Внутривидовая дифференциация штаммов Yersinia pestis Никифоров Константин Алексеевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Обзор литературы внутривидовое разнообразие и современные методы дифференциации штаммов Y.pestis собственные исследования 43

Глава 2 Материалы и методы 43

2.1 Бактериальные штаммы, среды, условия выращивания 43

2.2 Анализ биохимических свойств штаммов 52

2.3 Определение признака пигментации 53

2.4 Определение чувствительности к антибактериальным препаратам 53

2.5 Выделение ДНК 54

2.6 Постановка полимеразной цепной реакции 54

2.7 Проведение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов 54

2.8 Секвенирование ДНК 54

2.9 Гибридизация в ДНК чипах 55

3.0 Компьютерные программы 57

Глава 3 Внутривидовая дифференциация штаммов Y.pestis методом пцр c электрофоретическим учетом результатов 59

3.1 Поиск ДНК мишеней и разработка способов подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis на основе ПЦР с электрофоретическим учетом результатов 61

3.2 Выбор ДНК мишеней для определения биоваров штаммов Y.pestis основного подвида методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов 72

3.3 Определение подвидовой и биоварной принадлежности атипичных по свойствам и по району происхождения клинических штаммов Y.pestis 76

Глава 4 Определение внутривидовой принадлежно сти штаммов Y.pestis на основе пцр с гибридизаци онно-флуоресцентным учетом результатов, ДНК чипа и полногеномного секвенирования 92

4.1. Поиск ДНК мишеней и разработка способов определения подви довой принадлежности штаммов Y.pestis на основе ПЦР с гибридиза ционно-флуоресцентным и электрофоретическим учетом результатов с универсальными праймерами 92

4.2 Конструирование ДНК чипа для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis 106

4.3 Определение подвидовой принадлежности и усовершенствование внутривидовой систематики штаммов Y.pestis на основе полногеномного секвенирования 110

Глава 5. Конструирование универсальных прайме ров и детекция генов антибиотикоустойчивости у штаммов y.pestis и возбудителей других опасных инфекций методом ПЦР 118

Заключение 132

Выводы 150

Перечень сокращений, условных обозначений 151

Список использованной литературы

• Определение чувствительности к антибактериальным препаратам
• Выбор ДНК мишеней для определения биоваров штаммов Y.pestis основного подвида методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов
• Конструирование ДНК чипа для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis
• Определение подвидовой принадлежности и усовершенствование внутривидовой систематики штаммов Y.pestis на основе полногеномного секвенирования

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Чума – одна из наиболее опасных бактериальных инфекций, летальность при которой может достигать 30-50%. Ежегодно в мире по данным ВОЗ регистрируется около двух тысяч случаев болезни чумой человека [WHO, 2014]. Чума эндемична для стран СНГ, Африки, Америки и Азии. В Российской Федерации находится 11 природных очагов чумы, а в странах СНГ, Грузии и Туркмении – еще 34 очага. В 2014 г. и в 2015 г. в России зафиксированы случаи заражения чумой человека [Кутырев и др., 2014; Балахонов и др., 2016]. Многие из природных очагов чумы в России и странах ближнего зарубежья являются действующими [Балахонов и др., 2010; Попов и др., 2014; Попов и др., 2015]. Активные эпизоотические процессы протекают в очагах других сопредельных с Россией государств – Монголии, Китае, где часто регистрируют заболевания чумой. Возбудитель чумы может быть использован и в актах биотерроризма [Воробьев и др., 2002]. Угрозы возрастают в связи со случаями выделения антибиотикоустойчивых штаммов Y.pestis [Galimand et al., 1997; Guiyoule et al., 2001; Galimand et al., 2006]. Все эти факты требуют разработки современных средств эффективной диагностики возбудителя чумы.

Штаммы Y.pestis отличаются по вирулентности, эпидемической значимости и регионам их распространения. Высоковирулентными и эпидемически значимыми являются штаммы основного подвида. Они широко распространены в природных очагах различных ландшафтно-географических зон и явились этиологическими агентами трех прошедших в истории пандемий чумы [Wagner et al., 2014; Bos et al., 2016]. По зарубежной классификации штаммы Y.pestis основного подвида делятся на три биовара: античный, средневековый и восточный. По классификации, распространенной в России и странах ближнего зарубежья, штаммы возбудителя чумы включают основной и четыре неосновных подвида: кавказский, алтайский, гиссарский, улегей-ский. Штаммы неосновных подвидов отличаются избирательной вирулентностью в отношении мышевидных грызунов и циркулируют в отдельных природных очагах и географических регионах. Они редко вызывают заболевания у людей и имеют низкую эпидемическую значимость. Зарубежные исследователи объединяют их под общим названием «пестоиды».

