Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Факторы патогенности Staphylococcus aureus, их роль в инфекционном процессе и в формировании поствакцинального иммунитета 12
1.1. Staphylococcus aureus – возбудитель внебольничных инфекций и ифекций, связанных с оказанием медицинской помощи 12
1.2. Факторы патогенности S. aureus и иммунный ответ организма на инфекцию 14
1.3. Экспериментальные модели, используемые при разработке вакцин против S. aureus 20
1.4. Современные направления конструирования противостафилококковых вакцин 26
Заключение по обзору литературы 32
Собственные исследования.
Глава 2. Материалы и методы исследования... 34
2.1. Штаммы S. aureus, использованные в работе 34
2.2. Экспериментальные животные 34
2.3. Культивирование штаммов, получение белоксодержащих антигенов из культуральной жидкости и их разделение 34
2.4. Химический, иммунохимический и физико-химический анализ полученных антигенов 36
2.5. Идентификация белкового состава антигенов методом масс-спектрометрического анализа 37
2.6. Активная и пассивная защита мышей 38
2.7. Высеваемость S. aureus из органов зараженных мышей 39
2.8. Морфологическое исследование органов и морфометрический анализ формирования абсцессов почки 40
2.9. Аномальная (острая) токсичность антигенов 41
2.10. Статистическая обработка данных 42
Глава 3. Штамм S. aureus – продуцент внеклеточных белок содержащих антигенов, его культивирование и получение белоксодержащих антигенов 43
3.1. Выделение штамма S. aureus – продуцента внеклеточных белоксодержащих антигенов и его характеристика 43
3.2. Динамическое периодическое культивирования штамма S.aureus № 6 и получение белоксодержащих антигенов 45
Заключение по главе 3 51
Глава 4. Характеристика полученных внеклеточных белоксодержащих антигенов 53
4.1. Химический, иммунохимический и физико-химический анализ 53
4.2. Протеомный анализ внеклеточных белоксодержащих антигенов 59
Заключение по главе 4 67
Глава 5. Иммунобиологические свойства белоксодержащих антигенов 69
5.1. Протективная активность полученных антигенов в опытах активной и пассивной защиты мышей 69
5.2. Изучение влияния белоксодержащих антигенов на высеваемость S. aureus из органов зараженных мышей 74
5.3. Морфологическое исследование органов иммунизированных и интактных животных и морфометрический анализ формирования абсцессов почек после заражения мышей S.aureus 78
Заключение по главе 5 89
Заключение 91
Выводы 97
Список литературы 99
- Факторы патогенности S. aureus и иммунный ответ организма на инфекцию
- Динамическое периодическое культивирования штамма S.aureus № 6 и получение белоксодержащих антигенов
- Протективная активность полученных антигенов в опытах активной и пассивной защиты мышей
- Морфологическое исследование органов иммунизированных и интактных животных и морфометрический анализ формирования абсцессов почек после заражения мышей S.aureus
Факторы патогенности S. aureus и иммунный ответ организма на инфекцию
В молекулярных механизмах патогенеза стафилококковых инфекций ключевыми основами являются потребление бактериями в тканях хозяина питательных веществ, в частности, железа, индукция механизмов коагуляции, способствующая агрегации стафилококков в сосудистой системе, и супрессия врожденного и адаптивного иммунного ответа, причем каждому из этих этапов свойственны определенные факторы вирулентности S. aureus, установление которых, по мнению исследователей, будет способствовать идентификации эффективных протективных антигенов [58].
