Введение к работе
Актуальность темы. К настоящему времени антигенный состав сибиреязвенного микроба изучен недостаточно. Особенно мала информация о белковых антигенах клеточной поверхности.
Иммунохимическими и электрофоретическими исследованиями в экстрактах дезинтегрированных клеток Bacillus anthracis выявлено не менее 20 белковых антигенов с м.м. 10-200 кДа (Митин, 1981; Никитин, 1981; Лопаткин с соавт, 1985; Ezzell, Abshire, 1988; Quinn et al„ 1989; Farhaus, 1995). Несомненно, что выявленные антигены оказывают непосредственное влияние на иммуногенез, патогенез заболевания и приобретают все большее значение при конструировании новых диагностических и профилактических препаратов. Эти антигены высокоиммуногенны и при иммунизации ими животных обеспечивают получение высокоактивных иммунных сывороток. К сожалению, последние нередко реагируют с антигенами не только сибиреязвенного микроба, но и близкородственных сапрофитов. В последние годы получены данные о наличии в клеточных структурах сибиреязвенного микроба высокоиммуноген-ных видоспецифических белковых антигенов, однако отсутствие надежных приемов выделения и очистки этих антигенов служит препятствием для их практического применения.
Общеизвестно, что живая споровая сибиреязвенная вакцина по защитной эффективности превосходит химические вакцины, которые в качестве основного иммунизирующего компонента содержат протективный антиген (ПА). Однако для создания относительно прочного иммунитета требуется многократное введение химической вакцины (Harrison, 1980), но и при этом не исключена возможность прорыва иммунной защиты (Little et al., 1986; Ivins, 1994). По этой причине предполагается, что химическая вакцина против сибирской язвы должна содержать, кроме компонентов токсина, стимулирующих антитоксический иммунитет, другие антигены, которые участвуют в формировании антибактериального иммунитета (Борисов с соавт., 1985; Little et al., 1986; Turnbull et al., 1988; Perard et al., 1995).
Таким образом, представляется актуальным изучение антигенной структуры сибиреязвенного и близкородственных микробов, поиск, выделение и очистка видоспецифических, в том числе структурных белковых, антигенов и изыскание возможности их применения для усовершенствования методов диагностики и профилактики сибирской язвы.
Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являются сравнительное изучение антигенной структуры В. anthracis и близкородственных сапрофитов и оценка возможности использования выделенных очищенных антигенов сибиреязвенного микроба для конструирования диагностических и профилактических препаратов. В связи с этим в работе решались следующие задачи:
-
Разработать эффективные способы экстракции поверхностных белковых антигенов В. anthracis.
-
Провести сравнительное изучение антигенного состава экстрактов клеток возбудителя сибирской язвы и близкородственных сапрофитов с целью выявления видоспецифических антигенов.
-
Разработать высокоэффективные способы изоляции и очистки антигенов сибиреязвенного микроба.
-
Оценить пригодность очищенных сибиреязвенных антигенов для конструирования диагностических и профилактических препаратов.
Научная новизна работы.
1. Впервые в экстрактах вегетативных клеток В. anthracis обнаружены специфические соматические сибиреязвенные антигены белковой природы с м.м. 30 и 92 кДа (белки В и С соответственно), разработаны способы их очистки и охарактеризованы физико-химические, иммунохимические и биологические свойства. Разработан эффективный одноэтапный способ очистки протек-тивного антигена (ПА) и отечного фактора (ОФ) - компонентов сибиреязвенного токсина. Способы очистки антигенов защищены двумя авторскими свидетельствами на изобретение.
-
Впервые обнаружено, что соматический белковый антиген с м.м. 92 кДа (белок С) обладает протективной, сенсибилизирующей и аллергенной (типа ГЗТ) активностью.
-
Показан синергизм действия белка С, ПА и ОФ в процессе специфической иммунизации животных, найдены эффективные иммуностимуляторы растительного и бактериального происхождения.
Практическая значимость работы.
На основе белка С, ПА и ОФ сконструирована комплексная химическая вакцина, по протективной активности превосходящая живую споровую сибиреязвенную вакцину. Белок С рекомендован в качестве антраксина - более эффективного, чем коммерческий антраксин. На основе антител против белков В и С получены флуоресцирующие сыворотки, по чувствительности и специфичности превосходящие одноименные коммерческие диагностикумы. Разработан быстрый эффективный способ получения из коммерческого сибиреязвенного у-глобулина специфических антител, на основе которых сконструирована высокочувствительная специфическая иммунопероксидазная тест-система.
Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором Иркутского противочумного института "Методические рекомендации по оценке биологической активности сибиреязвенного аллергена на белых мышах" (протокол № 7 от 26.06.1986), "Методические рекомендации по использованию реакции альтерации нейтрофилов и лизиса лейкоцитов для выявления сенсибилизации к сибиреязвенному аллергену" (протокол № 3 от 07.02.1986), "Методические рекомендации по получению и использованию высокоактивных иммунных сывороток к соматическим белковым антигенам сибиреязвенного микроба для индикации и идентификации возбудителя (протокол № 6 от
ного микроба для индикации и идентификации возбудителя (протокол № б от 30.06.1994), НТД на иммуноферментную систему для индикации и идентификации В. anthracis (протокол № 3 от 06.03.1990).
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Клеточная поверхность возбудителя сибирской язвы в вегетативной форме содержит по меньшей мере два видоспецифических белковых антигена с м.м. 30 и 92 кДа.
-
Использованные препаративные методы позволяют получить очищенные белковые антигены с м.м. 30 и 92 кДа в количествах, достаточных для практического применения.
-
Очищенный белковый сибиреязвенный антиген с м.м. 92 кДа:
обладает протективной активностью, сопоставимой с активностью экстрацеллюлярного антигена - протективного компонента (ПА) сибиреязвенного токсина;
принимает участие в формировании гуморального и антибактериального иммунитета;
вызывает сенсибилизацию экспериментальных животных и стимулирует гиперчувствительность замедленного типа;
может быть использован в качестве диагностического препарата (ант-раксина).
4. Флюоресцирующие иммунные сыворотки против очищенных сома
тических антигенов позволяют надежно дифференцировать В. anthracis от
близкородственных сапрофитов.
Работа выполнена в лаборатории зоонозных инфекций Иркутского противочумного института в рамках тем: "Выделение и изучение специфических антигенов из экстрактов вегетативных клеток Bacillus anthracis СТИ-1"(' научный руководитель канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник Соркин Ю.И., № ГР 01860020885), "Усовершенствование методов экспресс-диагностики сибиреязвенной инфекции и индикации возбудителя во внешней среде на основе специфических соматических сибиреязвенных антигенов"(научный руководитель канд. мед. наук, ст. науч. сотрудник Соркин Ю.И., № ГР 01910033749).
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции специалистов противочумных учреждений (Иркутск, Россия, 1984), XII Пленарном заседании междуведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой при Госагропроме и Минздраве СССР (Воронеж, Россия, 1986), 2-й Всесоюзной конференции "Бактериальные токсины" (Юрмала, Латвия, 1989), Всесоюзной конференции "Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций" (Ставрополь, Россия, 1991), Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, Россия, 1993), Российской научно-практической конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болез-
(Омск, Россия, 1993), Российской научно-практической конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных инфекционных болезней" (Иркутск, Россия, 1994), научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока (Иркутск, Россия, 1984-1996).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 24 работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 171 странице машинописного текста, включает 15 таблиц и 27 рисунков. Список литературных источников содержит 217 наименований, в том числе 117 зарубежных.