В лабораторной диагностике возбудителя чумы штаммы основного и неосновных подвидов делят по различиям в биохимической активности, по разной вирулентности в отношении лабораторных животных. Прогресс в области современной микробиологии, связанный с развитием молекулярно-диагностических технологий, позволяет разработать более эффективные и надежные способы подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis, основанные на анализе их геномов. Проведенное в последнее время полногеномное секвенирование штаммов из различных природных очагов чумы, выявило их значительное генетическое разнообразие. В пределах биоваров основного подвида определены филогенетические линии, соответствующие различным регионам распространения штаммов Y.pestis [Одиноков и др., 2013; Morelli et al., 2010; Cui et al., 2013]. Установлено наличие отдельных отличающихся по свойствам популяций штаммов неосновных подвидов, которые предлагают выделить в новые подвиды или биовары возбудителя чумы [Платонов и др., 2015; Zhou et al., 2004; Li et al., 2009]. Однако эти предложения основываются на формальных признаках и не учитывают свойств штаммов возбудителя чумы из

4 природных очагов Российской Федерации и других стран СНГ. Для установления современной

популяционной структуры вида Y.pestis и для совершенствования внутривидовой систематики возбудителя чумы необходимо проведение полногеномного секвенирования штаммов различных подвидов и биоваров из разных географических регионов, в том числе из очагов России и стран ближнего зарубежья.

Важным направлением повышения эффективности лабораторной диагностики и эпидемиологического мониторинга возбудителя чумы является создание современных высокоразрешающих способов и средств молекулярной идентификации, основанных на молекулярно-генетических технологиях, таких как полимеразная цепная реакция, ДНК чипы, секвенирова-ние. Для быстрого определения внутривидовой принадлежности штаммов Y.pestis может быть использован метод ПЦР в двух вариантах – с электрофоретическим (ПЦР-ЭФ) и гибридизаци-онно-флуоресцентным (в режиме реального времени, ПЦР-РВ) учетом результатов. Оба метода практически не применяются для подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis, как и метод ДНК чипов, который, несмотря на высокую разрешающую способность, также до сих пор не использовался для разделения штаммов возбудителя чумы по подвидам и биоварам. Это связано, по-видимому, с отсутствием сведений по маркерным для отдельных подвидов и биоваров ДНК мишеням. Поиск таких ДНК мишеней возможен при наличии полногеномных последовательностей штаммов возбудителя чумы разных подвидов и биоваров.

Определение современной популяционной структуры возбудителя чумы и совершенствование его систематики, разработка эффективных молекулярно-генетических способов определения внутривидовой принадлежности штаммов необходимо для установления эпидемической значимости исследуемых штаммов, региона их происхождения и определения путей заноса инфекции, для проведения молекулярной экспертизы вспышек чумы и своевременного принятия мер по санитарной охране территорий Российской Федерации.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: разработка молекулярно-генетических способов внутривидовой дифференциации штаммов Yersinia pestis и совершенствование подвидовой классификации возбудителя чумы.

ЗАДАЧИ:

1. Поиск ДНК мишеней и разработка способов дифференциации подвидов и биоваров возбудителя чумы методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов. Определение с их помощью внутривидовой принадлежности атипичных по свойствам и по региону происхождения клинических штаммов Y.pestis.

2. Выявление ДНК мишеней и разработка способов определения внутривидовой принадлежности штаммов Y.pestis на основе ПЦР с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Определение подвидового состава групп штаммов Y.pestis с неясным систематическим положением.

3. Конструирование ДНК чипа для внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis.

4. Разработка способов детекции генов устойчивости к антибиотикам у штаммов Y.pestis и возбудителей других опасных инфекций методом ПЦР.

5. Определение современной популяционной структуры вида Y.pestis по данным полногеномного секвенирования штаммов из природных очагов России и других стран СНГ. Предложение усовершенствования подвидовой систематики возбудителя чумы.

Научная новизна работы. Впервые разработан комплекс способов для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis на основе методов ПЦР-ЭФ и ПЦР-РВ. Для определения подвидовой принадлежности штаммов на основе ПЦР-ЭФ найдены ДНК мишени, включающие локусы хромосомы: wzyE-dapF, YPDSF_0064-YPDSF_0065, Alt(-122), Tal(-72) и содержащие indel мутации (вставки/делеции), маркерные для основного, кавказского, алтайского, гиссарского и улегейского подвидов и штаммов из Таласского высокогорного очага в Киргизии. Разработанные способы позволяют проводить подвидовую дифференциацию штаммов Y.pestis по размеру ПЦР фрагментов, характерных для каждого подвида. С их помощью впервые на основе генетического анализа подтверждена принадлежность двух клинических штаммов возбудителя чумы к кавказскому подвиду, что доказывает способность этого древнего неосновного подвида вызывать чуму у людей. Получено подтверждение того, что в ГорноАлтайском высокогорном очаге чумы наряду со штаммами алтайского подвида циркулируют штаммы основного подвида античного биовара. Установлена систематическая принадлежность штаммов алтайского подвида из Монголии, которые на основании отсутствия у них маркерной для штаммов алтайского подвида делеции в 122 п.н. и наличия маркерной для штаммов microtus делеции в 112 п.н. отнесены к штаммам группы microtus.

Разработаны способы для проведения подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis на основе ПЦР-РВ. Найдены новые ДНК мишени: Caucasic(-91), Alt(-90), His(-205), Uleg(-88), Tal(-72) и сконструированы универсальные праймеры, которые можно использовать для разделения штаммов и методом ПЦР-ЭФ. С их помощью установлено, что в Таласском высокогорном очаге наряду со штаммами неосновного подвида циркулируют штаммы основного подвида средневекового биовара.

Впервые сконструирован ДНК чип для дифференциации штаммов основного и неосновных подвидов, а также для разделения античного, средневекового и восточного биоваров основного подвида. Разработаны способы детекции в ПЦР-ЭФ генов антибиотикоустойчивости у штаммов Y.pestis, а также у штаммов Vibrio cholerae и Escherichia coli.

