

Высоким потенциалом практического использования обладают полученные МКА, позволяющие оптимизировать как диагностические про-. цедуры, так и работы по аффиннохроматографическому выделению антигенов, представляющих интерес в плане приготовления химических (молекулярных) вакцин. Получена и охарактеризована по эпитопной

специфичности синтезируемых иммуноглобулинов оригинальная серия гибридом-продуцентов антибруцеллезных иммуноглобулинов, продуцирующих МКА ра'зличной серологической специфичности, направленных как к общим с другими микроорганизмами (йерсиниями, франциселла-ми, холерным вибрионом, кишечной палочкой, сальмонеллами) антигенным детерминанта}.!, так и к эпитопам, экспрессировачным только на микробных клетках представителей рода Brucella. Среди них выделены гибридомы, продуцирующие МКА к видоспецифическим АГ, присущим штаммам В. abortus, и группоспецифическим эпитопам, обнаруживаемым на штаммах В.abortus et suis и отсутствующим на клетках В.melitensis. Полученные моноклональные иммуноглобулины, будучи испытаны на полевом материале в ИФА, показали высокую активность, позволяя однозначно идентифицировать род Brucella, а также судить о видовой принадлежности возбудителя. Идентифицирован ряд "про-тективных" МКА, обеспечивающих повышение клиренса крови от бру-целл, уменьшение степени обсемененности селезенки, активацию фагоцитоза, сопровождающуюся его завершенностью. Выявляемые этими иммуноглобулинами антигены могут быть использованы для конструирования химической (молекулярной) вакцины.

Гибридный клон Д10-12В, продуцирующий моноклональные IgGl к поверхностному родоспецифическому антигену возбудителей бруцеллеза, экспрессированному на микробных клетках всех представителей рода Brucella, депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур Института цитологии РАН под номером ВСКК/П/615 Д.

Отработанная технологическая схема получения продуцирующих гибридом доступна любой культуральной лаборатории. Практически важной представляется оптимизированная процедура получения продуцентов антител необходимой специфичности путем направленной имму-носупрессии с использованием циклофосфана.

Полученные данные об иммунологических сдвигах в организме экспериментальных животных позволили определить критические периоды, требующие применения иммунокорректоров. Показана возможность проведения фармакологической иммунокоррекции поствакцннальных нарушений иммуногомеостаза и эффективность некоторых иммуномодуля-торов в процессе ее проведения. Подавление отвечаемости на гете-рологичный АГ должно быть учтено при составлении плана вакцинации.

Результаты исследований, представленных в диссертации, стали основой составления "Методических рекомендаций по использованию иимуноферментного анализа для лабораторной идентификации голарктической разновидности туляремийного микроба с помощью монокло-нальных антител", утвержденных Ученым Советом Ростовского-на-Дону противочумного института в декабре 1990 года.

Видоспецифические и подзидоспецифические МКА, конъюгирован-ные с ФИТЦ, в виде "Иммуноглобулинов диагностических .туляремийных моноклональных лгаинесцирукзщкх сухих" были представлены в сентябре 1990 года на экспозиции ВДНХ "Прогрессивная технология в производстве лекарственных средств" и в 1991 году в Милане (Италия) на "Международной неделе науки" в разделе "Советская технология".

Набор антитуляремийных МКА был передан для сравнительных исследований д-ру G.Sandstrom в Университет г. Умеа (Швеция), использовался для дифференциации измененных штаммов туляремийного микроба в лаборатории академика РАМН профессора А. Г. Скавронской в НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи, а также в ряде лабораторий РПЧИ и ПЧС СКВД.

Похожие диссертации на Живые туляремийная и бруцеллезная вакцины как индукторы иммунопатологических реакций

Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организмаЧиркова Татьяна Викторовна

Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма [Электронный ресурс]Чиркова Татьяна Викторовна