Клеточная стенка S. aureus состоит из капсульного полисахарида, пептидогликана, липотейхоевой кислоты, рибитолсодержащей тейхоевой кислоты и многочисленных поверхностных белков. На рис. 1 приведены основные факторы патогенности (вирулентности) S. aureus, участвующие в различных этапах инфекционного процесса [56], которые могут быть использованы при разработке вакцин:
– полисахариды клеточной стенки - капсульные полисахариды (КП), наиболее часто встречаются 5 и 8 типов, способствуют иммунной эвазии стафилококка, подавляя фагоцитоз, и поли-N-ацетилглюкозамин (PNAG), являясь адгезином, облегчает формирование биопленки и его синтез контролируется локусом ica;
– поверхностные бактериальные белки, к которым относятся адгезины, (в т.ч., хлопьеобразующий фактор А и В – ClfA, ClfB, фибриноген-связывающие белки А и В – FnbA, FnbB, коллаген-связывающий белок – Can, и коагулаза – Coa), обеспечивающие колонизацию тканей [68], и инвазины (-токсин, , , – гемолизины и др.), обеспечивающие распространение в тканях хозяина, а также белок А, связывающийся с Fc-фрагментом Ig G, ингибирующий фагоцитоз;
– экстрацеллюлярные белковые продукты (лейкоцидины, в т.ч. лейкоцидин Пантона-Валентайна – PVL, лизирующий клеточную мембрану нейтрофилов человека и обладающий дермонекротическими свойствами в моделях на животных, суперантигены, относящиеся к пирогенным токсинам, приводят к неспецифической стимуляции клеток иммунной системы, повреждению клеток сосудистого эндотелия - эксфолиативные А и В токсины, а также токсины синдрома токсического шока и энтеротоксины, кодируемые геномными островами патогенности [12]).
На примере MRSA возбудителя ВИ - эпидемического клона MRSA штамма USA300, David M.Z. и Daum R.S. [57] представили гипотетическую схему конкретных факторов вирулентности (рис.2), состоящих из: – секретируемых - двухкомпонентного порообразующего белка лейкоцидина Пантона-Валентайна (PVL), кодируемого генами lukF-PV и lukS-PV, -типа фенол-растворимого модулина (PSMs), -гемолизина;
– хромосомных генетических элементов - ACME (мобильный элемент, катаболизирующий аргинин, содержит структурный ген arcA, кодирующий аргининовую деиминазу (arginine deiminase), которая генерирует токсичные продукты для макрофагов и других лейкоцитов человека), и SCCmec типа IV или V (стафилококковая хромосомная кассета, несущая mecА - ген устойчивости к -лактамным антибиотикам, кодирующий синтез пенициллин-связывающего протеина РВР-2);
– глобальных генов - регуляторов agr, sarA и saeRS, регулирующих экспрессию многих токсинов и других белков, имеющих отношение к патогенности микроба. Как отмечено выше, экстрацеллюлярные белки регулируются глобальными регуляторами sarA и agr , что определяет их уровень. Так, у sarA и sarA agr мутантов по сравнению с исходным штаммом S. aureus UAMC-1, показано преобладание цистеиновой протеазы (SspB), эндопептидазы (SspA), стафопаиновой протеазы (ScpA), ауреолизина (Aur) в разгар экспоненциальной фазы роста (через 3ч роста в триптиказосоевом бульоне - TSB), в то время как IgG-связывающий белок (Sbi), IgG связывающий белок А (SpA), иммунодоминантный стафилококковый антиген А (IsaA) и железорегулируемый белок A (IsdA) наиболее выражены у agr мутантов [86].
Изучение динамики накопления внеклеточных белков, выделенных из штамма S. aureus UAMC-1, выращенного в TSB, выявило, что белки, связанные с клеточной стенкой, преобладают на начальных этапах роста - в экспоненциальной фазе, а поступающие в питательную среду – в более поздние сроки, что объясняют вероятным лизисом клеток [86]. Авторы считают, что внеклеточные белки, в зависимости от фазы роста в TSB, в которой они экспрессируются, можно разделить на 2 группы: экспрессируемые только при низкой оптической плотности культуры – в экспоненциальной фазе роста (например, иммунодоминантный антиген А, предшественник секреторного антигена, многие белки с неизвестными функциями), и только при высокой оптической плотности – в стационарной фазе (например, протеазы, гемолизины, липазы) [143]. Вместе с тем большое количество белков с цитоплазматической локализацией обнаружено в экспоненциальной фазе. Так, белки Spa и Coa отмечены в экспоненциальной фазе, уровень Clf А, В – в разгаре экспоненциальной фазы (через 3 ч роста), к 6ч – снижается, а к 12ч роста – отмечено его максимальное накопление; к постэкспоненциальной фазе роста накапливается PVL лейкоцидин [86]. По данным C. Burlak c соавт. [47] при изучении спектра экзопротеинов в высоко вирулентных штаммах MW2 (USA400) и LAC (USA300) в супернатанте, полученном в середине экспоненциальной фазы роста также показано присутствие Spa и Coa, гемолизина Hla; супероксиддисмутаза (SodA) отмечена в штаммах как в экспоненциальной, так и в стационарной фазах роста. Неожиданным для авторов явилось то, что в обоих фазах роста не были обнаружены субъединицы -гемолизина, компоненты PVL лейкоцидина. Следует отметить, что в приведенном выше исследовании [143] показано, что гемолизины экспрессируются только при высокой оптической плотности – в стационарной фазе.