По данным анализа полногеномных последовательностей 20 штаммов Y.pestis из природных очагов России и других стран СНГ, а также штаммов из базы данных NCBI GenBank установлена современная внутривидовая популяционная структура возбудителя чумы. Выявлено наличие 5 кластеров родственных штаммов, на основании чего предложено усовершенствование подвидовой классификации Y.pestis с выделением пяти подвидов: основной (ssp. pestis), кавказский (ssp. caucasica), улегейский (ssp. ulegeica), ангольский (ssp. angolica), центральноа-зиатский (ssp. central asiatica). В усовершенствованной классификации в основном подвиде сохраняются три биовара: античный (bv. antiqua), средневековый (bv. medievalis), восточный (bv. orientalis). В центральноазиатском подвиде предложено выделить три биовара: алтайский (bv. altaica), гиссарский (bv. hissarica), microtus (bv. microtus). Новая подвидовая классификация отражает современную популяционную структуру возбудителя чумы с учетом данных полногеномного секвенирования штаммов Y.pestis из очагов России и сопредельных стран.

6 По материалам исследований получено два патента на изобретение №2552611 «Способ

подвидовой дифференциации штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции», опубл. 10.06.2015. Бюл. №16; № 2565554 «Способ дифференциации биоваров и геновари-антов штаммов Yersinia pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции», опубл. 20.10.2015. Бюл. №29.

Положения, выносимые на защиту:

5. Найденные ДНК мишени и разработанный комплекс способов для проведения внутривидовой дифференциации возбудителя чумы на основе методов ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обеспечивают определение подвидовой и биоварной принадлежности штаммов Y.pestis, а также выявление штаммов с генами устойчивости к ряду антибиотиков.

6. Сконструированный ДНК чип позволяет проводить разделение штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов; античного, средневекового и восточного биоваров основного подвида.

7. Штаммы Y.pestis, включая штаммы из природных очагов России и сопредельных государств, по данным полногеномного секвенирования делятся на пять кластеров, соответствующих подвидам возбудителя чумы. По предлагаемой усовершенствованной систематике возбудителя чумы вид Y.pestis состоит из пяти подвидов – основного, кавказского, улегейского, цен-тральноазиатского и ангольского.

Теоретическая и практическая значимость. Определена современная популяционная структура вида Y.pestis и выявлено наличие в ней 5 кластеров родственных штаммов, с учетом которых предложено усовершенствование подвидовой классификации возбудителя чумы. Полученные данные пополнят знания по глобальному генетическому разнообразию возбудителя чумы, а также по направлениям эволюции вида Y.pestis. Разработан комплекс способов для определения внутривидовой принадлежности штаммов Y.pestis с использованием современных молекулярно-генетических методов – ПЦР, ДНК чипа, полногеномного секвенирования, применение которых обеспечивает идентификацию типичных и атипичных по свойствам и регионам происхождения штаммов возбудителя чумы. Разработанные способы необходимы для повышения эффективности эпидемиологического мониторинга чумы в природных очагах и для идентификации выделяемых штаммов. По материалам работы составлено двое методических рекомендаций: «Дифференциация штаммов возбудителя чумы по подвидовой принадлежности методом ПЦР», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утверждены директором института 22 октября 2013 г. Протокол №6; «Определение биоваров и геновариантов штаммов Yersinia pestis основного подвида с помощью полимеразной цепной реакции», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб» и утверждены директором института 25 июня 2014 г. Протокол №5. Разработанные в диссертационном исследовании способы внутривидовой дифференциации возбудителя чумы использованы при молекулярной экспертизе случаев чумы в Горно-Алтайском высокогорном очаге в 2014 г. и 2015 г. для определения подвидовой и биоварной принадлежности клинических штаммов Y.pestis. Сведения по молекулярно-генетической характеристике штаммов Y.pestis используются для пополнения паспортных данных штаммов из Государственной коллекции патогенных бактерий при РосНИПЧИ «Микроб». Полученные дан-

7 ные включены в лекции курсов специализации «Бактериология. Основы безопасности работы с

патогенными биологическими агентами I-II группы патогенности», а также курсов «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов» при РосНИП-ЧИ «Микроб».

Связь работы с научными программами и личный вклад автора в исследования.

Работа выполнена в отделе микробиологии ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора в рамках плановых научно–исследовательских тем: «Создание системы молекулярного типиро-вания штаммов Yersinia pestis» 2009-2013 гг. (шифр темы 42-3-09, № гос. регистрации 0120.0853926), «Комплексный эколого-эволюционный анализ штаммов Yersinia pestis из природных очагов Российской Федерации и сопредельных стран» 2014-2016 гг. (шифр темы 50-3-14, № гос. регистрации 0120.1450347). Личный вклад автора состоит в непосредственном получении и обработке экспериментальных данных, анализе литературы, определении методических подходов и проведении исследований по сравнительному анализу полногеномных последовательностей штаммов возбудителя чумы разных подвидов и биоваров и выявлению оптимальных ДНК мишеней для установления внутривидовой принадлежности штаммов на основе методов ПЦР-ЭФ и ПЦР-РВ, ДНК чипа, разработке способов детекции генов антибиотико-устойчивости у штаммов Y.pestis и возбудителей других опасных инфекций. Весь комплекс способов и сконструированных праймеров проверен автором лично на большом числе природных и клинических штаммов Y.pestis, а также на штаммах Vibrio cholerae и Escherichia coli.

