Введение к работе
Актуальность проблемы
Многие патогенные штаммы E.coli обладают способностью вызывать гемолиз эритроцитов животных и человека. Эта способность связана с секрецией мембраноповреждающего токсина - а-гемолизина. Он является наиболее интенсивно изучаемым белком, так как часто бывает причиной воспалительно-дегенеративных заболеваний.
Важность исследования а-гемолизина связана с тем, что он - один из немногих белковых продуктов кишечной палочки, способных секретироваться в среду, минуя периплазматическое пространство.
Исследование механизмов секреции а-гемолизина отстает от интенсивно изучаемых эукариотических систем транспорта белков, поэтому изучение функций вспомогательных белков является актуальной задачей решения фундаментальных проблем секреции белков. Понимание механизма секреции белков в среду и создание генно-инженерных систем транспорта имеет не только общебиологическую значимость, но и способствует развитию биотехнологии и промышленной микробиологии.
Использование генов вспомогательных белков, направляющих транспорт секретируемых продуктов, минуя периплазматическое пространство, возможно приведет к созданию технологически перспективной векторной системы E.coli, аналогичной системе экспрессии-секреции граммположительных бактерий.
Успех создания высокоактивных штаммов суперпродуцентов белковых продуктов клонированных генов во многом зависит от уровня изучения влияния рекомбинантных плазмид на биологические свойства клеток-носителей. Выяснение механизма воздействия плазмид гемолиза и плазмид, несущих гены вспомогательных белков, будет иметь значение не только для изучения
2 регуляции факторов патогенности, изыскания методов борьбы с токсинами, но и для культивирования штаммов-продуцентов различных белков.
В настоящее время известно, что транспортный белок HlyB, образующий канал в клеточной стенке для выведения сс-гемолизина, имеет высокую степень гомологии с Р-гликопротеином - белком мембран опухолевых клеток, отвечающим за выведение химиопрепаратов и антибиотиков из раковых клеток. Следовательно, изучение организации и функционирования HlyB позволит подойти к решению некоторых задач в проблеме резистентности опухолей к химиопрепаратам.
Цель її основные задачи
Целью настоящей работы явилось определение роли вспомогательных белков системы а-гемолизина в его секреции и влияние их на физиологические параметры и другие функции клетки.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- клонирование области генов, ответственных за секрецию токсина в
среду, в различных векторах с эффективной системой экспрессии генов;
- определение влияния рекомбинантных плазмид, содержащих ЫуВ и
hlyD-гены, на ростовые характеристики клстки-хозянна и клеточный цикл
бактерий;
- выявление влияния плазмид, содержащих гены, ответственные за
транспорт токсина, на устойчивость клеток-хозяев к антибиотикам и
противоопухолевым препаратам;
- использование системы, несущей вспомогательные белки а-гемолизина,
для тестирования противоопухолевых препаратов, способных преодолевать
барьер химиорезистентности;
- изучение секреции а-гемолизина в Lon-мугантах E.coli. Научная новизна и теоретическая значимость:
с помощью методов генной инженерии сконструированы плазмиды с генами вспомогательных белков а-гемолизина, проведено картирование полученных рекомбинантных молекул.
впервые установлена зависимость уровня экспресин ЫуВ и hlyD от ориентации проклонированного BglII-фрагмента относительно lacZ-промотора;
впервые выявлена способность плазмид, несущих гены ЫуВ и hlyD, удлинять продолжительность лаг-фазы и уменьшать суммарное содержание ДНК в клетках E.coli;
обнаружена повышенная чувствительность штаммов E.coli, несущих гемолитические плазмиды, к канамицшгу, стрептомицину и сизомицину;
- выявлено новое свойство плазмид, несущих гены ЫуВ и hlyD
увеличивать резистентность штаммов E.coli к канамицину, стрептомицину,
сизомицину и противоопухолевым препаратам;
- впервые установлено функциональное сходство между HlyB-белком и Р-гликопротеином - мембранным белком опухолевых клеток, ответственным за множественную лекарственную устойчивость;
предложен новый микробиологический способ тестирования противоопухолевых веществ, способных преодолевать барьер химиорезистентности;
- изучена секреция гемолизина в Lon-мутантах и установлена связь
секреции токсина сделением клетки.
Практическое значение работы:
предложен... микробиологический способ тестирования
химиопрепаратов, способных воздействовать на химиорезистентную опухолевую клетку.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
В рскомбинантных плазмидах рМ5, рМ8, рМ13 проклонированы ЫуВ и hlyD-гены, ответственные за транспорт а-гемолизина за пределы бактериальной клетки.
-
Плазмида pM13AR, имеющая делецию HindHI-фрагмента, содержит ген ЫуВ транспортной системы а-гемолизина.
-
Разный уровень гемолитической активности полученных плазмид связан с неодинаковой экспрессией генов ЫуВ и hlyD, причиной которой является разная ориентация фрагмента, содержащего исследуемые гены относительно lacZ-промотора.
-
Ген hlyD регулирует экспрессию генов в плазмидах и влияет на уровень белкового синтеза на исследуемых матрицах.
6. Плазмиды рМ5, рМ13, pM13AR влияют на физиологические процессы,
протекающие в клетках E.coli. Они удлиняют продолжительность лаг-фазы и
снижают содержание суммарной клеточной ДНК.
7. Способность плазмиды, содержащей ген hlyD, увеличивать
устойчивость клеток E.coli к противоопухолевым аитибиогикам отражает
функциональное сходство между HlyB белком и Р-гликопротеином - белком
мембран опухолевых клеток.
Апробация диссертации и публикации
Материалы диссертации доложены н представлены на студенческих конференциях Дня науки Кубанского медицинского института им. Красной Армии ( г. Краснодар, 1989, 1991, 1992). Основные результаты диссертации изложены в трех научных публикациях. По материалам диссертации получено два патента. Апробация диссертации прошла на совместном заседании кафедры микробиологии, иммунологии, вирусологии, кафедры клинической иммунологии и лабораторного дела ФППВ, Центральной научно-исследовательской лаборатории Кубанской Государственной Медицинской
5 Академии, кафедры генетики и микробиологии Кубанского Государственного Университета 17 апреля 1997 года.
Структура и объем работы