Введение к работе
Актуальность темы. В условиях интенсификации и- индустриализации сельскохозяйственного производства широкое применение нашли химические средства защиты растений - пестициды. К 20С году мировое производство пестицидов должно достигнуть 2,5-2,7 млн. т дей--ствумего вещества. В ассортименте всех видов пестицидов большая роль отводится гербицидам - 42,6-55,6 (Унанянц, 1981).
Довольно эффективно и длительный период в сельском хозяйстве всех стран мира используются гербицида rpyna-j динитрранилина. Наиболее широко применяется для борьбы с сорняками на посевах овоанцл, сои, хлопчатника, подсолнечника и других культурах гербицид треф-лан, В настоящее время в нашей стране начато производство отечественного аналога этого гербицида - нитрана.
Долгое время применение пестицидов оценивалось лишь их экономическим эффектом, но многолетнее, широкомасштабное использование показало, что они могут наносить вред окружающей среде. Большое значение в последнее время приобретает контроль за накоплением продуктов разложения ксенобиотиков в природе, определение их токсичности, мутагенности. Для почвенных препаратов необходимо учитывать степень их токсического действия на формирование и функционирование сообществ почвенных микроорганизмов, играющих важную роль в плодородии почв. Знание основных закономерностей поведения гербицидов в природе, путей их превращения, устойчивости и токсичности образующихся в процессе деградации метаболитов необходимо при разработке рекомендаций по рациональному использованию гербицидов, как с экономической точки зрения, так и с точки зрения охраны окружающей среды.
На необходимость проведения работ по защите окружающей среды от нежелательного воздействия пестицидов указывается в Постановлении ЦК КПСС и Совета Министров СССР "С коренной перестройке дела охраны природы в стране" (1968).
Каждое природное соединение и практически все ксенобиотики подвергаются микробиологической трансформации. Микроорганизмы являются основам, определяющим звеном круговорота веществ в природе. Активное участие почвенной микрофлоры в разложении гербицида Tpef-лана и его воздействие на микрофлору, по-видимому, не является исключением из общего правила.
Пробстом (1975) предложена схема разложения трефлана в почве и воде, однако, роль микробиологического фактора в этом процессе отрицается.
Мы полагаем, что исследование взаимодействия трефлана и продуктов его трансформации с почвенной микрофлорой, определение их персистентности и токсичности представляет как теоретический, так и практический интерес.
Цель настоящей работы состоит в изучении роли микробиологического фактора в деструкции трефлана, выявлении и идентификации доминирующих продуктов биодеградации, определении их персистентности, динамики образования, токсичности, а также определении их воздействия на почвенную микрофлору.
Необходимо было решить следующие задачи:
исследовать влияние трефлана на численность микроорганизмов основных таксономических групп в почве;
определить скорость Сиодеградации и особенности сорбции трефлана микромицетами;
изучить характер и динамику трансформации трефлана под действием микроорганизмов;
выявить и идентифицировать доминирующие продукты биотрансформации препарата в культуральной среде и биомассе микромицетов;
определить персистентность выявленных метаболитов трефлана;
установить токсичность основных продуктов деградации для микроорганизмов, растений и животных.
Научная новизна. В работе впервые получены следующие данные:
установлена роль микроскопических грибов в процессе деградации трефлана;
определены основные продукты деградации трефлана в почве и жидкой культуре микроорганизмов;
определена персистентность основных продуктов деградации гербицида в почве;
. - показана токсичность продуктов деградации трефлана для животных и растений.
Научно-практическая значимость работы. Проведенные исследования имеют значение для экотоксикологической оценки влияния трефлана (нитрана) на биологические обьекты и научного обоснования рациональных и безопасных приемов применения этого гербицида. Образование в почве продуктов биотрансформации (ТР-3 и TP-I3), более пер-систентных и токсичных, чем сам гербицид, свидетельствует о необхо-
димости детального рассмотрения процессов деградации ксенобиотиков и токсикологической оценки образующихся метаболитов, при установлении предельно допустимых концентраций препаратов в почве н сельскохозяйственной продукции.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на УІ съезде Украинского микробиологического общества (Донецк, 1984), на двух Всесоюзных конференциях "Роль почвенных микроорганизмов в деградации пестицидов и охране окружающей среды" (Ленинград, 1983, 1987).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Обьем и структура работы. Диссертация состоит на введения, 5 глав, выводов и заключения; изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 24 таблицы и 23 рисунка. Список литературы включает 233 наименования, в том числе - 102 зарубежных авторов.
ОБЬЕКГІІ И МЕТОД! ИССВДОЙАШЙ
Объектом исследования служил гербицид трефлан, а также его отечественный аналог - нитран. Действующее вещество этих препаратов - 2,6-динитро-4-трифтсрметил-н.л-дипропиланшшн. Нитран и продукты его трансформации (10 метаболитов) синтезированы в Институте органической химии АН УССР. Кроме того, для сопоставления скорости деградации различных производных динитроанилина в зависимости от их химической структуры был использован новый препарат ленитран (д.в. - 3,4-диметил-2,6-динитро-Н -пентил-3-анилин) и его химический аналог - 3,4-диметил-2,6-динитрс- н -бутил-анилин. Эти гербициды представлены для исследования БНИТИГ. В работе были также использованы гербицидные смеси: трефдан + эптам, трефлан + девринол.