Апробация работы. Материалы диссертации прошли апробацию на ряде Российских конференций и съездов: XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Саратов, 16-17 окт. 2012 г.), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов "Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 12-13 апр. 2012 г.), 2-ой Всероссийской научно-практической конференции «Микробиология в современной медицине» (Казань, 26 апреля 2014), VII ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 30 марта – 1 апреля 2015 г.), научно-практической конференции «Общие угрозы и совместные действия: ответ государств БРИКС на вызовы опасных инфекций» (Москва, 23-24 июня 2015 г.),VII Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Современные проблемы эпидемиологии и гигиены» (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2015 г.), на итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» 2013- 2015 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, 7 – в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России», из них 2 патента Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на 178 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, четырех глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюст-

Определение чувствительности к антибактериальным препаратам

Чума – зоонозная природно-очаговая особо опасная бактериальная инфекционная болезнь с трансмиссивным механизмом передачи возбудителя [Черкасский, 1994]. Возбудителем чумы является грамотрицательная неподвижная бактерия Y. pestis, не образующая спор, но формирующая капсулу в организме теплокровных животных или на питательных средах при температуре 37оС.

Географически чума широко распространена. Ее природные очаги находятся на территории Европы, Азии, Африки, Северной и Южной Америк. В Российской Федерации и странах ближнего зарубежья расположены 45 очагов чумы, 11 – непосредственно на территории России с общей их площадью в 221 тыс. кв. км [Онищенко и др., 2004; Попов и др., 2013]. Существует опасность завоза чумы из других стран ближнего или дальнего зарубежья. Эта опасность связана, прежде всего, с расширением торгово-экономических отношений и туризма на фоне глобализации и развития мирового транспортного сообщения. Чума и в наши дни представляет угрозу для здоровья населения мира и глобальной безопасности. Так, по данным ВОЗ в 2013 году на о. Мадагаскар зарегистрировано 86 случаев чумы, из которых 39 закончились смертельным исходом. За осенне-зимний период 2014 - 2015 гг. данные показатели составили 263 и 70 случаев, соответственно. В июле 2014 года зафиксировано 4 случая заболевания чумой человека в штате Колорадо, а в августе 2015 г. – еще одно заражение чумой в США. В 2014 г. отмечен случай смерти человека в провинции Ганьсу, Китай.

Активность природных очагов отмечается и на территории России (два случая чумы человека в 2014 и 2015 гг. в Горно-Алтайском высокогорном очаге), Казахстана, Туркменистана, Узбекистана, Киргизии, Азербайджана, Армении, Таджикистана, Монголии и Китая [Никитин и др., 2007; Балахонов и др., 2010; Цэ-рэнноров и др., 2014; Попов и др., 2014; Попов и др., 2015]. С учетом дальнейшего развития связей между странами требуется разработка современных методов диагностики чумы и совершенствование мер профилактики и средств лечения этой особо опасной инфекции. Эволюционно Y. pestis является ветвью возбудителя псевдотуберкулеза Yersinia pseudotuberculosis [Куклева и др., 2002; Кутырев и др., 2009; Achtman et al., 1999; Parkhill et al., 2001; Brubaker, 2004; Achtman et al., 2004; Chain et al., 2004]. При проведении сравнительного анализа полногеномных последовательностей штаммов Y. pestis и Y. pseudotuberculosis установлена идентичность их генов-гомологов на 97-99%, а гена 16S рРНК – на 100% [Chain et al., 2004; Garcia et al., 2007]. Несмотря на высокую степень сходства, эти возбудители вызывают заболевания, отличающиеся путями заражения, патогенезом и клиническими проявлениями. Чума является системной болезнью и передается преимущественно трансмиссивным путем, в то время как псевдотуберкулез клинически проявляется в виде различных гастроэнтеритов и передается фекально-оральным способом [Wren, 2003; Brubaker, 2004].

Штаммы возбудителя чумы отличаются друг от друга вследствие их циркуляции в природных очагах различного типа (высокогорные, горные, равнинно-предгорные, степные, пустынные), которые расположены в разных ландшафтно-климатических условиях. Внутривидовые классификации возбудителя чумы менялись по мере накопления знаний о разнообразии штаммов Y.pestis. Изначально было предложено разделять штаммы по их способности ферментировать глицерин. На основании этого критерия было выделено две группы: глицерин-негативные и глицерин-позитивные штаммы [Безсонова, 1928]. В дальнейшем, они получили названия океаническая и континентальная разновидности [Берлин, Борзенков, 1938]. В 1957 году В.М. Туманский на основании отношения к глицерину и нитратам, и, учитывая связь возбудителя чумы с особенностями физиологии основных носителей (зимоспящие и незимоспящие) в различных природных очагах, выделил три разновидности возбудителя чумы: крысиная (биовар ratti), cусликовая (биовар citelli), сурчиная (биовар marmotae). М.И. Леви [1962] выделил пять разновидностей возбудителя чумы: крысиная, сусликовая, песчаночная, сурчиная, полевочья, а Р.С. Михайлова в 1968 г. предложила разделить вид Y.pestis на два подвида: Pasteurella pestis pestis и Pasteurella pestis semiplenus (по 16 следние – штаммы возбудителя чумы, выделяемые от обыкновенных полевок на территории Закавказского нагорья) с учетом фенотипических свойств штаммов чумного микроба, циркулирующих в различных очагах чумы. И.Л. Мартиневский [1965] выделил следующие таксономические категории: Y. pestis (штаммы из Среднеазиатского горного и пустынных очагов, Китая, МНР, Индии и Африки) с включением трех разновидностей – Y. pestis medioasiatica montana, Y. pestis medioasiatica deserta, Y. pestis oceanica, Y.pestoides (штаммы из Забайкалья, Горного Алтая и Малого Кавказа) также с включением трех разновидностей – Y.pestoides parvocaucasica; Y.pestoides altaica; Y.pestoides transbaicalica. Позднее Л.А. Тимофеева [1972] составила свою классификационную схему, согласно которой вид Y.pestis делится на три подвида: Y.pestis pestis (делится на две расы - континентальную и океаническую), Y.pestis altaica (рамно-зопозитивные штаммы из Горного Алтая и Монголии, от пищух и полевок), Y.pestis caucasica (рамнозопозитивные штаммы с Кавказа от полевок).

