Введение к работе
Актуальность проблемы. Добыча нефти и газа на основных материковых месторождениях в последнее время неуклонно снижается. Вероятность открытия новых крупных углеводородных месторождений на континенте снизилась уже к началу 70-х годов (Лесихина и др., 2007). Вместе с тем, зона арктического шельфа России является источником колоссальных нефтегазовых ресурсов, освоение которых уже началось. В связи с этим возросла вероятность нефтяных разливов, способных нанести непоправимый ущерб хрупкой природе Арктики. Для сохранения природного потенциала арктического региона и поддержания стабильности северных экосистем необходима разработка и внедрение новых экологически безопасных способов борьбы с последствиями возможных нефтяных и топливных разливов.
В северных районах, где теплый период года непродолжителен, процессы биодеградации, в которых участвуют аборигенные углеводородокисляющие (УВО) микроорганизмы, не успевают развернуться в полной мере (Хмурчик, Максимович, 2006). Поэтому при появлении там аварийных нефтяных разливов потенциала самоочищения экосистемы недостаточно для их эффективной утилизации. В настоящее время в мировой практике успешно применяют биопрепараты на основе микроорганизмов, утилизирующих углеводороды (УВ). Однако биопрепараты с заявленным широким диапазоном «рабочих» температур имеют существенный недостаток - медленную скорость утилизации углеводородных загрязнений при низких температурах и, как следствие, малую эффективность. Микроорганизмы в составе таких продуктов не приспособлены к деградации нефти в условиях Арктики, о чем сообщается в обзорах и отчетах, посвященных существующим биопрепаратам (Аушева, 2005; Аушева и др., 2007; Нечаева и др., 2006). При внесении в загрязненную экосистему ассоциации штаммов, способных разрушать нефть и нефтепродукты, но не свойственных экологическому сообществу данного местообитания, местная микробиота создает им серьезную конкуренцию, что приводит к замедлению процессов жизнедеятельности вносимой ассоциации, ее вытеснению местным, более сильным сообществом, адаптированным к данным источникам субстратов и геохимическим условиям (Власов и др., 1999). Поэтому применение микроорганизмов, выделенных непосредственно из загрязненных нефтью и нефтепродуктами объектов Крайнего Севера, наиболее целесообразно, поскольку они обладают специфичностью ферментных систем к биодеструкции УВ и адаптированы к факторам окружающей среды. Таким образом, приоритетным в данном контексте становится поиск морских психрофильных и психроактивных микроорганизмов, обладающих высоким деструктивным потенциалом в отношении УВ нефти в условиях низких температур, перспективных для включения в состав биопрепарата для очистки акваторий северных морей от возможных нефтяных загрязнений.
В настоящее время работы, посвященные исследованиям психрофильных и психроактивных микроорганизмов-деструкторов нефтяных загрязнений, выделенных из арктических регионов, единичны. Комплексные исследования морских микроорганизмов различных систематических групп, касающиеся не только изучения их функциональной активности в отношении УВ нефти, но и вопросов подбора эффективных способов и условий их длительного сохранения, оценки их выживаемости в процессе хранения, сохранения биологической активности и способности к деградации УВ в условиях низких (положительных) температур после хранения особенно актуальны.
Цель данной работы - выделение и оценка биотехнологического потенциала микроорганизмов, способных к деструкции УВ нефти в условиях низких температур и умеренной солености, как перспективных компонентов основы биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязненной морской среды в климатических условиях северных регионов.
Задачи исследования:
-
Провести выделение и скрининг УВО микробных сообществ и чистых культур микроорганизмов из образцов нефтезагрязненного материала северных регионов;
-
Провести оценку УВО и биоэмульгирующей активности выделенных микробных сообществ и чистых культур микроорганизмов;
3. Провести подбор методов долговременного хранения отобранных микроорганизмов и
сравнительную оценку их жизнеспособности после процессов консервации и хранения.
Научная новизна работы. Разработан новый способ выделения чистых культур микроорганизмов, активных в отношении УВ, по показателю осветлений участков на целлюлозных фильтрах с УВ нефти, апплицированных на поверхность колоний микроорганизмов на плотной питательной среде. Появление зон осветления является свидетельством проявления их биоэмульгирующей и УВО активности.
С помощью разработанного метода впервые из состава природных микробных сообществ макрофитов Белого моря выделен психроактивный вид УВО микроорганизмов Nocardia coeliaca, а из сообществ Баренцева моря - виды-нефтедеструкторы Arthrobacter rhombi, Salinibacterium amurskyense, Shewanella vesiculosa.
В лабораторных экспериментах выявлен высокий окислительный потенциал (до 60%) и биоэмульгирующая активность (до 50%) индивидуальных штаммов морских микроорганизмов в условиях низких температур и солености 30 г/л NaCl. Показана способность выделенных микроорганизмов к использованию широкого спектра УВ при 4С (в том числе ароматических и полиароматических соединений, нефтепродуктов) и образованию внеклеточных и внутриклеточных поверхностно-активных веществ (ПАВ).
В рамках комплексного подхода к разработке биопрепаратов для ремедиации нефтезагрязненных акваторий определены условия длительного сохранения морских микроорганизмов-деструкторов и выявлена их высокая жизнеспособность после хранения. Показано, что для успешного прогнозирования сроков хранения некоторых грамотрицательных психроактивных микроорганизмов методом ускоренного хранения следует использовать более низкие температуры хранения, чем для мезофильных представителей.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа расширяет представление о разнообразии представителей морского бактериопланктона и эпифитона Белого (Кандалакшский залив) и Баренцева (Кольский залив) морей. Разработанный оригинальный метод выделения микроорганизмов, активных в отношении УВ, может быть использован другими исследователями при выделении микроорганизмов в широком температурном диапазоне. Показано, что бактериальные штаммы, изолированные из нефтезагрязненных проб биоматериала арктического шельфа, не менее активны в процессе деструкции УВ нефти по сравнению с микроорганизмами Каспийского моря, что еще раз доказывает необходимость поиска и селекции активных нефтедеструкторов в регионах их предполагаемого применения для биоремедиации загрязненных экосистем. Проведенные исследования позволяют рекомендовать выделенные микроорганизмы для создания
препарата для биоремедиации нефтяных загрязнений в условиях Крайнего Севера.
Подобраны условия хранения морских микроорганизмов, обеспечивающие высокую численность и деградативную активность клеток в отношении УВ. Для длительного сохранения коллекций психроактивных микроорганизмов предпочтительнее использовать метод криоконсервирования, обеспечивающий выживаемость клеток до 90%. В перспективе получения товарной формы биопрепарата более подходящим способом сохранения биомассы является лиофильное высушивание в присутствии 10% сухого обезжиренного молока (СОМ) и 7,5% сахарозы.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); VIII молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2012); Международной конференции «Биодиагностика в экологической оценке почв и сопредельных сред» (Москва, 2013); 6-й Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2013); XII научной конференции "Морская биология, геология, океанология - междисциплинарные исследования на морских стационарах", посвященной 75-летию Беломорской биологической станции им. Н.А. Перцова (Москва, 2013); XX, XXI, XXII, XXIII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013, 2014, 2015, 2016 гг.); 5-м Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2015).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 научных работ, из них 3 статьи в изданиях из Перечня ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 372 наименования. Работа изложена на 218 страницах, содержит 30 рисунков и 20 таблиц.