Введение к работе
Актуальность темы. В последний годы с развитием биотехнологии повысился интерес к микроорганизмам - продуцентам внеклеточных ферментов. Внеклеточные бактериальные ферменты, благодаря ряду своих свойств - выделению в среду и связанной с этим относительной легкостью очистки и тестирования, стабильности и низкой молекулярной массе, являются хорошей моделью для решения фундаментальных и прикладных проблем белковой химии и энзимологаи.
Среди прокариот наиболее удобными объектами для изучения и промышленного использования являются представители рода Bacillus, поскольку они не патогенны и легко культивируются.
Наибольшее внимание привлекают ферменты, гидролизующие различные питательные вещества в среде. Большинство субстратов этих ферментов не потребляются клеткой, тогда как продукты их гидролиза являются для нее источником углерода, азота, фосфора. Среди гидролитических ферментов необходимо назвать нуклеазы, протеазы, фосфогидролазы, среди которых в настоящее время особый интерес вызывают фосфатазы. Они интересны как для сравнительного анализа свойств секретирусмых гидролаз бактерий, так и для изучения общих закономерностей биогенеза, включая общие пути регуляции синтеза всего спектра этих ферментов.
Цель и задачи исследования. Данная работа проведена с целью создания эффективного метода выделения и очистки нового фермента - внеклеточной щелочной фосфатазы В.intermedins и изучения свойств этого фермента.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
-
Поиск активных продуцентов щелочной фосфатазы среди антибиотикоустойчивых штаммов B.intermedius.
-
Разработка лабораторного метода выделения и очистки фосфатазы из культуральной среды бактерий и получение гомогенного препарата фермента.
-
Изучение основных физико-химических и каталитических свойств бациллярной фосфатазы.
Научная новизна работы. Впервые обнаружен, ранее не изученный фермент - внеклеточная щелочная фосфатаза B.intermedius. Отобран
стрегпомшгянустойчивый штамм B.intermedius S3-19, обладающий высокой продукцией фермента. Разработан эффективный лабораторный метод препаративного получения гомогенного препарата бациллярной щелочной фосфатазы из фильтратов культуральных сред микроорганизмов. Проведено изучение физико-химических и каталитических свойств фосфатазы B.intermedius S3-19, которые дополняют сведения по биохимическим свойствам этой группы бациллярных ферментов. Сравнительная характеристика биохимических свойств выделенного нами фермента с описанными в литературе фосфатазами бацилл указывает на наиболыпее сходство с APase ГУ B.subtilis (Hulett et. al., 1990). Это вызывает особый интерес, в связи с тем, что B.subtitis используется для продукции чужеродных белков. Однако, при клонировании часто возникают проблемы связанные с ограниченными возможностями секреции у этого вида бацилл. Поэтому другой вид с подобным ферментом может оказаться более перспективным в этом отношении. Изучение биохимических и каталитических свойств является первым этапом в исследовании фермента, что позволит также в дальнейшем использовать B.intermedius в качестве модели для установления молекулярных механизмов биосинтеза и секреции внеклеточных белков.
Практическая ценность работы. Возможность получения в гомогенном состоянии внеклеточной щелочной фосфатазы B.intermedius S3-19 и ее характеристика позволят получить новые данные о структуре фермента, его взаимосвязи с другими фосфогидролазами, а также подойти к изучению вопросов регуляции биосинтеза и молекулярных механизмов секреции.
Изучение процесса секреции у B.intermedius представляет интерес с позиции использования штамма в качестве продуцента гомологичных и гетерологичных белков. В настоящее время бациллы часто используют для продукции чужеродных белков. Из всех представителей рода Bacillus достаточно изучены только B.subtilis и BMcheniformis, но они не удовлетворяют потребности этого направления. Поэтому встает необходимость в изучении других представителей рода.
В результате проведенной работы выделена и очищена до гомогенного состояния неспецифическая фосфатаза, которая может быть применена в
практике научных исследований в биотехнологии, генетике и молекулярной биологии.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на Конференции Российской Федерации "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993), на IV Международной конференции по биотехнологии (Мельбурн, 1995), на Итоговой научной конференции КГУ (Казань, 1995).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.