Известно несколько механизмов защиты человека от инфекции, вызываемой S. aureus, которые включают барьер слизистых и эпителия, отсутствие (минимизацию) питательных веществ, необходимых для роста и размножения стафилококка, выработку сигналов опасности на микробные продукты, направленных на активирование врожденного иммунного ответа, поглощение и киллинг бактерий профессиональными фагоцитами, в частности, нейтрофилами, и участие компонентов адаптивной иммунной системы, таких как антитела и Т-клетки [140]. В профилактике стафилококковых инфекций важен механизм антитело-опосредованного клиренса, управляемого адаптивной иммунной системой, в которой ключевую роль играют секретирующие антитела В клетки и цитокин секретирующие и цитолитические Т клетки, в частности, CD4+ T клетки.
Было показано, что цитокины, секретируемые клетками T хелперов (Th1 и Th17), повышают эффекторную функцию нейтрофилов. Это необходимо учитывать при разработке вакцин [102].
Динамическое периодическое культивирования штамма S.aureus № 6 и получение белоксодержащих антигенов
Целевыми продуктами в данном исследовании являются внеклеточные белоксодержащие антигенны, для получения которых необходимо создание условий культивирования продуцента, при которых бактериальные клетки будут в физиологически активном состоянии, что соответствует фазе экспоненциального роста [5], а в культуральной жидкости должно быть минимальное количество мертвых клеток и продуктов их распада. Экспериментально было установлено, что при динамическом периодическом культивировании S. aureus № 6 в жидкой полусинтетической питательной среде № 1, при 37 С и аэрации перемешиванием со скоростью 90 об/мин, фаза экспоненциального роста заканчивалась к 5 ч. В связи с этим выращивание останавливали в конце фазы экспоненциального роста через 4,5 ч культивирования. Далее среду культивирования отделяли от микробных клеток, полученный фильтрат обрабатывали, выделяли экспериментальный белоксодержащий препарат и изучали, как описано в разделах 2.4 и 2.6.
Для выявления протективной активности полученного белоксодержащего препарата был проведен предварительный эксперимент. Для этого мышей иммунизировали выделенным препаратом, в дозах 2 и 30 мкг белка на мышь и заражали в/бр гомологичным вирулентным штаммом S.aureus № 6 в дозе 4х108 клеток, что составило в данном эксперименте 3 LD50. Протективную активность оценивали по количеству выживших мышей в опыте и контроле (неиммунизированные животные) в динамике в течение 7 суток и рассчитывали критерий значимости различий Z [7]. Исследование выявило статистически значимые различия в выживаемости мышей, иммунизированных разными дозами препарата, по сравнению с контролем (табл. 3).
Таким образом, на данном этапе исследований было показано, что при выращивании штамма S. aureus № 6 до конца фазы экспоненциального роста в полусинтетической среде № 1 выделенный белоксодержащий препарат обладал протективной активностью.
В последующем, для культивирования S. aureus № 6 была использована полусинтетическая питательная среда, приготовленная на основе синтетической среды Ледерберга с добавлением ДЭ и ГЛ, не содержащая панкреатический гидролизат казеина (среда № 2). В настоящем исследовании проведено 20 процессов динамического периодического культивирования S. aureus № 6 в среде № 2 при 37 C и перемешивании со скоростью 90 об/мин (Biosan Multi-Shaker). Поскольку предварительно изучение динамики накопления биомассы по показателям оптической плотности (при длине волны 565 нм) подтвердило, что фаза экспоненциального роста также заканчивалась к 5 ч, выращивание заканчивали через 4,5 ч культивирования в конце фазы экспоненциального роста (рис. 4).
