Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Общая характеристика продуцента полисахаридов - бактерии рода azotobacter 11
1.1.1 Культурально- морфологические свойства бактерии 11
1.1.2 Физиолого - биохимические свойства и питательные потребности бактерии 14
1.2 Микробный экзополисахарид леван - продукт биосинтеза микроорганизма Azotobacter vinelandii 20
1.2.1 Общая характеристика микробных полисахаридов 20
1.2.2 Полисахариды, образуемые бактерией Azotobacter vinelandii 23
1.2.3 Характеристика экзополисазарида левана, продуцируемого бактерией Azotobacter vinelandii 25
1.3 Классификация древесных композиционных материалов. проблема экологической безопасности биокомпозиционных материалов 30
1.3.1 Классификация и общая технология получения древесных композиционных материалов 30
1.3.2 Экологическая чистота прессованных изделий 34
1.4 Использование полисахаридов при изготовлении древесных биокомпозиционных материалов 35
Глава 2. Объекты и методы исследования 47
2.1 Объекты исследования 47
2.2 Условия культивирования бактерии Azotobacter vinelandii Д-08 47
2.3 Определение рНкультуральной жидкости 49
2.4 Выделение экзополисахарида методом осаждения. Очистка и определение его количественного содержания 49
2.5 Проведение элементного анализа экзополисахарида 50
2.6 Определение динамической вязкости культуральной жидкости 51
2.7 Определение количества биомассы клеток Azotobacter vinelandii Д-08 52
2.8 Определение содержания сухих веществ в культуральной жидкости 52
2.9 Инфракрасная спектроскопия 53
2.10 Определение содержания сахарозы 54
2.11 Определение содержания белка 55
2.12 Условия получения прессованных биоматериалов 56
2.13 Определение физико - механических характеристик биокомпозиционных материалов 2.13.1 Определение плотности 59
2.13.2 Определение предела прочности при статическом изгибе 60
2.13.3 Определение предела прочности при растяжении перпендикулярно пласти плиты 60
2.13.4 Определение удельного сопротивления выдергиванию шурупов 61
2.13.5 Определение водопоглощения и разбухания в воде по толщине 62
2.14 Исследование структуры композиционных материалов 63
2.14.1 Метод микрорентгеновской томографии 63
2.14.2 Микроскопия биокомпозиционных материалов 64
2.14.3 Растровая электронная микроскопия 65
2.15 Статическая обработка данных 66
Глава 3. Результаты и обсуждение 67
3.1 Получение культуральной жидкости Azotobacter vinelandii Д-08 (продуцента левана) на отходах пищевой промышленности 68
3.2 Получение прессованных биокомпозиционных материалов при использовании биологического связующего, содержащего полисахарид леван и определение их физико - механических параметров 79
3.3 Получение биокомпозиционных материалов с использованием в качестве связующих лигносульфоната и культуральной жидкости, содержащей леван 101
Заключение 113
Выводы 116
Список сокращений и условных обозначений 118
Список использованных источников 1
- Культурально- морфологические свойства бактерии
- Определение рНкультуральной жидкости
- Определение удельного сопротивления выдергиванию шурупов
- Получение прессованных биокомпозиционных материалов при использовании биологического связующего, содержащего полисахарид леван и определение их физико - механических параметров
Введение к работе
Актуальность темы. Staphylococcus aureus – представитель группы оппортунистических инфекций, способный вызывать гнойно-воспалительные заболевания (Бондаренко, 1997; Roth, 1998; Дерябин, 2000; Донецкая, 2011). Поражает человека и многие виды сельскохозяйственных животных (Емельяненко, 1982; Донецкая, 2011).
Стафилококк может персистировать в организме в виде бессимптомного носительства, либо проявляться как секундарная инфекция, осложняющая течение различных патологических процессов, или вызывать самостоятельное заболевание (Сихарулидзе, 1988; Беляков, 1989; Дерябин, 2000; Доценко, 2005).
Многообразие факторов патогенности, наличие механизмов защиты от
воздействия со стороны иммунной системы, факультативно-анаэробный
метаболизм, способность осуществлять полный цикл Кребса дают этому
микроорганизму широкие возможности приспособления к существованию во
внутренней среде организма-хозяина. Стафилококки, как все паразиты и
комменсалы, развиваясь во внутренней среде макроорганизма, вынуждены
использовать те же биохимические субстраты, что и клетки организма-хозяина
(Жакоб, 1962), однако потребность в метаболитах у микро- и макроорганизма
может различаться. Вопросы взаимодействия инфекционных агентов с
факторами естественной резистентности макроорганизма являются
актуальными в области теоретической и прикладной микробиологии, классической иммунологии (Чеснокова, 2004; Фрейдлин, 2006). Успех стафилококка, как и любого микроба, при колонизации макроорганизма зависит от степени вирулентности микроба, а также от активности системы иммунитета (McManus, 1997; Тихомирова, 2005). Значительная роль в функциональности иммунных ответов принадлежит тонкой ферментативной регуляции (Рослый, 2004). В связи с этим, борьба со стафилококковой инфекцией должна основываться на комплексном подходе с рациональным использованием методов, направленных на профилактику, уничтожение возбудителя и поддержание адекватного статуса иммунной системы, с учетом регуляторной роли ферментов и субстратной зависимости стафилококка.
