Введение к работе
Актуальность проблемы. Острые бактериальные кишечные инфек- ции. в том числе дизентерия. . представляют серьезную проблему здравоохранения ввиду высокой заболеваемости и смертности, особенно среди детей, и большой социально-экономической значимости [В.И.Покровский. 1995. М.И.Наркевич. Г.Г.Онищенко, 1991. И.Л.Ша-ханина. Т.П.Чернова. 1990, Доклад ВОЗ, 1991].
Одной из ключевых задач в решении этой проблемы является выяснение механизмов и закономерностей взаимодействия патогенных бактерий с организмом и определение роли факторов патогенности возбудителя- в развитии иммунных реакций.
Проведенные в последние годы исследования, посвященные выявлению значения вирулентности возбудителей кишечных инфекций в иммунитете, показали, что различные по вирулентности штаммы шигелл оказывают разнохарактерное по выраженности и направленности воздействие на иммунную' систему. Вирулентные штаммы шигелл вызывают изменения, выражающиеся, в частности, в стимуляции стволовых кроветворных клеток в направлении Т-клеточного звена иммунитета и гемопоэза. усилении гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), торможении антителорбразования, а также колейкомогенном действии в присутствии вируса лейкоза Раушера [Ю.А.Белая, 1982, Ю.А.Белая с соавт., 1987, А.В.Санин с соавт., 1988, Т.Н.Николаева с соавт.. 1991].
Установлено также, что вирулентные штаммы вызывают угнетение формирования иммунологической памяти [А.Ф.Фролов. В.А.Борисов. 1984. 1988].
Авирулентные штаммы шигелл. напротиз. стимулируют преимущественно функции В-клеточного звена иммунитета, вызывая умеренную стимуляцию гемопоэза и ГЗТ. Введение живой дизентерийной вакцины из аттенуированных авирулентных мутантов Shigella flexneri 2а 516М тл S.sonnei 6S вызывает выраженный профилактический и им-мунотерапевтический эффект на людях [Ю.А.Белая, 1970,'J0.А.Белая с соавт.. 1985. 1997. 1988. Ш.Назаров. 1982. Б.Вабажанов, 1984. Г.В.Султанов, 1981, А.В.Буркин, 1989].
Известно, что при инфекционных заболеваниях, характеризующихся внутриклеточные паразитизмом, важную роль играют макрофаги.
Шигеллы и сальмонеллы являются факультативными внутриклеточ-
- 2 -ными паразитами. Исследованию мононуклеарной фагоцитирующей системы (МФС) при кишечних инфекциях посвящено достаточно большое число работ [Е.Д.Равич-Биргер. 1967, С.М.Самбуров. 1979. И.С.Фрейдлин. 1984. Петровская В.Г.. Бондаренко В.М.. 1994. G.B.Mackanes, 197J]. Однако значение вирулентности возбудителей кишечных инфекций и их отдельных факторов патогенности в макрофа-гальной реакции целенаправленно практически не исследовалось. До начала наших исследований имелись лишь единичные работы в этом направлении [Ю.А.Белая и др.. 1968. Л.К.Степанова. Ю.А.Белая. 1977, Л.К.Степанова. 1980. В.М.Бондаренко. 1976. Э.Л.Тейбер, 1979]. Между тем для понимания особенностей иммунологической перестройки организма при шигеллезном и сальмонеллезном инфекционных процессах определение роли вирулентности и отдельных факторов патогенности возбудителей'в фагоцитарной реакции является одной из первостепенных задач.
Все вышесказанное определило цели и задачи настоящего исследования .
Цель работы: изучение закономерностей и некоторых механизмов взаимодействия вирулентных и авирулентных штаммов шигелл и их факторов патогенности - 0-. К-антигенов и шига-токсина, с клетками МФС при моделировании инфекционного, вакцинального процессов и интоксикации.
Задачи работы.
-
Изучение влияния живых микробных клеток вирулентных и 'авирулентных штаммов шигелл и сальмонелл на интактные и активированные макрофаги в культуре In vitro при световой и электронной микроскопии.
-
Определение ферментативной активности макрофагов в присутствии вирулентных и авирулентных шигелл и отдельных факторов патогенности - 0-. К-антигенов и токсических биологически активных веществ.,
-
Выделение и' характеристика шига-токсина как фактора патогенности энтеробактерий, разработка иммунологической тест-системы для выявления его у различных бактерий, определение роли в фагоцитарной реакции.
-
Изучение роли факторов патогенности шигелл и сальмонелл (О-. К-антигенов. шига-токсина) в качестве иммуномодуляторов фагоцитов в интегративном тесте клеточной кооперации in vitro при
- з -моделировании инфекционного, вакцинального процессов и интоксикации.
5. Получение и изучение . протективных и иммуномодулирующих свойств нового препарата "K6S" - стимулятора фагоцитоза.
Научная новизна. Впервые проведены систематические, многоплановые исследования значения вирулентности энтеробактерий и их факторов патогенності! во взаимодействии с клетками МФС..
