Введение к работе
Актуальность темы. Основными факторами вирулентности для пектолитических видов бактерий рода Erwinia являются внеклеточные деполимеризующие ферменты, в том числе пектолитические, целлюлолнтические, протеолитические, а также некоторые другие, роль которых до конца не выяснена (Barras et al., 1994). Важную роль как фактора вирулентности среди пектолитических ферментов бактерий рода Erwinia играет пектатлиаза, представленная несколькими изоферментами (Kotoujansky, 1987). В начале наших исследований имелись лишь разрозненные сведения о синтезе пектатлиаз штаммами бактерий рода Erwinia и отсутствовал сравнительный анализ изоферментов, продуцируемых основными пектолитнческнми видами Erwinia, что и послужило поводом для проведения широкого сравнительного анализа препаратов пектатлиаз бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica, а также выяснения основных закономерностей регуляции их синтеза. Анализ имеющейся информации по проблеме показывает, что регуляторные механизмы синтеза ферментов изучены, в основном, для внутриклеточных ферментов и, в меньшей степени, для секретируемых из клеток в среду. Пектатлиазы бактерий рода Erwinia являются удобной моделью для изучения основных закономерностей синтеза и секреции внеклеточных ферментов, что крайне важно для решения как общебиологической проблемы секреции клетками белков, так и для решения частных проблем биотехнологии.
Спектр пектолитических ферментов, продуцируемых бактериями рода Erwinia, чрезвычайно широк и разнообразен, что позволяет рассматривать их в качестве перспективных продуцентов этих веществ (Rombouts, Pilnik, 1980). Пектолитические ферменты, продуцируемые бактериями рода Erwinia, могут найти применение в пищевой промышленности, сельском хозяйстве и научных исследованиях. Деполимеразы, катализирующие расщепление полимеров растительной клеточной стенки, незаменимы в процессах переработки растительного сырья, таких как получение льноволокна, изолированных растительных клеток, протопластов. Поскольку пектолитические ферментные препараты в Республике Беларусь не производятся, представляются актуальными поиск и селекция соответствующих продуцентов, оптимизация условий- их культивирования, разработка регламентов получения ферментов и применения. Успешное решение указанных вопросов будет способствовать развитию отечественной биотехнологии.
Основные бактериозы, характерные для Беларуси- это мягкие шили и
"черная ножка" картофеля, возбудителями которых являются E.carotovora
subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica, соответственно. Особенно
значительные потери картофеля наблюдаются при поражений бактериями Е.
carotovora subsp. atroseptica, которые способны поражать растения как в
период вегетации, вызывая сосудистый бактериоз "черную ножку" картофеля,
так и при хранении в зимнее время, провоцируя мягкие гнили (Дорожкин,
1974). Несомненно, что изучение факторов вирулентности данных
микроорганизмов будет способствовать пониманию механизмов
взаимодействия патогенов с растениями и выработке эффективных методов
защиты от инфекций. (
Связь рабодщ с. крупными научными программами, темами.
Диссертационная работа выполнена на кафедре микробиологии
Белгосуниверситета в течение 1981-1995 гг. как часть плановых тем: №
81012682 "Изучение переноса генетического материала и его выражение в
гомологичных и гетерологичных системах грамотрицательных бактерий"
(1981-1985); № 01860002420 "Изучить генетическую организацию
грамотрицательных фитопатогенных бактерий и бактерий, утилизирующих
одно- и двууглеродные соединения" (1986-1990); № 01860000064
"Разработать эффективный способ первичной обработки льносырья на
основе изучения регуляции синтеза пектатлиаз клетками бактерий рода
Erwinia; выдать заинтересованным организациям рекомендации по
практическому использованию этого способа" (1986-1987г.г.); №
01910035949 "Изучение детерминант вирулентности и сравнительный анализ
организации геномов бактерий рода Erwinia" (1991-1995); "Генетическое и
биохимическое изучение фосфоенолпируват-зависимой
глюкозофосфотрансферазной системы Erwinia chrysanthemi и ее участие в регуляции синтеза и секреции внеклеточных эидопектатлиаз и эндоглюканазы"( 1994-1995), финансировавшейся Международным научным фондом (гранты RWA000, RWA300); № 736/57 "Изучение генетической организации и особенностей регуляции детерминант вирулентности бактерий Erwinia carotovora " (1996-1998).
Цель и задачи исследования. Цель работы: 'сравнительный анализ пектатлиаз Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora » Е. carotovora subsp. atroseptica, установление закономерностей продукции внеклеточных пектолических ферментов бактериями Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica, выявление молекулярно-гснетическнх особенностей регуляции их синтеза и секреции, направленное получение высокоактивных продуцентов пектатлказы для практического использования.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
-разработка методов очистки н электрофоретического анализа изоферментов пекгатлиазы;
-анализ нзофермешною состава пектатлиаз у разных видов фитопатогенных бактерии рода Erwinia;
-выяснение влияния факторов среды на синтез пектатлиаз и нзоферментний состав;
изучение регуляшш синтеза и секреции пектатлиаз;
клонирование генов пектатлиаз бактерий рода Erwinia и изучение их экспрессии в гомологичных и гетерологнчных системах;
-отбор бактерий, высокоактивных продуцентов ферментов;
-получение ферментных препаратов мацерирующего действия и оценка перспектив их применения.