Изучение накопления биомассы по определению числа КОЕ/мл в начале и в конце процесса (КОЕ0 и КОЕt) позволяет детально проанализировать проведенные процессы культивирования и установить определенные зависимости (табл. 4). Так, на основании определения начального числа КОЕ/мл (Х0) все процессы выращивания разделены на 5 групп и проведен расчет продуктивности процессов культивирования по накоплению биомассы (qx). Можно отметить, что оптимальной является Х0 в III, IV и V группах; при этом среднее значение при суммировании Х0 в этих группах - (1,225±0,271)х108 (при расчете не учитывали Х0=2,4 в опыте № 20, поскольку эта величина является выскакивающей [4]: 2,4 - 1,225 = 1,175 0,959 или 0,271x3,54, где 0,271 -стандартное отклонение средней 1,225, а 3,54 - коэффициент, определенный по таблице при общем числе определений, равном 9). При этом установлена прямая корреляционная зависимость между начальным числом КОЕ/мл (Х0) и продуктивностью процессов культивирования по накоплению биомассы (г = 0,949) (рис. 5).
При последующем анализе (табл. 5 и рис. 6) представлены процессы культивирования, сгруппированные, как показано в таблице 4, на основании начального числа КОЕ/мл. В таблице 5 приведены показатели, рассчитанные в этих группах на основании определения оптической плотности – начальная оптическая плотность (ОП0), и максимальная удельная скорость роста (m). Данные, приведенные в таблице 5 и на рисунке 6 показывают, что при интервале ОП0 0,198-0,345 максимальная удельная скорость роста находится в пределах 0,753 - 0,804 ч-1 (в I - IV группах), а при увеличении ОП0 до 0,42 она (m) снижается, что можно сравнить с прямой зависимостью продуктивности процесса культивирования по накоплению биомассы при высоком начальном числе КОЕ/мл.
На основании проведенных процессов периодического динамического культивирования штамма S. aureus № 6 в жидкой питательной среде № 2 из стерильного фильтрата культуральной жидкости получено 14 серий экспериментального антигенного препарата, обозначенного как «исходный» (см. раздел 2.3). Последующее фракционирование «исходного» антигена проводили с помощью ионообменной хроматографии, при которой его наносили:
для получения I фракции на колонку Q-Sepharose (предварительно уравновешенную 0,15 М NaCl, и элюировали 1,5 М NaCl); получено 9 серий,
для получения II фракции на колонку с ионообменным носителем DEAE-Sepharose (предварительно уравновешенную 50 мМ цитратным буфером, и элюировали 0,1 М цитратным буфером); получено 7 серий.
Таким образом, анализ 20 процессов динамического периодического культивирования S. aureus № 6 в жидкой питательной среде № 2 (на основе синтетической среды Ледерберга с добавлением ДЭ и ГЛ), проведенных при 37 C и перемешивании со скоростью 90 об/мин, выявил, что оптимальным начальным числом КОЕ/мл является (1,225±0,271)х108. Показано, что при максимальной начальной концентрации, наблюдающейся в V группе экспериментов, рассчитанной по оптической плотности, отмечена тенденция к снижению максимальной удельной скорости роста. Полученные в результате процессов культивирования и последующего выделения серии «исходного» экспериментального антигенного препарата и его I и II фракций использованы в дальнейших исследованиях.
Протективная активность полученных антигенов в опытах активной и пассивной защиты мышей
Изучение протективной активности противостафилококковых препаратов на животных, в частности на мышах, предполагает использование наиболее чувствительной линии к этой инфекции, поскольку вообще мыши слабо чувствительны к стафилококку, по сравнению с другими условно-патогенными микроорганизмами, например, Klebsiella pneumoniae. По данным М.М. Авербаха [1], на основании выживаемости мышей после заражения S. aureus, линии CBA, наряду с DBA/2 и BALB/c, отнесены к резистентным по отношению к стафилококковой инфекции. В тоже время, M. vоn Kckritz-Blickwede с соавт. [157] отметили, что работа с инбредными мышами линии СВА демонстрирует промежуточный уровень восприимчивости к S. aureus по сравнению с высокочувствительными линиями, в частности, например, с линией BALB/c. В связи с этим эксперименты были проведены с использованием линии BALB/c.