Необходимость снижения антигенной нагрузки при иммунизации делает актуальным создание эффективных профилактических препаратов против стафилококкозов, обеспечивающих доставку антигенов к иммунокомпетентным клеткам. Ферментативная и субстратная регуляция иммунного ответа организма хозяина и роста стафилококка может быть особенно значима для профилактики стафилококкозов и борьбы с этими заболеваниями при иммунодефицитных состояниях, либо антибиотикорезистентности возбудителя.
Несмотря на то, что S. aureus хорошо изучен, проблема стафилококкозов остается в числе важных для медицины и ветеринарии (Дерябин, 2000). Описаны как молекулярные основы патогенности стафилококков (Schneider, 1991; Thomas, 1993; Hayball, 1995; Somerville, 2003), так и механизмы их иммунорезистентности (Касымов, 1981; Nilsson, 1997).
Однако влияние метаболических субстратов, таких как пируват, -кетоглутарат, аланин и аспартат на защитные механизмы макроорганизма и рост
S. aureus изучены недостаточно, а влияние ферментов крови на биохимическую адаптацию стафилококков до сих пор практически не описано.
Все это придает актуальность изучению изменения ферментативного фона плазмы крови животных в ответ на присутствие S. aureus и влияния ферментов и амфиболических субстратов на рост стафилококков.
Цель работы: Определить комплекс биохимических показателей крови, значимых для возникновения, течения и исхода стафилококковой инфекции и иммунизации экстрацеллюлярными антигенами стафилококка.
Задачи исследования:
-
Получение поверхностных и экстрацеллюлярных антигенов клинических изолятов Staphylococcus aureus, выделенных от животных с острыми и хроническими инфекционными процессами.
-
Повышение иммуногенности экстрацеллюлярных антигенов стафилококков за счет химического синтеза карбодиимидных конъюгатов и оценка протективности иммунизации ими против стафилококковой инфекции.
-
Повышение иммуногенности экстрацеллюлярных антигенов стафилококков за счет включения их в состав липосом, изготовленных на основе поверхностных липидов штамма Escherichia coli Б-5, и оценка протективности иммунизации данными липосомами против стафилококковой инфекции с учетом ряда параметров иммунологического и биохимического ответа макроорганизма.
-
Определение связи роста культур Staphylococcus aureus in vitro с активностью ряда ферментов плазмы крови и потребности стафилококков в субстратах данных ферментов.
-
Изучение влияния аланина и аспартата на течение и исход стафилококковой инфекции в модели внутрибрюшинного заражения мышей.
Научная новизна. Впервые использован для агрегации
экстрацеллюлярных антигенов S. aureus водорастворимый 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид. Конъюгаты экстрацеллюлярных антигенов стафилококков успешно применены для иммунизации.
Впервые при изготовлении липосом были использованы поверхностные липиды клеток штамма E. coli Б-5.
Установлено, что иммунизация стафилококковыми антигенами
сопровождается изменением активности ферментов плазмы крови: повышением активности аспартатаминотрансферазы и креатинкиназы и снижением активности щелочной фосфатазы, а культивирование S. aureus в плазме крови интактных морских свинок in vitro снижает активность креатинкиназы.
Показана роль антибиотикотерапии в усилении специфического и
неспецифического иммунного ответа организма хозяина: в увеличении
бактериостатической активности плазмы крови и напряженности
постинфекционной иммунизации антигенами клеточной стенки стафилококков,
что выражается в возрастании опсонизирующих свойств плазмы крови. Терапия
амоксиклавом и цефтриаксоном усиливает иммунный ответ на
экстрацеллюлярные антигены стафилококка.
Определена зависимость роста стафилококков в плазме крови от концентрации низкомолекулярных метаболитов и активности ряда ферментов,
катализирующих реакции с участием данных метаболитов. Рост S. aureus
обратнопропорционален концентрации пирувата в пределах его
физиологического содержания в крови. Аланин и аспартат в плазме крови in vitro в концентрациях, превышающих референсные значения на 350 и 14 мкМ соответственно, способны подавлять рост стафилококка при одновременной стимуляции его фагоцитоза. Скорость роста S. aureus в плазме крови прямо коррелирует с активностью креатинкиназы и обратно – с активностью аланинаминотрансферазы.
Впервые показана протективная роль аланина и аспартата при экспериментальном стафилококкозе.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость исследования состоит в расширении представлений о взаимосвязи метаболизма S. aureus и организма-хозяина. Выявленное влияние на рост стафилококка во внутренней среде макроорганизма ряда неспецифических гуморальных факторов, таких как пируват, аланин, аспартат, АТФ, а также ферменты, катализирующие реакции с участием этих веществ, имеет как теоретическое, так и прикладное значение. Практическую значимость исследования имеют выявленные закономерности влияния аланина и аспартата на рост стафилококка и фагоцитоз микробных клеток, что может найти применение в терапии стафилококкозов. Карбодиимидные конъюгаты и липосомы, содержащие антигены стафилококков, могут быть использованы при разработке вакцинных препаратов против стафилококков и прочих патогенов.