Установлено, что вирулентные и авирулентные шигеллы, их индивидуальные факторы патогенности - О-.К-антигены и токсины, -оказывают различное воздействие на фагоциты. Вирулентные шигеллы и их токсическиз биологически активные вещества вызывают глубокие и продолжительные деструктивные изменения клеток ЩС. приводящие к нарушению функциональной активности и гибели этих клеток. Фагоциты Барахенных вирулентным штаммом животных при повторном заражении оказываются более чувствительными к цитотоксическому действию шигелл. Авирулентные бактерии обусловливают преходящие мор-фофункциональные изменения, преимущественно стимулирующего характера. Макрофаги вакцинированных животных приобретают способность к ускоренной активации своей функциональной активности.
Установлено, что в основе механизма цитотоксического действия вирулентных шигелл'лежит лабилизация и деструкция мембран лизосом и других внутриклеточных органелл и угнетение ферментативной активности фагоцитирующих клеток под действием токсических биологически активных веществ этих бактерий.
Отдельные индивидуальные антигены как факторы патогенности обладают различным воздействием на макрофаги. О- (ЛПС) и К-антигены шигелл способны резко . стимулировать синтез лизосомальных ферментов. Однако, в отличие от О-актигена, обладающего токсическими свойствами для чувствительных клеток, в том числе макрофагов, К-антиген S.sonnei практически не токсичен.
Установлено широкое распространение антигена шига-токсина у различных представителей кишечных бактерий. Впервые показано, что антиген шига-токсина является альтернативным фактором патогенности по отношению к кислым К-антигенам: он обнаруживается у всех штаммов, имеющих нейтральные 0-антигены. и не обнаруживается у штаммов, синтезирующих кислые К-антигены. В случае утраты кислых К-антигенов в процессе мутаций у бактерий определяется наличие антиген* шига-токсина.
Установлено появление при инфекционном процессе и интоксикациях антигенспецифической (на 0- и К-антигены) и антигеннеспеци-фической (на шига-токсин') гипгрчуБствительности лейкоцитов крови, тестируемой в микрокультуре in vitro по выраженности и направленности миграционной.активности клеток. '
Показана дозовач зависимость усиления миграционной активности лейкоцитов крови мышей в присутствии 0-, К-антигенов и особенно шига-токсина in vitro при интоксикации, вызванной липополиса-харидом (ЛПС), и токсическом шоке, обусловленном шига-токсином.
Показана прямая корреляция усиления миграционной активности лейкоцитов крови in vitro в присутствии шига-токсина от тяжести сальмонеллезного инфекционного процесса.
Усиление миграционной активности лейкоцитов крови in vitro в присутствии шига-токсина является ранней высокочувствительной реакцией тревоги, свидетельствующей о выраженных патологических нарушениях в организме.
Практическая значимость работы.
Разработан и (.'Характеризован новый высокоиммуногекный нетоксичный иммуномодулятор фагоцитоза - "K6S".
Разработана иммунологическая тест-система для выявления антигена шига-токсина в культурах бактерий и препаратах токсина на различных этапах его получения.
Получены дополнительные .данные о способности вакцинного штамма S.flexnerl 2а 516М, входящего в состав разработанной ранее в'лаборатории живой дизентерийной вакцины, продуцировать антиген шига-токсина и стимулировать при иммунизации образование антител против него.
Определение миграционной активности лейкоцитоь крови in vitro в присутствии шига-токсина может быть использовано в качестве критерия оценки ?яжести патологических нарушений при инфекционном процессе и интоксикациях, при оценке реактогенности и. иммунологической безопасности вакцинных препаратов.
Результаты исследований были защищены 2 авторскими- свидетельствами.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции "Иммунологические аспекты инфекционной патологии", 1981; VI ' Всесоюзной конференции по клинической биохимии, морфологии, иммунологии инфекционных болезней. 1983; Всесоюзном симпозиуме, посвя-
ценном 100-летию создания Мечниковым фагоцитарной теории иммунитета, 1983; II Всесоюзном съезде инфекционистов, 1985; II Всесоюзной конференции "Актуальные ропросы теоретической и прикладной иммунологии", 1987; научной конференции "Актуальные проблемы прикладной иммунологии, биотехнологии и производства бактериальных препаратов", 1988; XVIII съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, зпидег/иологов, паразитологов им. И.И.Ме"никова, 1989; VI съезде Всесоюзного научного общества микробиологов, эпидемиологов, паразитологов им. И.И.Мечникова, 1991; Республиканской научно-практической конференции "Новые методы диагностики и лечения", 1995.
Работа апробирована на совместной научной конференции, группы иммунологии энтералышх инфекций, лаборатории генетики вирулентности бактерий и лаборатории естественного иммунитета НИИЗМ км.Н.Ф.Гамалеи РАМН 20 июня 1995 года.
Материалы работы"используются в учебном процессе кафедры инфекционных болезней лечебных факультетов ММА им.Н.М.Сеченова МЗ РФ.
По материалам диссертации опубликовано 23 работы.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на це страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, .35 рисунков и ' состоит из введения» обзора литературы (2 главы), собственных исследований (Б глав), заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего Jf*f источников, включая $J' иностранных.