Протективная активность белоксодержащих антигенов в опытах активной защиты мышей. При изучении протективного эффекта препарата ориентировались на такой путь заражения, который может привести к развитию инфекционного процесса в течение как минимум 10 суток, а не только к интоксикации в течение 3-5 суток; такой подход вполне оправдан в связи со сложностью моделирования стафилококковой инфекции. В наших экспериментах был избран ретроорбитальный (р/о) путь заражения, который по своему действию близок к внутривенному (в/в).
Изучение выживаемости мышей, иммунизированных разными сериями выделенных белоксодержащих антигенов (вне зависимости от иммунизирующих и заражающих доз) (И), по сравнению с неиммунизированными (К), через 7 суток после р/о заражения по % выживших животных показало (табл. 11) наличие статистически значимых отличий в данных для изученных антигенов и контроля при обработке результатов с использованием непараметрического парного критерия Т Вилкоксона.
Переходя к анализу протективной активности выделенных белоксодержащих антигенов в зависимости от иммунизирующих доз, рассчитанных по содержанию белка в препарате, в экспериментах активной защиты мышей отмечено, что при иммунизации тремя дозами «исходного» антигена (табл. 12) значимые различия с контролем выявлены в 2-х иммунизирующих дозах (3,0 и 12,0 мкг), в то время как введение 0,75 мкг оказалось недостаточным для получения защитного эффекта.
Влияние величины иммунизирующих доз на выживаемость мышей через 10 суток после р/о заражения изучено в следующем опыте при 3-х четырехкратно увеличивающихся дозах и различном количестве заражающих LD50. Результаты, приведенные в таблице 13, свидетельствуют о том, что дозы «исходного» антигенного препарата, защищающие 50% животных от заражения 1,62 и 8,13 LD50 S. aureus № 6, составляют, соответственно, 1,72 и 3,0 мкг. Следовательно, иммунизирующая доза «исходного» антигена 3,0 мкг является вполне достаточной при последующем изучении иммунобиологических свойств этого антигена.
Следует отметить, что в приведенных экспериментах (табл. 12 и 13) получены однотипные результаты. Эти результаты позволяют обратить внимание на возможность снижения иммунизирующей дозы «исходного» препарата.
Для изучения протективной активности белоксодержащих антигенов – «исходного» и выделенных из него более очищенных фракций – I и II – мышей иммунизировали п/к следующими дозами препаратов, рассчитанных по белку:
– «исходным» в дозе 3,0 мкг, поскольку выше показано (табл. 12), что эта доза защищает мышей;
– для I и II в предварительных экспериментах при иммунизации мышей этими фракциями было показано, что доза 1,2 мкг защищает мышей.
Результаты сравнительного анализа протективной активности трех белоксодержащих антигенов (табл. 14) выявили значимые различия с контролем, что отмечено как в эксперименте 1 (при сравнительном изучении действия всех трех антигенов), так и при исследовании I и II фракций, соответственно, в экспериментах 2 и 3.
Таким образом, на основании приведенных данных можно сделать заключение о протективной активности изученных белоксодержащих антигенов в опытах активной защиты мышей, в иммунизирующих дозах: «исходного» – 1,8 и 3,0 мкг, I и II фракций – по 1,2 мкг.
Протективная активность белоксодержащих антигенов в опытах пассивной защиты мышей.
Полученные мышиные и кроличьи сыворотки изучены в опытах пассивной защиты мышей. Учет (в течение 7 суток) выживаемости зараженных мышей, которым вводили сыворотки животных, иммунизированных изучаемыми белоксодержащими антигенами, приведен в таблице 15 и свидетельствует о протективных свойствах иммунных сывороток, полученных при иммунизации мышей и кроликов изучаемыми антигенными препаратами, по сравнению с контролем. В тоже время сыворотки интактных мышей и кроликов не обладали протективным действием.