Методология и методы исследования. Методологической основой послужили работы отечественных и зарубежных ученых в области влияния факторов специфической и неспецифической резистентности на устойчивость животных к инфекционным заболеваниям. Представленная работа основана на комплексном анализе физиологических особенностей микроорганизма и иммунных и биохимических реакций организма животных на инвазию данного микроба.
При проведении исследования и изложении материала автором были применены общенаучные методы: теоретический и методологический анализ литературных источников, экспериментальные методы исследования и сравнительный анализ полученных данных.
Указанные методы и статистическая обработка экспериментального материала позволили обеспечить объективность полученных результатов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Использование водорастворимого 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)
карбодиимида позволяет агрегировать экстрацеллюлярные антигены
стафилококка. Данные карбодиимидные конъюгаты обладают
иммунизирующими свойствами против стафилококковой инфекции.
-
Для изготовления липосом возможно использование поверхностных липидов кишечной палочки.
-
Липосомы, изготовленные на основе липидов штамма E. coli Б-5 и несущие антигены стафилококков, обладают иммунизирующими свойствами против стафилококкозов.
4. Рост Staphylococcus aureus в плазме крови связан с активностью
аланинаминотрансферазы, креатинкиназы и зависит от концентраций пирувата,
АТФ, аланина и аспартата.
5. Инъекции аланина и аспартата изменяют ферментативный фон плазмы
крови животных, повышая при этом устойчивость к стафилококковой
инфекции.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на
Международной конференции, посвященной 80-летию Самарской научно-
исследовательской ветеринарной станции РАСХН (Самара, 2009);
Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы
ветеринарии и животноводства» (Самара, 2010); Международной научно-
практической конференции, посвященной памяти А.В. Копырина «Актуальные
проблемы инфекционных и незаразных патологий животных» (Омск, 2010);
Международной научно-практической конференции «От теории – к практике:
вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов,
2011); Международной научно-практической конференции «Экологические
проблемы использования природных и биологических ресурсов в сельском
хозяйстве» (Екатеринбург, 2012); Межрегиональной научно-практической
конференции ФГБОУ ВПО Кубанского ГАУ «Актуальные вопросы
ветеринарной фармакологии и фармации», посвященной 90-летию Кубанского
государственного аграрного университета (Краснодар, 2012); I международной
научно-практической конференции «Проблемы ветеринарной медицины и
зооэкологии Российского и Азиатско-Тихоокеанского регионов (Благовещенск,
2012); IV Международной научно-практической конференции «Проблемы и
перспективы инновационного развития мирового сельского хозяйства»
(Саратов, 2013); Международной научно-практической конференции
«Современные проблемы ветеринарной онкологии и иммунологии» (Саратов,
2014); Международной конференции, посвященной 85-летию ГНУ Самарской
научно-исследовательской ветеринарной станции РАСХН «Актуальные
проблемы развития ветеринарной науки» (Самара, 2014); Российско-Китайской
научно-практической конференции по медицинской микробиологии и
клинической микологии «XVIII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационных исследований.
Личный вклад автора. Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении экспериментов, получении и систематизации данных, формулировании выводов, в апробации результатов исследования и в подготовке публикаций. Экспериментальные исследования были выполнены диссертантом лично или при непосредственном участии в составе научной группы при выполнении НИР. Автором лично проведен статистический анализ массива данных.
Работа выполнена в ФГБНУ «Саратовский НИВИ» в ходе выполнения
этапа научно-исследовательской работы: «Разработать новые и
усовершенствовать существующие средства и методы борьбы с массовыми инфекционными болезнями молодняка животных на основе изучения их
этиологической структуры, факторов патогенности возбудителей,
закономерности формирования иммунитета» в рамках плана фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Россельхозакадемии по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 годы по отделению ветеринарной медицины: «Усовершенствовать существующие и разработать новые методы, средства, технику и технологии диагностики, лечения и профилактики особо опасных и наиболее распространенных болезней животных, птиц, рыб и насекомых на основе изучения молекулярно-биологических и генетических механизмов их развития с целью получения сырья и продукции высокого санитарного качества», шифр темы 08.02.02.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитированной литературы. Работа изложена на 168 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 44 таблицами и 37 рисунками. Список литературных источников включает 249 наименований, в том числе 104 зарубежных.
Культурально- морфологические свойства бактерии
Род Azotobacter - грамотрицательные гетеротрофные бактерии, способные к азотфиксации в присутствии органических источников углерода. Они являются хемоорганотрофами и используют для роста сахара, спирты и соли органических кислот. Фиксируют N2 в присутствии 1-2% углерода со скоростью 10-20мг на 1г потребленного углевода (Шлегель, 2003). Азотофиксаторы составляют важнейшую для биогеохимической машины планеты функциональную группировку микроорганизмов (Егоров и др., 1987; Заварзин и Колотилова 2001; Peпа et al. 2003). Для азотфиксации необходимы микроэлементы (Mo, V, Ni, Fe). В качестве источников азота используют соли аммония, нитриты, нитраты и аминокислоты. Аэробы, но способны к росту и азотфиксации при пониженном содержании кислорода. Они являются мезофильными обитателями почвы, воды и поверхностей листьев. У всех видов некоторые штаммы синтезируют водорастворимые и водонерастворимые пигменты. В настоящее время в разной степени охарактеризованы 6 видов рода Azotobacter (Гусев и Минеева, 2006).