В 1951 году R. Devignat, основываясь на биохимических свойствах (различиях в способности к денитрификации и ферментации глицерина) и особенностях ландшафтно-географического происхождения, предложил разделить штаммы Y. pestis на три биовара: antiqua (античный), medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). Штаммы античного биовара ферментируют глицерин и редуцируют нитраты. Они распространены в очагах Центральной Азии и Африки. Считается, что они явились причиной первой пандемии чумы под названием "Юстинианова чума" (561-767 н.э.). И теперь это получило подтверждение на основе данных геномного анализа штаммов возбудителя чумы, выделенных из археологических образцов чумных захоронений античной эпохи [Wagner et al., 2014]. Штаммы средневекового биовара ферментируют глицерин, однако утратили способность к редукции нитратов. Они распространены в очагах Средней и Центральной Азии (очаги СНГ, Ирана, Китая) и явились причиной второй пандемии - "Черная смерть" (1346 – 19 век) [Drancourt et al., 1998; Bos et al., 2012; 2016]. Штаммы восточного биовара не ферментируют глицерин, но редуцируют нитраты. Штаммы этого биовара вызвали и получили распространение в период треть 17 ей пандемии чумы, начавшейся в 1855 г. в Китае. Эти штаммы выделяются на территории Азии, Африки, Европы, а также Северной и Южной Америк. Данная классификация штаммов Y.pestis по биоварам широко используется зарубежными исследователями в настоящее время.

Выбор ДНК мишеней для определения биоваров штаммов Y.pestis основного подвида методом ПЦР с электрофоретическим учетом результатов

Расчет олигонуклеотидных праймеров и зондов для ДНК чипов осуществляли с использованием программного пакета Vector NTI 10 (Invitrogen Corporation, США) и алгоритма BLAST, а также ресурса сервера http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html на основе последовательностей штаммов Y.pestis из базы данных NCBI GenBank. Олигонуклеотидные зонды и праймеры были синтезированы в НПК «Синтол» (Россия). Зонды содержали аминогруппу на 5 - конце для их иммобилизации на стекле (слайде). Обратный праймер (antisense) включал флуоресцентный краситель – Cy5. Приготовление ДНК чипов Для нанесения зондов на слайд использовали буфер для печати олигонуклео-тидных зондов. Для приготовления 100 мкл буфера в микропробирку вносили 75 мкл 5М раствора бетаина, 25 мкл PBS буфера, 0,2 мкл 10% раствора твина-20. Готовый буфер хранили при температуре 2-8С до двух месяцев или при температуре минус 18-20С до года.

Препараты олигонуклеотидных зондов с начальной концентрацией 100 пкмоль/мкл разводили буфером для печати в соотношении 1:1 (10 мкл зонда и 10 мкл буфера) до концентрации 50 пкмоль/мкл, затем с помощью миниплоттера «Xact Microarrayer» (LabNEXT, США) наносили на поверхность аминослайдов GAPS II Coated Slides (Corning, США) методом контактной печати в виде отдельных спотов (точек) по вертикали в четырех повторах. Группа спотов формировала эрреи, предназначенные для анализа конкретных образцов. Слайды для иммобилизации нанесенных зондов инкубировали 20 мин при температуре 60оС и при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученные слайды использовали для проведения анализа.

Анализ образцов штаммов Y.pestis в ДНК-чипах Получение образцов штаммов Y.pestis для анализа в ДНК чипах проводили методом амплификации в ПЦР выбранных ДНК мишеней, как это описано в разделах 2.4 и 2.5 этой главы. Основные этапы анализа образцов штаммов Y.pestis в ДНК чипах проводили согласно методикам, описанным ранее зарубежными коллегами [Tomioka et al., 2005; Jin et al., 2007; Marcy et al., 2008;]. Перед проведением гибридизации проводили предварительную блокировку полученных ДНК чипов. Для этого в качестве трафаретов (для ограничения зоны каждого эррея) применяли 16-луночные гибридизационные камеры «16-well incubation chamber» (Whatman, Германия). Слайды с нанесенными трафаретами помещали в рамки-держатели «FAST-Frame» (Whatman, Германия). Для блокировки поверхности ДНК-чипа для предотвращения неспецифического связывания ам-плификата в лунки гибридизационных камер помещали по 100 мкл блокирующего буфера, содержащего 97 мкл 20х SSPE буфера, 2 мкл 1х раствора Дейнхардта, 1 мкл ДНК спермы лосося в конечной концентрации 0,2 мг/мл. Блокирование выполняли при температуре 42оС в течение 30 мин с использованием термошейкера при скорости вращения платформы 250 об/мин. Затем слайды отмывали при температуре 42оС в течение 5 мин 0,1х раствором SSPE-буфера с 0,2% SDS при скорости вращения платформы 250 об/мин.