В связи с установленной протективной активностью всех трех полученных антигенов, представляло интерес изучить их влияние на высеваемость из органов и крови иммунизированных животных и сравнить полученные данные с морфологическим исследованием органов и анализом формирования абсцессов в почках.
Морфологическое исследование органов иммунизированных и интактных животных и морфометрический анализ формирования абсцессов почек после заражения мышей S.aureus
Ранее при иммунизации белоксодержащими антигенами было установлено повышение в 2,2 - 7,5 раз (по сравнению с контролем) уровня специфических IgG антител в сыворотках иммунизированных кроликов и мышей (табл. 8 и 9), и определена их протективная активность в опытах активной защиты мышей (индекс эффективности 2,63 – 4,28, табл. 12 и 14), что свидетельствует о влиянии изучаемых антигенов на систему адаптивного иммунитета. В последующих исследованиях представляло интерес определение возможных морфологических изменений в органах в результате иммунизации этими антигенами.
Морфологическое исследование органов иммунизированных и интактных животных.
На первом этапе исследований был проведен обзорный морфологический анализ органов (легких, селезенки, почек) после иммунизации разными дозами «исходного» антигена (0,75, 3 и 12 мкг) через 14 суток после последней иммунизации по сравнению с интактными животными. Установлено, что при минимальной иммунизирующей дозе (0,75 мкг):
– структура легкого не изменена, но увеличено количество макрофагов в межальвеолярных перегородках, в результате чего в некоторых участках отмечено их расширение;
– площадь белой пульпы селезенки расширена за счет увеличения размеров и слияния лимфоидных узелков; особенно заметно расширение маргинальных зон лимфоидных узелков, где происходит взаимодействие иммунокомпетентных клеток; в большинстве узелков наблюдаются расширенные реактивные центры;
– кровеносные сосуды почки резко расширены, полнокровны, клубочки расширены, полость капсул сужена.
При иммунизирующей дозе 3,0 мкг:
– отмечена гиперемия ткани легких, полнокровие сосудов как большого, так и малого круга кровообращения, расширение межальвеолярных перегородок благодаря переполненным кровью капиллярам и выраженной макрофагальной реакции (рис. 11А);
– почти всю площадь селезенки занимает белая пульпа, границы между нею и красной пульпой нечеткие за счет ее значительной лимфатизации и плазматизации; красная пульпа оттеснена в субкапсулярную зону, в которой определяются немногочисленные мегакариоциты (рис. 11Б);
– в почке наблюдается набухание эпителиальных клеток и сужение просвета канальцев (рис. 11В).
При максимальной иммунизирующей дозе 12,0 мкг выявляются наиболее значительные изменения, проявляющиеся:
– в переполнении кровью артерий и вен и стазе крови в сосудах микроциркуляторного русла легких, большом количестве гемосидерофагов, многочисленных ателектазах, значительном понижении воздушности органа за счет скопления макрофагов и лейкоцитов в межальвеолярных перегородках, в появлении небольших периваскулярных лимфоидных скоплений и наличии содержимого в просвете терминальных бронхиол (рис. 11А);
– в селезенке практически вся площадь среза заполнена лимфоидной тканью, красная пульпа имеет вид лишь небольших островков (рис. 11Б), однако, лимфоидные узелки белой пульпы разрежены, в них нет чёткого разделения на зоны. В лимфоидных узелках и в межузелковых участках обнаруживается большое количество макрофагов и клеток плазмоцитарного ряда на разных стадиях дифференцировки; – в почке наблюдается набухание клеток эпителия канальцев и эндотелия капилляров сосудистых клубочков в почечных тельцах, белковые массы внутри просветов канальцев, гидропическая дистрофия эпителия (рис. 11В).
Таким образом, проведенное исследование показало незначительные морфо-иммунологические изменения в ответ на введение минимальной дозы (0,75 мкг) «исходного» антигена, развитие морфологических проявлений при дозе 3,0 мкг и существенные морфологические изменения при иммунизирующей дозе 12,0 мкг. Эти результаты, с одной стороны, подтверждают полученные ранее данные (табл. 12 и 13), что доза 3,0 мкг «исходного» антигена может быть перспективной для последующих исследований, а с другой стороны, свидетельствуют о целесообразности дальнейшей очистки «исходного» препарата, в связи с чем и было проведено последующее фракционирование.