Представители рода Azotobacter способны использовать углеводы (например, маннит, сахарозу, глюкозу), спирты (в том числе этанол и бутанол) и соли органических кислот, в том числе и бензоаты, в качестве источника углерода и энергии (Лияськина и др., 2010).
В отношении температуры азотобактер является типичным мезофильным организмом, с оптимумом развития около 25-30 С. Понижение температуры азотобактер переносит хорошо, поэтому зимой даже в северных широтах численность его клеток в почве заметно не уменьшается (Ahmad et al.,2005).
Азотобактер чрезвычайно чувствителен к реакции среды. Оптимальная для его развития область рН 7,2-8,2. Однако азотобактер способен развиваться и на средах с рН от 4,5 до 9,0; кислая реакция среды неблагоприятно действует на его развитие. Из кислых почв выделяются неактивные формы азотобактера, утратившие способность связывать молекулярный азот (Clementi et al, 1999).
Эта бактерия характеризуется необычно высокой скоростью потребления кислорода. Дыхание сопровождается рассеянием столь больших порций энергии, что происходит быстрый разогрев ростовой среды (Clementi et al, 1999). Большинство азотфиксирующих бактерий не способно ассимилировать N2 в условиях высокого содержания кислорода в окружающей среде, так как нитрогеназный комплекс, осуществляющий реакцию восстановления азота, необратимо инактивируется при взаимодействии с О2. Исключением из этого правила является строго аэробный микроорганизм Azotobacter vinelandii, который эффективно фиксирует молекулярный азот даже при очень высоких концентрациях О2 в среде роста (Волова, 1999).
Источником азота для бактерии служат соли аммония, азотной и азотистой кислот, а также органические соединения (мочевина, различные аминокислоты) и N2. В качестве источника углерода азотобактер использует разнообразные органические соединения: углеводы (моно-, ди- и некоторые полисахариды - декстрин, крахмал), органические кислоты жирного и ароматического ряда, одно- и многоатомные спирты (этиловый спирт, глицерин, маннит) и другие вещества (Петенко и др., 2011). Было показано, что наилучшим источником углерода для производства экзополисахаридов является сахароза и глюкоза (Четвериков и др., 2006).
Важную роль в обмене веществ азотобактера играет кальций. Этот элемент необходим азотобактеру при питании как молекулярным, так и аммонийным азотом. Недостаток кальция в среде приводит к сильной вакуолизации клеток и их вздутию. Высокая чувствительность азотобактера к кальцию, так же, как и к фосфору, используется для определения потребности почв в известковании (Becker et al, 2002).
Фосфаты играют важную роль в продукции альгината. Уменьшение концентрации фосфатов до 0,2 - 0,7 г/л увеличивает выход полисахарида. Другим важным фактором, обеспечивающим хороший выход полисахарида, является уровень кальция (0,02 - 0,1 г/л CaCQ или другой соли кальция эквивалентно). Это улучшает и рост микроорганизмов (Larsen and Haug, 1971; Kim et al, 2006).
Некоторые летучие органические соединения (пары этилового спирта, ацетона и некоторых летучих органические кислоты) могут быть использованы в газообразном состоянии. Он не нуждается в витаминах и специальных факторах роста. Разные представители рода Azotobacter окисляют углеводы, кислоты и спирты при хорошей аэрации до ССЬ и Н2О. Их окисление происходит через цикл трикарбоновых кислот при участии соответствующих ферментов и переносчиков электронов (Волова, 1999).
Потребность в микроэлементах определяется в значительной степени геохимическими условиями существования азотобактера в почвах. Штаммы микроорганизма, выделенные из почв с высоким естественным содержанием того или иного микроэлемента, нуждаются, как правило, в более высоких концентрациях этих элементов. Микроэлементы (молибден, бор, ванадий, железо, марганец) необходимы азотобактеру в первую очередь для осуществления процесса азотфиксации (Thakre and Saxena, 2004), из которых наиболее важен молибден, входящий в состав ферментов, катализирующих усвоение азота. Для его культивирования необходима достаточная влажность, при недостатке которой большинство клеток отмирает (Гоготов, 1998; Bellenger et al., 2008).
Интересно, что радиоактивные элементы (радий, торий, уран) оказывают стимулирующий эффект на развитие азотобактера и процесс азотфиксации (Гусев и Минеева, 2006).