Влияние гербицидов на почвенную микрофлору изучали в условиг.х модельных лабораторных, вегетационных л полевых опытов на двух типах почв - лугово-черноземной и дерново-подзолистой. Вегетацисиныи огшы проводили в Институте физиологии растений и генетики All УССР в течение 3-х лет с внесением гербицидов под культуру сои (сорт Нива) и томатов (сорт Киевский ранний). Полевые опыты (3 года) ставили на Винницкой опытной станции Украинского института кормов. Для анализа использовали почву меэдурядий и ризосферы растений.
Микробиологические анализы проводили общепринятыми методами, а также методами рекомендаций Всесоюзного НИИСЭД (1981).
При постановке лабораторных опытов почву подсушивали, просеивали, доводили ее влажность до 60$ Г в. В навегку почвы (600 г)
вносили раствор гербицида, тщательно ее перемешивали и переносили в стеклянный сосуд. Инкубацию проводили при температуре 28С. В зависимости от целей опытов использовали концентрации гербицидов как на уровне производственных доз, так и превышающие их (I, 5, 10, 25, 50, 100 мкг/г).
Микробиологические анализы проводили на 1, 7, 14, 30, 60, 90-е сутки после внесения гербицида. Численность аэробных сапрофитных бактерий определяли методом посева почвенных суспензий на почвенный агар (ПА), актиномицетов - на крахмало-аммиачный агар (КАА), грибов ~ на сусло-агар (СА), нитрификаторов - на вычелоченный агар с аммонийной магниевой солью, целлюлоэоразрушающие микроорганизмы -на среду Пушкинской со стерильным фильтром (Литвинов, 1969).
Выделение культур, способных развиваться при высоких концентрациях токсиканта проводили модифицированным методом Кокка (цит.по stralka, Caropar, 1982). Определение видового состава грибов, сог-J. сно договору о научном сотрудничестве, проведено сотрудниками отдела физиологии грибов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР.
Оценку токсичности трефлана и продуктов его деградации для чистых культур бактерий, грибов и актиномицетов проводили общепринятыми методами диффузии в агар и серийных разведений.
При изучении трансформации трефлана в почве и монокультурах почвенных микроорганизмов использовали разработанные нами методы экстракции и хроматографического анализа (ГОС и ТСХ) гербицида и его метаболитов. Экстракцию токсикантов из почвы, водной среды и биомассы микроорганизмов производили органическими растворителями (метанолом, гексаном) в соответствии с подобранными условиями их максимального извлечения. Хроматографическое разделение метаболитов в тонком слое производили на пластинках "Силуфол-254" с использованием 7 различных смесей полярных и неполярных растворителей. Для определения трефлана и его метаболитов использовали газовый хроматограф "Цвет-106",оснащенный детектором постоянной скорости рекомбинации. Разделение осуществляли на колонках с силиконовыми неподвижными фазами (5/6 Е-ЗС и Ь% ХЕ-6С), нанесенными на хроматон H-AW шсз (0,16-0,2 мм). В качестве газа-носителя применяли аргон, расходы которого составляли: на подлувку - 150 мл/мин, через колонку -50 мл/мин. Температура термостата колонок - 180С, испарителя и термостата детектора - 230С. Минимально детектируемые количества метаболитов 0,1-0,6 мкг.
Шявленные в почве или биомассе микроорганизмов продукты
трансформации трефлана элюировали с пластинок "Силуфол" с толстым слоем сорбента, получали в достаточном количестве и идентифицировали. Идентификацию метаболитов проводили путем снятия ИК-спектров, гаэохроматографической характеристики - определения времени удерживания ( Rt ) на двух типах колонок, характеристики их поведения в тонком слое ( Rf ) и сопоставления всех полученных данных с характеристиками соединений-стандартов.
Для дополнительной идентификации метаболитов применяли так** метод электронных спектров диффузного отражения (ЭСДО). Использовали спектроденситометр КМ-3 "Оптон". Нижний предел определения метаболитов этим методом - 0,1 мкг яа пластинке.
При изучении способности микроорганизмов метаболизировать трефлан, их заращивали на жидких питательных средах (Чапека, Джонсона, Прадгейма), содержащих 20-50 мкг/мл гербицида, при температуре 28С, на качалке (480 об/мин). Определяли также трансформационную активность 7-1С-суточных клеток грибов, отштых стерильным фосфатным буфером и перенесенных на среду Чапека с трефланом и косуб-стратом. Учитывали убыль гербицида в культуральноп среде и мицелии, качественный и количественный состав метаболитов.Отбор проб для анализа проводили в динамике роста микроорганизмов - на 5, 1С, 15 и ЗС-е сутки.
Основная работа по трансформации трефлана микромицетачи проведена на четырех культурах пенициллов, отобранных в качестве активных биодеструкторов (їепісіІНіяп -urticae шт. 2850, їепісіІНит Іапозшл шт. S64C, їепісіїїіит wortmunnii щт. 12473, Penioilli-um ехрапзшп шт. 134). Определение токсичности метаболитов трефлана для растений проводили общепринятыми методами, Среднесмертельную дозу для животных определяли на шшах, расчеты ЛД^о производили по методу В.Б.Прозоровского (1969). Математическую обработку данных проводили методами вариационной статистики (Молостов, ІШ5).