Для проведения гибридизации в ячейки гибридизационной камеры вносили 80 мкл прогретой при 95оС в течение 5 мин гибридизационной смеси, которая включала 10 мкл амплификата и 70 мкл буфера для гибридизации: 63 мкл 20х SSPE-буфер, 7 мкл формамида. Для предотвращения испарения ячейки камер заклеивали самоклеящейся пленкой. Гибридизацию проводили при 42оС в течение 5 ч на термошейкере со скоростью вращения платформы 250 об/мин. Затем содержимое ячеек с помощью вакуумного медицинского отсасывателя отбирали, а слайды отмывали 2х раствором SSPE буфера при температуре 42оС в течение 2 мин при скорости 250 об/мин, затем 0,1х раствором SSPE буфера с добавлением 0,2% SDS. Затем со слайдов снимали камеры для гибридизации, слайды ополаскивали дистиллированной водой и высушивали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 1 мин, хранили при 4оС.

Учет результатов проводили с использованием сканера слайдов GenePix 4100A с помощью программного обеспечения GenePix Pro 6.0. Рассчитывали критический уровень сигнала флуоресценции по формуле Скр=2,2К-, где К- - значение флуоресценции отрицательного контроля при 635 нм. Результат считали положительным, если среднее значение флуоресценции при длине волны 635 нм для 4-х спотов одного зонда было больше или равно критическому уровню флуоресценции, и отрицательным, если среднее значение флуоресценции было меньше критического уровня. Реакцию учитывали при отрицательном результате в лунке с отрицательным контролем (гибридизационный буфер).

Поиск ДНК мишеней для дифференциации штаммов осуществляли с использованием программ Mauve 2.3.1 и Mega 5.0, а так же алгоритма BLAST по базе данных полногеномных последовательностей штаммов Y.pestis из базы данных NCBI GenBank. Обработку исходных данных секвенирования проводили с применением пакета программ Ion Torrent Suite software версии 3.4.2 и Newbler gsAssembler версии 2.6. Для сравнения полногеномных последовательностей использовали зарубежные штаммы Y.pestis, полные нуклеотидные последовательности геномов которых представлены в международной базе данных NCBI GenBank (табл. 2). Полногеномный SNP анализ штаммов Y.pestis проводили с помощью программ Wombac версии 2.0 и Bionumerics версии 7.5. Для построения дендрограмм использовали Bionumerics 7.5, алгоритм Maximum Parsimony с логарифмической обработкой длины ветвей. Расчет праймеров для ПЦР-ЭФ, ПЦР-РВ и для ДНК чипа проводили с помощью программы Vector NTI 10.

Конструирование ДНК чипа для проведения внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis

В соответствие с широко используемой отечественной классификацией штаммы возбудителя чумы делятся на пять подвидов – основной (ssp. pestis) и 4 неосновных подвида: алтайский (ssp. altaica), кавказский (ssp. caucasica), гиссар-ский (ssp. hissarica), улегейский (ssp. ulegeica) [Тимофеева, 1972; Кутырев, Про-ценко, 1998]. Штаммы основного подвида высоко вирулентны, могут вызывать эпидемии и пандемии чумы. Они широко распространены в природных очагах на территории России, а также за рубежом. Штаммы неосновных подвидов встречаются в отдельных географических регионах России, других стран СНГ и сопредельных государств: кавказского подвида – в очагах чумы на Кавказе, гиссарского подвида – в Гиссарском высокогорном очаге чумы в Таджикистане, алтайского – в Горно-Алтайском высокогорном очаге чумы и в Монголии, улегейского – в Монголии. Штаммы неосновных подвидов имеют низкую эпидемическую значимость и избирательную вирулентность, однако в литературе встречаются отдельные сообщения о случаях заболевания чумой человека, вызванных штаммами неосновных подвидов Y.pestis [Овасапян, Шехикян, 1989; Ефременко и др.,1992; Cui et al., 2013].

При внутривидовой дифференциации штаммов Y.pestis важное значение имеет разделение основного и неосновных подвидов, ввиду их различной вирулентности и эпидемической значимости. Также важно проводить разделение и неосновных подвидов из-за их различной способности вызывать заболевания у человека, а также в целях установления региона происхождения исследуемого штамма.

В настоящее время в лабораторных исследованиях разделение штаммов Y.pestis разных подвидов проводят на основе их различной биохимической активности в отношении сахаров и спиртов [Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство, Онищенко и др., 2013]. Штаммы основного подвида не ферментируют рамнозу и мелибиозу, а штаммы всех неосновных подвидов сохранили эту способность. Штаммы гиссарского, алтай 60 ского и улегейского подвидов не обладают нитрифицирующей и денитрифицирующей способностью. Штаммы алтайского и гиссарского подвидов также не ферментируют арабинозу. Штаммы кавказского подвида активны в отношении всех вышеперечисленных субстратов.