Бактерии способны расти при 5, 10 или 15% керамических микрочастиц (КМЧ) АЬ2Оз диаметром 400 нм и плотностью 3,96 мг/мл. Образуемый клетками альгинат прочно адсорбируется на КМЧ (2,82 мг/г КМЧ) и не смывается с них дистиллированной водой. Такое количество альгината образуют 2,82-1010 клеток, что может быть использовано для получения in situ водной суспензии КМЧ. С этих частиц бактерии легко удаляются промыванием их водой. Вязкость 5 и 10% суспензии КМЧ благодаря действию бактерий уменьшается соответственно в 4 и 60 раз (Ren etal, 1992).
Активными продуцентами экзополисахаридов являются многие представители рода Azotobacter. Азотобактер требователен к субстрату и особенно реагирует на дефицит фосфора. На бедных почвах при концентрации фосфора менее 0,2 г/л он не развивается и образует меньшее количество экзополисахарида. В связи с этим его используют в качестве индикатора на содержание в почве фосфора и калия. Азотобактер плохо развивается в кислой среде, растет при рН 5,5 - 7,8 и более влаголюбив, чем другие микроорганизмы почвы. Азотобактер широко распространен в почвах разных географических широт. Положительное действие азотобактера на растения объясняется тем, что он выделяет в окружающую среду витамины и другие биологически активные вещества: никотиновую и пантотеновую кислоты, гиббереллин, гетероауксин (Селищев, 2005).
Определение рНкультуральной жидкости
Как показали исследования, проведенные на кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии МГУ имени Н.П. Огарева, декстран можно получать, культивируя бактерии рода Leuconostoc на среде с мелассой - отходом сахарного производства. В процессе роста бактерий на среде с мелассой происходит накопление высокоразветвленных полимерных соединений -декстранов, обладающих хорошими адгезивными свойствами. Для производства клеев можно использовать не очищенный декстран, а культуральную жидкость, упаренную в 3-5 раз. Эти клеи могут найти широкое применение в различных отраслях: в производстве древесностружечных материалов и утеплителей, изготовлении бумажных изделий, склеивании различных материалов (древесных, бумажных и т.д.) (Ведяшкина и др., 2008).
Клеевые соединения находят широкое применение в различных отраслях промышленности. В настоящее время объем производства клеев составляет более 2 млрд т в год, из них основная доля приходится на синтетические разновидности. Синтетические клеи, используемые в промышленности и строительстве, являются экологически небезопасными, а производство клеев биологического происхождения сокращается за счет дороговизны и применения их компонентов в качестве пищевого сырья, а также из-за низкой водо- и биостойкости клеевых соединений. Благодаря развитию биотехнологии, в настоящее время существует возможность расширения производства клеевых композиций биологического происхождения, получаемых посредством микробиологического синтеза (Кадималиев и др., 2002). Их можно использовать как основной компонент биоклея, и как связующее для производства древесных композиционных материалов.
Образование ДСП происходит при воздействии тепла в результате перехода связующего в олигомерной форме в неплавкое и нерастворимое состояние сетчатой структуры и возникновение адгезионных связей между компонентами древесины и связующего. На направление этих процессов большое влияние оказывают условия прессования. ДСП изготавливаются горячим прессованием древесной стружки. Себестоимость изготовления древесной стружки ниже себестоимости древесного волокна (Ребрин и др., 1982; Отлев и Штейнберг, 1983).
Сущность процесса формообразования биопластиков заключается в следующем. В полость матрицы пресс-формы загружают подготовленную пресс-массу (опилки, смешанные со связующим). При замыкании пресс-формы под действием усилия пресса пуансон создаёт давление на прессуемый материал. Под действием этого давления и теплоты от нагретой пресс-формы материал размягчается и заполняет формообразующую полость пресс-формы. После определенной выдержки пресс-форма раскрывается и из неё извлекается готовая плита. Процесс отвердевания сопровождается выделением летучих составляющих полимеров и паров влаги. Для удаления газов в процессе прессования выполняют так называемую подпрессовку, заключающуюся в переключении пресса после определённой выдержки на обратный ход, в подъёме пуансона на 5-10 мм и выдержке его в таком положении в течение 2-3 с. После этого пресс-форма снова смыкается (Волынский, 2003).
Много времени и сил посвящено разработке технологии получения клеевых композиций на основе культуральной жидкости бактерии Leuconostoc mesenteroides, продуцирующей полисахарид декстран, выращенной на питательной среде, содержащей в качестве источника сахарозы мелассу. Меласса является наиболее важным побочным продуктом свеклосахарного производства. Молекулы нативного декстрана состоят из цепей, содержащих 10000 - 20000 глюкозных единиц, что соответствует молекулярной массе в несколько десятков миллионов. В зависимости от качества мелассы можно получить от 18 до 48 г/л декстрана при исходной концентрации сахара в среде для бактерии 17,5 % (Ведяшкина и др., 2005).
При получении биоклеев следует проводить модификацию полимера, составляющего клеевую основу, различными химическими веществами. С помощью модификаторов регулируют вязкость клея, адгезию к различным поверхностям, стойкость при воздействии повышенных температур (Кинлок, 1991).