При изучении морфологии почек мышей, иммунизированных 1,2 мкг II фракцией, не выявлены морфологические изменения, отличающиеся от наблюдаемых в почках интактных мышей. В обеих группах отмечены единичные случаи полнокровия, микроочаговой межканальцевой лейкоцитарной инфильтрации, расширения просветов и уплощения эпителия отдельных канальцев (рис. 12).
Морфологическое исследование почек после заражения S. aureus №6 иммунизированных и интактных животных
При использовании модели развития генерализованного процесса было отмечено, что иммунизация «исходным» (3,0 мкг) и II (1,2 мкг) антигенами снижает высеваемость S. aureus из селезенки и почек мышей после р/о заражения по сравнению с контролем (неиммунизированными животными). В исследованиях по конструированию стафилококковых вакцин для определения протективных антигенов ряд авторов, изучавших влияние различных поверхностных железорегулируемых белков и коагулазы, показали целесообразность использования «почечной» модели, которая основана на изучении формирования в почке абсцессов [50, 92]. Влияние предварительной иммунизации на тяжесть течения инфекции при последующем заражении S. aureus изучено по морфологическим изменениям в почках мышей. С этой целью модифицирована «почечная» модель при генерализованной стафилококковой инфекции, развившейся после заражения S. aureus № 6: на серийных срезах препаратов почки изучали по 20 полей зрения и проводили соответствующий анализ полученных результатов.
Изучение морфологических изменений, развивающихся в почках после заражения S. aureus № 6 мышей, иммунизированных «исходным» антигеном, показало наименьшие изменения при иммунизирующей дозе 3,0 мкг, проявившиеся в межканальцевой и периваскулярной лейкоцитарной инфильтрации, полнокровии сосудов, отечности клубочков, единичных очагах гидропической дистрофии проксимальных канальцев коркового вещества, слабо-умеренные признаки атрофии отдельных канальцев (расширение просветов отдельных канальцев и уплощение эпителия) (рис. 13В). Более значительные изменения в почечной ткани отмечены после заражения S. aureus № 6 мышей, иммунизированных минимальной (0,75 мкг) и максимальной (12,0 мкг) дозами «исходного» антигена. Так, при минимальной дозе, кроме межканальцевой и периваскулярной лейкоцитарной инфильтрации, наблюдались гиперемия и стаз крови в сосудах, активация мезангиальных клеток в почечных тельцах. Отмечалась более выраженная диффузная гидропическая дистрофия эпителия канальцев, обнаруживались абсцессы, вокруг которых видны канальцы с некрозом эпителия, заполненные белковыми массами, и атрофия канальцев различной степени выраженности (рис. 13А, Б). При максимальной дозе, помимо изменений, выявленных при других дозах, отмечены лейкоцитарные массы внутри сосуда, изменение формы почечных телец (неровные контуры) (рис. 13Г). В то же время, в контроле (неиммунизированные мыши, зараженные S. aureus № 6), морфологические проявления развития инфекционного процесса в почках похожи на патоморфологию при остром пиелонефрите [28]: в слизистой оболочке лоханки и чашечек заметны гиперемия, кровоизлияния и лейкоцитарная инфильтрация. В межуточной ткани, помимо резкого изменения гемодинамики органа (нарушение циркуляции крови в виде гиперемии и стазовых явлений) и очагов кровоизлияний, наблюдались многочисленные лейкоцитарные инфильтраты с тенденцией к образованию абсцессов и гидропическая дистрофия (рис. 13 Д-1, Д-2). Так же отмечена атрофия почечных канальцев различной степени выраженности и многих почечных телец с уменьшением их размеров, изменением формы и нарушением структуры, вплоть до разрушения некоторых из них (рис. 13 Д-3). В мозговом слое выявлен некроз почечных сосочков (некротический папиллит), развившийся в результате действия бактериальных токсинов [28].