Введение к работе
Актуальность темы. Иигеллезы, вызванные бактериями Зонне и Флекснера, являются опасными инфекционными заболеваниями, распространенными в странах Европы, Америки и Африки. Они характеризуются разнообразием клинических Форм и значительной частотой осложнений. Данные инфекции представляются слабоуправляемыми. трудно поддающимися как эпидемиологическому контролю, так и эпидемиологическому наблюдению.
Не достаточно решены вопросы, связанные с обнаружением итаммов иигелл в высевах из организма людей. Очень высока потребность в разработках диагностических реагентов нового типа, позволяющих как обнаруживать колонии иигелл на средах, так и определять присутствие бактериального материала в полимеразной цепной реакции.
В последние годы проведен ряд работ по изучению микробиологии и эпидемиологии яигеллезов на основании анализов выделенных штаммов по профилю плазмидной ДНК. Однако до сих пор не ясно, присутствие каких плазмид обязательно для іигелл Зонне и Флекснера как биологических видов, а какие плазмиды характеризуются вариабельностью и могут быть использованы как эпидемиологические маркеры. Не решена задача эффективного выделения плазмиды вирулентности размером 180 тысяч пар оснований (т.п.о.).
Прояснение этих проблем имеет существенное значение как для молекулярной эпидемиологии, так и для диагностики иигеллезов.
Цель работы: оптимизация методов выделения и изучение плазмидной ДНК возбудителей дизентерии Зонне и Флекснера, обнаружение закономерностей и выявление особенностей в отношении состава их плазмид.
Задачи работы: 1) сравнительный анализ эффективности выделения крупномолекулярной плазмидной ДНК из неочиценннх и очиаенных ие-лочных лизатов,
-
получение плазмидограмм коллекционных штаммов иигелл Зонне и Флекснера, выделенных в различных географических зонах и в различные сроки,
-
группировка плазмид шигелл Зонне и Флекснера на основании схожести их молекулярных масс,
-
сопоставление итаммов шигелл Зонне и Флекс-нера по составу их плазмид,
-
выявление итаммов Зонне и Флекснера с "минимальным" плазмидным набором как возможных источников плазмидного материала с цельи получения зондов для обнаружения шигелл.
Научная новизна. Впервые определен профиль коллекционных штаммов Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.ft. Тарасевича, в том числе эталонных штаммов различных подтипов шигелл Флекснера. Подтверждено потенциальное сходство плазмидного состава штаммов, выделенных в разные десятилетия.Охарактеризованы диапазоны колебания количества плазмид на клетку, описаны группы плазмид по степени близости их молекулярных масс, дифференцированы полиплазмидные и од-ноплазмидные штаммы. Доказана возможность гибридизации малой плазмиды шигелл Флекснера 3,5 т.п.о. с тотальной ДНК штаммов шигелл Зонне. Оптимизированы условия для выделения крупномолекулярных плазмид вирулентности шигелл.
Практическое значение. Работа имеет значение для понимания принципов организации генома шигелл Зонне и Флекснера, выявления его стабильных и вариабельных частей. Оптимизированные условия для выделения плазмид вирулентности важны для генно-инженерных работ и работ по генетическому типированию. Обнаруженные одноплазмидные штаммы шигелл Зонне и Флекснера являются удобными источниками получения плазмидного материала для подробного изучения и применения в диагностике.
Результаты работы определяют направления дальнейших исследований плазмид в ракурсе клональной концепции в качестве эпидемиологических маркеров.
Положения, выносимые на замиту:
существование в клетках шигелл Зонне и Флекснера 4 групп плазмидной ДНК на основании степени близости их молекулярных масс: плазмиды малой, средней, большой и очень большой молекулярной массы;
существование полиплазмидных и одноплазмидных изолятов шигелл
Зонне и Флекснера;
наличие штаммов шигелл Зонне II фаза Llnde и шигелл Флекснера 232078 с одной плазмидой малой молекулярной массы, которая мояет быть получена классическими методами выделения ДНК:
отнесение иигелл Зонне и Флекснера к биологическим видам с постоянным присутствием плазмид, а плазмид малой молекулярной массы на основании их существования у всех изученных изолятов, в том числе одноплазмидных штаммов, - к категории "обязательных" плазмид;
возмояность использования "обязательных" плазмид в качестве потенциальных источников для получения зондов, гибриди-эующихся с ДНК иигелл.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 20 оригинальными фотографиями, отранающими плазмидные портреты штаммов шигелл Зонне и Флекснера, полученными с использованием различных методов выделения ДНК.