Улучшение свойств полимеров может быть достигнуто путем введения пластификаторов - веществ, изменяющих вязкость и увеличивающих гибкость макромолекул. В связи с этим были изготовлены и изучены свойства клеевых композиций из культуральной жидкости, полученной при росте Leuconostoc mesenteroides СФ-4 на мелассных средах, а также клеев на основе химически модифицированной культуральной жидкости.
Использование культуральной жидкости, полученной при культивировании Leuconostoc mesenteroides в среде на основе мелассы, в качестве основного компонента биоклея нецелесообразно. При однократном нанесении культуральной жидкости, содержащей 40 г/л, склеивания не происходило. При двукратном нанесении адгезия соединяемых поверхностей достигала 160 кПа. Концентрирование культуральной жидкости упариванием позволяло увеличить содержание декстрана в 2 раза. Для повышения вязкости в культуральную жидкость добавляют карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ) в концентрации от 0,5 до 2 %.
По органолептическим показателям биоклеи имеют темно- коричневый цвет с запахом жженого сахара, вязкотекучую консистенцию при комнатной температуре. Время высыхания 40-45 минут.
Прочность склеивания во многом зависит от концентрации КМЦ в клеевой композиции. Оптимальный показатель прочности склеивания получен при добавлении в биоклей 2% КМЦ.
Повышение адгезии биоклеев на основе технического декстрана с добавлением КМЦ к различным поверхностям можно объяснить тем, что присутствие большого числа отрицательно заряженных гидроксильных групп остатков глюкозы на декстране обусловливает образование разветвленной структуры, взаимодействующей со склеиваемыми поверхностями (Ямашкин и др., 2004). Добавление КМЦ приводит к образованию дополнительных связей, что сильно повышает прочность клеевого соединения.
Определение удельного сопротивления выдергиванию шурупов
Прессованные композиционные материалы изготавливают по принятой на большинстве предприятий технологии с использованием в качестве связующего вещества фенолформальдегидных смол. Изделия строительного и бытового назначения, полученные с их использованием, имеют недостаток выделение в процессе использования токсичных для здоровья человека свободных фенола и формальдегида. Пристальное внимание к совершенствованию существующей технологии появилось после вступления в действие ГОСТ 10632-2007 и ГОСТ 10632-2014 на древесно-стружечные плиты, согласно которому эмиссия фенола из плит не должна превышать 8 мг/Ю0г абсолютно сухой плиты (ГОСТ 10632-2007,2007; ГОСТ 10632-2014, 2015). Также основной характеристикой древесных плит является прочность при статическом изгибе. Для достижения нормативных значений прочности необходимо оптимизировать технологические режимы их изготовления.
В связи с этим, поиск альтернативного связующего вещества, способного заменить синтетические смолы - актуальная задача в общей концепции сохранения экологического равновесия на планете.
На следующем этапе нашей работы мы изготавливали прессованные материалы из березовых опилок с использованием полученного биовязующего на основе полисахарида левана. У полученных плит определяли их конструкционные показатели.
Для проведении эксперимента готовили контрольную пресс-массу, состоящую из 100 г опилок и пресс-массу, состоящую из 100 г опилок и 120 мл биологического связующего в виде культуральной жидкости с вязкостью 0,44 дПасек и 1% борной кислоты в качестве антисептика. Все тщательно перемешивали и высушивали при температуре 700С в сушильном шкафу до влажности 6-8 %. Полученную пресс-массу подвергали горячему прессованию на формовочном гидравлическом прессе со встроенной системой охлаждения GT - 7014 - Н при давлении равном 20 (26,1 МПа) и 30 (39,2 МПа) тонн, в течение 10 минут при температуре 100, 120 и 1400С. Затем осуществляли кондиционирование образцов при комнатной температуре в течение суток. Целью было выявить оптимальный режим прессования, при котором показания всех параметров биокомпозиционных материалов будут наилучшими.
Результаты исследований плотностей и пределов прочности при статическом изгибе полученных образцов на основе древесных опилок представлены в таблице 3.6.
Влияние температуры и давления на плотность и предел прочности полученных биокомпозитов (продолжительность прессования 10 минут). Давление прессования, МПа Температура прессования,С Плотность, кг/м3 Предел прочности, МПа Бездобавлениясвязующего(контроль) С добавлением связующего Бездобавлениясвязующего(контроль) С добавлением связующего
Максимальный предел прочности при статическом изгибе образцов полученных без добавления культуральной жидкости - 18,2 МПа. Данное значение соответствует ГОСТ 10632 - 2014. Толщина полученных плит была от 9 до 13 мм, которая зависит от температуры и давления прессования. При увеличении температуры от 100 до 140С и давления прессовния от 26,1 до 39,2 МПа предел прочочности увеличивался. Это связано с более полным процессом поликонденсации между молекулами лигнина и фуранозного кольца, в связи со структурными и химическими изменениями лигноцеллюлозных частиц и молекулы полисахарида левана, что подтверждают наши данные ПК - спектроскопии Фурье (см. рисунок 3.7). Для плит типа Р2 (плиты для использования внутри помещений, включая производство мебели, для использования в сухихи условиях) толщиной от 6 до 13 мм предел прочности должен быть не менее 11,0 МПа. Полученные плиты обладали высокой плотностью (1311,2 кг/м3), по ГОСТ 10632 - 2014 значение не должно превышать 820 кг/м3 (550-820 кг/м3). Образцы не выдержали испытание на водопоглощение и разбухание по толщине. По ГОСТ 10632 - 2007 разбухание по толщине за 2 ч (размер образцов 25x25 мм) - не более 15%.