На современном этапе развития микробиологии эту длительную процедуру установления подвидовой принадлежности штаммов возбудителя чумы можно ускорить с помощью методов молекулярной идентификации, в частности с помощью простого и эффективного метода ПЦР. Недавно разработан способ разделения штаммов Y.pestis основного и неосновных подвидов, а также штаммов близкородственной бактерии Yersinia pseudotuberculosis с помощью ПЦР [Одиноков и др., 2010; Ерошенко и др., 2012]. Для разработки способа дифференциации штаммов Y.pestis всех пяти подвидов необходимо выявить эффективные ДНК мишени – участки генома, несущие специфические для отдельных подвидов мутации. Ранее такие исследования не проводили, однако, в связи с полногеномным секвенированием штаммов Y.pestis всех неосновных подвидов, проведенным в последнее время в РосНИПЧИ «Микроб», выявление маркерных для каждого подвида измененных участков генома стало выполнимой задачей.

Еще одной важной задачей для проведения внутривидовой молекулярной дифференциации штаммов Y.pestis является разработка молекулярно генетического способа разделения биоваров основного подвида на основе ПЦР. По зарубежной классификации штаммы основного подвида делятся на три биовара: античный (b/v antiqua), средневековый (b/v medievalis) и восточный (b/v orientalis) [Devignut, 1951]. Штаммы разных биоваров имеют различные географические регионы распространения и отличаются по биохимической активности. Штаммы средневекового биовара не обладают нитрифицирующей и денитрифицирующей способностью, восточного – не ферментируют глицерин, античного – активны по обоим признакам. Ранее был разработан способ дифференциации в ПЦР штаммов средневекового и античного биоваров, однако, некоторые атипичные штаммы средневекового биовара этим способом не выявляются [Одиноков и др., 2013]. 3.1 Поиск ДНК мишеней и разработка способа подвидовой дифференциации штаммов Y.pestis на основе ПЦР с электрофоретическим учетом результатов

Целью этого раздела исследований был поиск эффективных ДНК мишеней и разработка способов дифференциации штаммов Y.pestis по их подвидовой и биоварной принадлежности на основе метода ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.

Поиск ДНК мишеней для внутривидовой дифференциации Y.pestis проводили на основе сравнительного анализа полногеномных последовательностей штаммов Y.pestis CO92, KIM, Nepal516, Antiqua, 91001, Pestoides F, Angola из базы данных NCBI GenBank, а также штаммов основного подвида – Y.pestis 231 (708), КМ682, КМ932, М-1864, М-1773, М-1484 и штаммов неосновных подвидов – Y.pestis С-741 (кавказский п/в), И-2998 (алтайский п/в), А-1249 (гиссарский п/в), И-2422 (улегейский п/в), секвенированных в РосНИПЧИ «Микроб». Сравнение полногеномных последовательностей штаммов осуществляли с помощью программы Mauve 2.3.1, программы MEGA 5.0 и алгоритма BLAST.

В результате проведенного сравнения выявлено несколько перспективных ДНК мишеней, расположенных в хромосомных участках возбудителя чумы. Одна из них локализована в межгенном участке между геном wzyE (кодирует общий антиген энтеробактерий) и геном dapF (кодирует диаминопимелат-эпимеразу) (название генов указано согласно номенклатуре штамма Pestoides F). Штаммы основного подвида содержат в этом локусе делецию в 34 п.н., в то время как у штаммов неосновных подвидов – алтайского и гиссарского, штаммов 91001 (microtus) и Angola (NCBI GenBank) выявляется вставка размером 17 п.н. У штаммов кавказского подвида – Y.pestis С-741 и Pestoides F (NCBI GenBank) и улегейского подвида – И-2422 изменения в этом межгенном участке отсутствуют. Но у штаммов кавказского подвида обнаружена мутация – вставка размером 60 п.н. в другом хромосомном локусе, расположенном в межгенном пространстве между геном YPDSF_0064 (кодирует сенсорный протеин EnvZ) и геном YPDSF_0065 (кодирует фосфоенолпируваткиназу) (название генов указано согласно номенклатуре штамма Pestoides F).

Определение подвидовой принадлежности и усовершенствование внутривидовой систематики штаммов Y.pestis на основе полногеномного секвенирования

Новая маркерная мутация для детекции штаммов улегейского подвида – делеция в 88 п.н. выявлена в гене AK38_1098 (название гена приведено в соответствии с номенклатурой штамма СО92). Для проведения детекции штаммов уле-гейского подвида подобраны следующие условия реакции: 1 цикл 95С 15 мин; 10 циклов: 95С 20 с, 55С 20 с, 72С 20 с; 35 циклов: 95С 20 с, 56С 45 с, 72С 20 с. В ПЦР-РВ с зондом на мишень Uleg(-88), меченым красителем Cy5, у штаммов улегейского подвида отсутствовал флуоресцентный сигнал, который проявлялся у штаммов других подвидов и групп (рис. 10, табл. 11). В ПЦР–ЭФ с рассчитанными праймерами у штаммов улегейского подвида образовывались фрагменты в 147 п.н., а у штаммов остальных подвидов в 235 п.н. (табл. 12).