Научная новизна полученных результатов. Впервые проведено сравнительное изучение изофермептного состава и свойств внеклеточных пектатлиаз бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica, что позволило идентифицировать 12 групп нзоферменюв пекгатлиазы, различающихся основными физико-химическими свойствами. Причем у бактерий Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica выявлены лишь- небольшие различия в изоферментном составе пектатлиаз. Показано, что обязательным компонентом пектолитического комплекса бактерий Е. chrysanthemi является пектннметилэстераза, а у бактерий Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica таким компонентом является эидополигалактуропаза.
Изучена регуляция синтеза пектатлиаз у бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica и установлено, что синтез данных ферментов индуцируется пектиновыми веществами и подвержен катаболитной репрессии глюкозой. Выявлены различия в степени индукции и чувствительности к катаболитной репрессии глюкозой отдельных изоферментных форм пекгатлиазы. Наиболее "регулируемыми" ферментами оказались пектатлиазы Ech4 и Ech5 бактерий Е. chrysanthemi и ЕсаЗ и Еса4 у клеток Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica. Синтез других изоферментов в меньшей степени индуцируется пектиновыми веществами и репрессируется глюкозой. Показано, что варьируя состав питательных сред для культивирования бактерии, можно іюлучаїь ферментные препараты с определенным набором изоферментов.
Впервые получены мутанты Е. chrysanthemi ENA49, резистентные к катаболитной репрессии глюкозой и характеризующиеся повышенной
4 продукцией пектатлиаз (полученные штаммы защищены авторскими свидетельствами). Аналогичные мутации были индуцированы у бактерий Е. carotovora subsp. atroseptica 36А.
Изучены организация и некоторые свойства фосфоенолпируват-завнсимой глюкозофосфотрансферазной системы Е. chrysanthemi и определено ее участие в регуляции синтеза и секреции внеклеточных эндопектатлназ. Проведено молекулярное клонирование и частичное секвенированне ptsl гена бактерий Е. chrysanthemi ENA49.
Клонированы структурные гены основных изоферментов пектатлиазы бактерий Е. chrysanthemi ENA49 и Е. chrysanthemi ЕС 16, Е. carotovora subsp. carotovora 17А и Е. carotovora subsp. atroseptica 36А и изучена экспрессия пектатлиазных генов в клетках бактерий Escherichia coli и Erwinia.
Впервые для изучения феномена секреции пектатлиаз были использованы клонированные гены бактерий Erwinia, что позволило выявить некоторые особенности процесса: специфичность системы секреции пектатлиаз определенного вида бактерий и двухстадийность процесса секреции (первая стадия - экспорт через цитонлазматическую мембрану, вторая стадия - секреция через наружную мембрану), причем эффективность секреции пектатлиаз гораздо выше через цитоплазматнческую мембрану, чем наружную. Получены мутанты с измененной секрецией пектатлиаз и выявлены некоторые различия в составе мембранных белков клеток дикого типа и мутантных бактерий.
Практическая значимость полученных результатов. Созданы
перспективные в промышленном отношении продуценты пектолнтическнх ферментов. Штаммы Е. chrysanthemi ENA49, обладающие повышенным уровнем синтеза внеклеточных пектатлиаз и резистентные к катаболитной репрессии глюкозой, защищены авторскими свидетельствами. Разработан и защищен авторским свидетельством способ твердофазной ферментации льносоломки с использованием бактерий Е. chrysanthemi, позволяющий повысить выход длинного льноволокна и сократить время процесса мацерации. Разработана дешевая питательная среда для выращивания бактерий, предназначаемых для процесса твердофазной ферментации лыюсоломки (а.с. 1307845). Разработаны методы получения растительных протопластов и изолированных клеток растений с использованием нектолитических ферментных препаратов бактерий рода Erwinia (на способы получены патенты Российской Федерации).
Метод электрофоретического анализа изоферментов пектатлиазы используется сотрудниками и студентами кафедры микробиологии и лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов в научных исследованиях. Разработанные методы селекции штаммов-продуцентов
5 пектатлиаз, мутантные штаммы Erwinia используются при проведении лабораторных занятий по спецкурсам и спецпрактикумам.
Выявленные особенности регуляции синтеза и секреции изоферментов пектатлиаз - основных факторов вирулентности бактерий рода Erwinia, расширяют наши знания о физиологии патогенов растений и могут быть использованы для разработки специфических средств защиты растений от мягких гнилей.
Экономическая значимость полученных результатов. Штаммы бактерий - высокоактивных продуцентов пектнндеполимераз, и разработанный на их основе способ приготовления льноволокна из лыюсоломкн, новые ферментные препараты мацерирутощего действия и методы получения протошіастов и растительных клеток для научных исследований и нужд промышленности являются коммерческими продуктами и могут быть реализованы заинтересованным предприятиям и организациям.
Основные положения диссертации, выносимые на зашиту.