Отсюда делаем вывод, что для повышения основных характеристик древесно-стружечных плит, таких как прочность при статическом изгибе, плотность, и в особенности показатели водопоглощения и разбухания по толщине необходим поиск новых экологически безопасных биологических связующих.
Далее были изготовлены образцы с добавлением культуральной жидкости на основе гомополисахарида левана.
Из таблицы 6 видно, что наибольший предел прочности при статическом изгибе у биокомпозитов, полученных при 39,2 МПа и 140С. Он составил 32,4 МПа, что значительно выше контроля (18,2 МПа) и соответсвует требованиям стандарта. Минимальные же значения получились при режиме прессования 26,1 МПа, 100 и 120С (7,2 и 11,2 МПа соответственно), что не значительно превышало показатели контроля и не отвечало требованию ГОСТ 10632 -2014. Из этого можно заключить, что при увеличении давления и температуры прессования такой параметр, как прочность при статическом изгибе увеличивается. Это будет происходить до того момента, пока связующее вещество будет обладать адгезивными свойствами (пластичность, липкость, клейкость, текучесть, вязкость и др.), так как при определенной температуре полисахарид леван денатурирует и разлагается (так, например, в случае с декстраном - теряет свойства при 140С) (Ревин и др., 2010).
Известно, что плотность плит определяется содержанием влаги. Древесина представляет собой пористый материал, состоящий в основном из гидрофильных компонентов, и поэтому она всегда содержит воду. Предельное количество свободной воды зависит от плотности, т. е. от того, насколько велик объем пустот в древесине, который может быть заполнен водой (Киреева, 2005). Плотность плит изменялась незначительно по сравнению с контролем (таблица 6). Она увеличивалась с увеличением давления (p) и температуры (Т): от 1083,9 до 1443,5 кг/м3.
Одним из важнейших требований к качеству биокомпозиционных материалов является влагостойкость - это устойчивость материалов к разбуханию во влажной среде. Характерным недостатком древесины и древесных композиционных материалов является их водостойкость. Этот недостаток присущ не только массиву древесины, но и другим материалам, изготовленным на древесной основе, в том числе ДСП, с той лишь разницей, что плиты не способны восстанавливать прежнюю толщину после высыхания. Это связанно с разрушением клеевых связей частичек древесины в ДСП в процессе разбухания, т.е. явлением, называемым «распрессовкой» (Доронин, 1993). Данные исследований по водопоглощению и разбуханию по толщине образцов полученных на основе древесных опилок представлены в таблице 3.7.
Получение прессованных биокомпозиционных материалов при использовании биологического связующего, содержащего полисахарид леван и определение их физико - механических параметров
В ИК-спектрах контрольных образцов (рисунок 3.13б), полученных при прессовании опилок без ЛГС, наблюдаются полосы поглощения в области 3600 - 3000 см-1, которые обусловлены валентными колебания ОН-групп, вовлеченных в водородную связь в целлюлозе, лигнине и гемицеллюлозе, (Базарнова и др., 2002; Fengel and Wegener, 2003; Kadimaliev et al., 2015) в области 2920 см -\ 2850 см-1 -CH валентными колебаниями метильных и метиленовых групп в лигнине (Базарнова и др., 2002; Fengel and Wegener 2003), 1734 см-1 - С=О колебаниями в сложноэфирной группе гемицеллюлоз (уроновых кислот) (Базарнова и др., 2002; Muller et al., 2009), 1635 см-1 -адсорбцией О-Н групп и конъюгированных С-О связей или карбонильных и карбоксильных групп в лигнине (Pandey and Pitman, 2003), 1400 см-1 -колебаниями СН3 групп лигнина, 1247 см-1 - скелетными колебаниями сирингильного и гваяцильного ядра в лигнине, и С-Н групп гемицеллюлоз, 1043 см-1 - колебаниями ароматических С-Н связей, (Базарнова и др., 2002; Pandey and Pitman, 2003).
ИК-спектры опытных образцов, полученных прессованием опилок с ЛГС отличались от FTIR-спектров контрольных образцов и ЛГС (рисунок 3.13в). В них наблюдается снижение интенсивности поглощения и смещение полосы ЛГС в области 1205 см-1 (SOзH-группы), и в области 1091 см-1 (ОН-группы спиртов). В FTIR-спектрах контрольных образцов четкая полоса 1247 см-1, обусловленная скелетными колебаниями сирингильного и гваяцильного ядра в лигнине, С-Н групп гемицеллюлоз, переходит в плечо. При горячем прессовании происходит размягчение лигнина и ЛГС, частичное разрушение Р-О-4-связей между мономерами ароматического кольца, реакции деметилирования и окисления (Базарнова и др., 1997; Garrote et al, 2001; Sivonen et al., 2002). Это свидетельствует о том, что сульфогруппы ЛГС вовлекаются в процессы образования связей между древесными частицами и ЛГС. С учетом вышеприведенных изменений можно полагать, что в процессе горячего прессования происходит проникновение сульфогрупп ЛГС в ароматические ядра макромолекулы лигнина древесных частиц и таким образом ЛГС связывает между собой древесные частицы, вероятно, за счет слабых взаимодействий или чисто механически (Семочкин и Пашков, 2002).