Далее была выявлена мутация – делеция в 90 п.н. в гене AK38_1327 (кодирует гипотетический протеин) (название гена приведено в соответствии с номенкла 100 турой штамма СО92) у штаммов алтайского подвида. В ПЦР-РВ с зондом на мишень Alt(-90), меченым красителем R6G, у штаммов алтайского подвида отсутствовал флуоресцентный сигнал, который проявлялся у штаммов других подвидов и групп (рис. 11). В ПЦР-ЭФ на матрице ДНК штаммов алтайского подвида ампли-фицировались фрагменты размером 134 п.н., а у штаммов остальных подвидов – размером 224 п.н. (табл. 12).

Обнаружена также делеция, маркерная для штаммов гиссарского подвида. Она имеет размер 205 п.н. и расположена в гене AK38_334 (название гена приведено в соответствии с номенклатурой штамма СО92). Праймеры на эту ДНК ми шень рассчитаны таким образом, чтобы они попадали в область делеции, тогда как праймеры на другие мишени были комплементарны участкам, фланкирующим делеции.

В ПЦР-РВ с зондом на мишень His(-205), меченым красителем ROX, у штаммов гиссарского подвида отсутствовал флуоресцентный сигнал, который проявлялся у штаммов других подвидов и групп (рис. 12). В ПЦР-ЭФ у штаммов гиссарского подвида амплификаты не образовывались, а у штаммов остальных подвидов образовывались амплификаты размером 130 п.н.

Удалось установить наличие специфической для штаммов из Таласского высокогорного очага чумы в Киргизии делеции размером 72 п.н., локализованной в гене AK38_181 (гипотетический протеин) (название гена приведено в соответст 102 вии с номенклатурой штамма СО92). В ПЦР-РВ с зондом на мишень Tal(-72), меченым красителем ROX, у штаммов таласской группы отсутствовал флуоресцентный сигнал, который проявлялся у штаммов других подвидов и штаммов microtus. В ПЦР-ЭФ у таласских штаммов с помощью рассчитанных праймеров амплифи-цировались фрагменты в 93 п.н., а у других штаммов – в 165 п.н.

Для детекции штаммов группы microtus использована маркерная делеция в 112 п.н. в гене araC (регуляторный ген арабинозного оперона) [Zhou et al., 2004]. Праймеры на эту ДНК мишень, как и на мишень His(-205), были рассчитаны нами таким образом, что обратный праймер попадал в область делеции. С рассчитанными нами праймерами и зондом, меченым красителем Cy5, в ПЦР-РВ у штаммов microtus отсутствовал флуоресцентный сигнал, который проявлялся у штаммов других подвидов и у таласских штаммов (рис. 13). На матрице ДНК штаммов microtus в ПЦР-ЭФ амплификаты не образовывались, а у остальных штаммов образовывались амплификаты размером 120 п.н.

Таким образом, специфичность и эффективность выявленных ДНК мишеней и сконструированных на них праймеров и зондов, а также их универсальность для проведения ПЦР-РВ и ПЦР-ЭФ подтверждена на наборе штаммов Y.pestis разных подвидов и двух групп (таласские и microtus) штаммов (табл. 11 и табл. 12).

Далее разработанный комплекс праймеров и зондов был использован для внутривидовой дифференциации большого числа природных штаммов Y.pestis различного происхождения, список которых представлен в таблице 4. На этой расширенной выборке штаммов Y.pestis подтверждена специфичность и эффективность рассчитанных праймеров на мишени 45, 89, Caucasic(-91), Alt(-90), His(-205), Uleg(-88), Tal(-72), Micr(-112). Примером этого стало выявление подви-довой неоднородности штаммов Y.pestis из Таласского высокогорного очага чумы в Киргизии.

Определение внутривидовой принадлежности штаммов Y.pestis из Таласского высокогорного очага чумы

Штаммы из Таласского высокогорного очага чумы в Киргизии остаются малоисследованными. Неясна их систематическая принадлежность. Известно, что по комплексу их биохимических особенностей (ферментируют рамнозу и мелибиозу, не ферментируют арабинозу и не редуцируют нитраты) они относятся к неосновным подвидам и близки штаммам алтайско-гиссарской группы. Некоторые исследователи предлагают выделить их в отдельный (таласский) подвид или биовар возбудителя чумы [Anisimov et al., 2004; Платонов и др., 2015].

У 10 из 11 таласских штаммов регистрировался сигнал флуоресценции в ПЦР-РВ по ДНК мишеням 45 и 89 и отсутствовал сигнал в ПЦР-РВ с праймерами и зондом, рассчитанными на специфическую для штаммов из Таласского высокогорного очага делецию (рис. 14) Это означает, что все эти штаммы принадлежат к таласской группе, относящейся к неосновным подвидам. С этими данными согласуются и данные фенотипического анализа. Штаммы ферментировали рамнозу, но не ферментировали арабинозу и не редуцировали нитраты.

Только один штамм Y.pestis А-1809 не относился к таласской группе. У него регистрировался сигнал на мишень Tal(-72), который отсутствовал у всех остальных исследованных штаммов из Таласского высокогорного очага. В тоже время у штамма А-1809 отсутствовал сигнал флуоресценции по мишеням 45 и 89, что свидетельствовало о его принадлежности к основному подвиду возбудителя чу 105 мы. У других 10 исследованных таласских штаммов сигнал флуоресценции по мишеням 45 и 89 регистрировался.