Внеклеточные пектатлназы бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica различаются по физико-химическим свойствам, образуя 12 групп изоферментов (6 групп среди бактерий Е. chrysanthemi и 6 групп для Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica). Все изученные штаммы бактерий Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica обладают полным набором указанных изоферментов, в то время как у разных штаммов Е. chrysanthemi отмечаются существенные различия в нзоферментном составе пектатлиаз, что отражает биологическую гетерогенность этого вида бактерий. Обязательным компонентом пектолнтического комплекса бактерий Е. chrysanthemi является пектипметнлэстераза, а у бактерий Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica - эпдополигалактуроназа.
Синтез пектатлиаз у бактерий Е. chrysanthemi, Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica индуцируется пектиновыми веществами и подвержен катаболитной репрессии глюкозой. В наибольшей степени это выражено в отношении изоферментов Ech4, Ech5 Е. chrysanthemi, и ЕсаЗ, Еса4 Е. carotovora subsp. carotovora и Е. carotovora subsp. atroseptica. Синтез других изоферментов в меньшей степени индуцируется пектиновыми веществами и репрессируется глюкозой. Изменение состава питательных сред культивирования бактерий приводит к продукции ферментных комплексов определенного состава.
Новые продуценты пектатлназы штаммы Е. chrysanthemi, резистентные к катаболитной репрессии глюкозой н с повышенной продукцией пектатлиаз, отличаются от ранее известных набором ферментов и активностью последних.
Фосфоеполпируватзависнмая глюкозофосфотрансферазная система бактерий Е. chrysanthemi участвует в регуляции синтеза и секреции внеклеточных эндонектатлиаз.
Экспрессия клонированных структурных іенов основных изоферментов пектатлназ Е. chrysanthemi ENA49 и Е. chrysanthemi ЕС 16, Е. carotovora subsp. carotovora 17А и Е. carotovora subsp. atroseptica 36А в клетках бактерий Е. coli и Erwinia выражена в разной степени, что свидетельствует о наличии у бактерий рода Erwinia иных механизмов регуляции синтеза пектатлназ. Об этом же свидетельствует возможность получения мутантов с повышенной продукцией пектатлназ. Использование клонированных генов пектатлназ бактерий рода Erwinia для изучения феномена секреции позволяет выявить некоторые особенности этого процесса: специфичность системы секреции собственных пектатлназ и двухстадш'шость процесса секреции (вначале секреция через цитоплазматическую мембрану, затем - через наружную), причем эффективность секреции пектатлназ гораздо выше через цитоплазматическую мембрану, чем через наружную.
Новый способ твердофазной ферментации лыюсоломки с использованием бактерий Е. chrysanthemi позволяет существенно сократить время мацерации.
Пектолитические ферментные препараты бактерий рода Erwinia могут использоваться для получения протопластов растений и отдельных растительных клеток.
Личный вклад соискателя. Научно аргументировано направление исследований, осуществлена постановка задач, разработаны методы их решения, получен и обобщен экспериментальный материал работы. Соавторами ряда научных трудов диссертанта являются сотрудники Проблемной научно-исследовательской лаборатории экспериментальной биологии и кафедры микробиологии Белгосуниверситета, участвовавшие в выполнении некоторых экспериментов.
Апробация результатов диссертации. Основные положения работы доложены на: Международном симпозиуме ФЕМО (Пушино, 1983), научных конференциях республик Прибалтики и Белоруссии (Рига, 1983; Таллин, 1985), Всесозной конференции по фитопатогенным бактериям (Ужгород, 1985), конференции молодых ученых АН БССР (Минск, 1986), V съезде БелОГиС (Горки, 1986), IV съезде ЭстОГиС (Таллин, 1986), Всесозной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пушино, 1986), V Всесоюзной конференции "Методы получения и анализа биохимических реактивов" (Рига, 1987), V съезде ВОГнС им. Н.И.Вавилова (Москва, 1987), IV Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Ташкент, 1988), Всесозной конференции "Регуляция микробного метаболизма" (Пущнно, 1989), Всесоюзных совещаниях по секреции белков
7 у микроорганизмов (Пущино, 1989, 1990, 1991), Всесоюзной конференции по фнтопатогенным бактериям (Киев, 1990), Всесоюзной конференции "Микробиолошческие и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ата, 1990), VI съезде БелОГиС (Горки, 1992), Международной конференции по фнтопатогенным бактериям (Версаль, Франция, 1992), ежегодных конференциях ученых биологического факультета Б ГУ (Минск, 1994, 1996), семинарах сектора микробиологам Института биохимии и биофизики ПАН (Варшава, 1994, 1996). В завершенном виде диссертационная работа доложена на заседании Совета биологического факультета Белгосуниверснтета (Минск, 1997) и заседании Ученого Совета Институга микробиологии АН Беларуси (Минск, 1997).
Опубликованность результатов. Результаты исследований опубликованы в 22 журнальных статьях, 22 тезисах докладов различных симпозиумов, съездов, конференций, 5 авторских свидетельствах на изобретения и 2 патентах Российской федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, 5 глав экспериментальной части, анализа и обобщения результатов исследований, выводов, списка использованных источников.