Предлагаются различные варианты повышения влагостойкости биокомпозиционных материалов, полученных с применением ЛГС. Ряд авторов предлагают проводить предварительную модификацию ЛГС и древесных опилок путем окисления или введения дополнительных групп, или наряду с ЛГС использовать другие полимеры, обладающие адгезивными свойствами как с древесными частицами, так и с ЛГС (Liu and Li, 2006; Ни et al, 2011; Ни and Guo, 2013; Klapiszewski et al, 2013; Yuan et al, 2014). Однако эти способы требуют большой предварительной работы и трудоемки.
В этом плане особый интерес вызывают микробные полисахариды, в частности леван, который обладает хорошими адгезивными свойствами и благодаря наличию реакционноспособных групп может выполнить роль связующего между ЛГС и древесными частицами и повысить влагостойкость биокомпозиционных материалов (Combie, 2003; Combie et al, 2004; Haag et al, 2004; Haag et al., 2006). В связи с этим в пресс-массы перед прессованием наряду с ЛГС добавляли культуральную жидкость (КЖ), содержащую леван в концентрации 14,5 г/л, вязкостью 0,4 дПасек в различных соотношениях. Содержание белков в КЖ составляло 2,80 мг/мл, биомассы - 13,54 г/л. Режимы прессования были подобраны исходя из вышеприведенных результатов (температура 160С, давление 39,2 МПа, продолжительность 10 минут).
Физико-механические параметры биокомпозиционных материалов на основе ЛГС и левансодержащего биологического связущего
Соотношение компонентовпресс-массы - древесныеопилки : ЛГС :левансодержащеебиологическое связущее Плотность, кг/м3 Пределпрочности пристатическомизгибе, МПа Разбухание по толщине,% 10 : 1 : 4 1251,0±2,7 24,2±1,3 6,7±3,5 10 : 2,5 : 2,5 1201,0±3,8 24,6±0,8 13,3±1,1 10:4: 1 1170,0±2,5 29,8±1,7 13,9±2,3 Добавление КЖ несколько снизило прочность биопластиков, но при этом они соответствовали стандарту (ГОСТ 10634 - 88, 1991; ГОСТ 10632-2014, 2015). В то же время образцы с добавлением КЖ по влагостойкости превышали показатели образцов с применением только ЛГС почти в 2 раза и соответствовали стандарту. Основным веществом КЖ, обладающим адгезионными свойствами, является полисахарид леван. Хотя нельзя исключить и роль внеклеточных белков и биомассы бактерий.
На рисунке 3.14 представлены ИК-спектры исходных ЛГС, опилок, и образцов биокомпозиционных материалов, полученных с применением ЛГС и КЖ в качестве связующего.
ИК-спектры исходных ЛГС, опилок, и образцов биокомпозиционных материалов, полученных с применением ЛГС и КЖ в качестве связующего: а -ЛГС; б - КЖ; в - биокомпозиционный материал без связующего; г - биокомпозиционный материал с ЛГС и КЖ В ИК-спектрах КЖ присутствуют полосы поглощения в области 931 см-1 и 997 см-1, характерные для фруктозы, из которой синтезируется молекула левана (Grube et al, 2002; Abdel - Fattash et al, 2005). При горячем прессовании интенсивность поглощения при этих частотах резко снижается, и полосы переходят в плечо, что может свидетельствовать о вовлечении молекул фруктозы в образовании связей между компонентами биокомпозиционного материала (Yang et al, 2007). В ЛГС изменения происходят в тех же областях, что и при прессовании без КЖ. Согласно данным литературы леван состоит из фруктозных остатков, упакованных в сферические структуры. В отличие от других полисахаридов он практически не набухает в воде и способен образовывать кристаллы (Ananthalakshmy and Gunasekaran, 1999). Вероятно, повышение влагостойкости материалов, полученных с использованием КЖ, связано с тем, что микрокристаллы левана при прессовании, проникая в микропоры целлюлозы, снижают водопоглощение.
Для анализа структуры материалов, полученных с использованием биологических связующих в виде ЛГС и его смеси с КЖ, содержащей полисахарид леван, использовали метод сканирующей рентгеновской микротомографии (Wieland et al, 2013; Charwat-Pessler et al, 2014) и метод СЭМ. В образцах, в которых не использовали связующее, в структуре материала, имелись большое количество микротрещин, пронизывающих весь объем образца (рис. 9a). Ту же картину можно было видеть и при исследовании контрольного образца, прессованного при 180С, 39,2 МПа 5 мин (см. рисунок 3.8а).