Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Факторы патогенности Staphylococcus aureus и их роль в инфекционном процессе и в формировании поствак-цинального иммунитета 11
1.1. Staphylococcus aureus – возбудитель внебольничных инфекций и связанных с оказанием медицинской помощи 11
1.2. Факторы патогенности S. aureus и иммунный ответ организма на инфекцию 13
1.3. Экспериментальные модели, используемые при разработке вакцин против S. aureus 18
1.4. Современные направления конструирования противостафилококковых вакцин 24
Заключение по обзору литературы 29
Собственные исследования.
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 31
2.1. Штаммы S.aureus, использованные в работе 31
2.2. Экспериментальные животные 31
2.3. Молекулярно-генетический анализ штаммов S.aureus.. 31
2.4. Культивирование штаммов, получение белоксодержащих антигенов из культуральной жидкости и их разделение . 32
2.5. Химический, иммунохимический и физико-химический анализ полученных антигенов 34
2.6. Идентификация белкового состава антигенов методом масс-спектрометрического анализа 35
2.7. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных животных 36
2.8. Активная и пассивная защита мышей 36
2.9. Высеваемость S. aureus из органов зараженных мышей
2.10. Морфологическое исследование органов и морфометрический анализ формирования абсцессов почки. 37
2.11. Статистическая обработка данных .38
ГЛАВА 3. Молекулярно-генетическая характеристика штамма S. aureus – продуцента белоксодержащих антигенов, и его культивирование 40
3.1. Молекулярно - генетическая характеристика штамма S. aureus № 6 - продуцента белоксодержащих антигенов 41
3.2. Культивирование штамма S. aureus №6 для последующего использования в качестве продуцента белоксодержащих антигенов 47
Заключение по главе 3 50
ГЛАВА 4. Характеристика полученных внеклеточных белоксодержащих антигенных препаратов 52
4.1. Химический и иммунохимический анализ белоксодержащих антигенов 52
4.2. Протеомный анализ внеклеточных белоксодержащих антигенов 56
Заключение по главе 4 60
ГЛАВА 5. Иммунобиологические свойства белоксодержащих антигеннных препаратов 66
5.1. Протективная активность полученных антигенов в опытах активной и пассивной защиты мышей 66
5.2. Высеваемость S. aureus из органов иммунизированных и контрольных животных 70
5.3. Морфологическое исследование органов (легкие, селезенка, почки) и морфометрический анализ формирования абсцессов почек у иммунизированных и контрольных животных 74
Заключение по главе 5 83
Заключение 84
Выводы 90
Список литературы
- Факторы патогенности S. aureus и иммунный ответ организма на инфекцию
- Культивирование штаммов, получение белоксодержащих антигенов из культуральной жидкости и их разделение
- Культивирование штамма S. aureus №6 для последующего использования в качестве продуцента белоксодержащих антигенов
- Протеомный анализ внеклеточных белоксодержащих антигенов
Факторы патогенности S. aureus и иммунный ответ организма на инфекцию
Заболевания, вызываемые S. aureus, в настоящее время являются одной из важнейших проблем здравоохранения всего мира; они разнообразны по формам и включают поражения кожи и мягких тканей, инвазивные инфекции. S. aureus – оппортунистический бактериальный патоген, часто являющийся причиной инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) и внебольничных (ВИ), включающих бактериемию, эндокардит, остеомиелит, септический артрит и пневмонию [33, 128]. Так, в России S. aureus составляет 46,2% всех штаммов, выделенных при инфекционном эндокардите [8], 42-65% при септическом артрите [24]. ИСМП часто развиваются при применении внутривенных катетеров, хирургических приспособлений и разных имплантов [33, 43, 118, 148] и могут приводить к летальному исходу [59]. Повсеместное увеличение распространения заболеваний стафилококковой этиологии в последние годы [8, 81], сопровождается увеличением резистентности возбудителей к антибиотикам, в частности, к метициллину (MRSA), ванкомицину (VRSA), клиндамицину и линезолиду [88, 95, 110]. Вирулентность штаммов, в частности MRSA, связана с активностью многочисленных эффекторных молекул, которые могут быть объединены в 2 большие группы [88]: токсины, являющиеся причиной специфического поражения тканей хозяина [95, 110], и адгезины - факторы, способствующие адгезии и инвазии в ткани хозяина [61].
При ретроспективном анализе заболеваемости в США в 2000 - 2001 г.г. у 0,8% всех госпитализированных пациентов при выписке из больницы зафиксированы инфекции, вызывемые S. aureus, и показано, что эти больные в 3 раза дольше находились в стационаре, и в 5 раз увеличился риск летальности [107]. Проспективный анализ заболеваемости инфекционным эндокардитом, вызванным S. aureus, проведенный по данным 39 медицинских центров 16 стран, показал его этиологическую значимость в 31,4% из 1779 случаев диагностированного инфекционного эндокардита, причем в разных странах эти показатели различались, как и частота выделения MRSA-штаммов [65]. Отмечено также, что в 2005 г. в США заболеваемость, связанная с инвазивными MRSA-штаммами, составляла 31,8 (24,4-35,2) на 100000 населения, а летальность 6,3 (3,3-7,5) [84]. Кроме того, при анализе случаев пневмонии с госпитализацией в Техасский детский госпиталь в 2001 - 2009 г.г. установлено увеличение их числа с 4,81 до 9,75 на 10000 госпитализированных, причем 74% составляли MRSA-штаммы [42]. В этиологии бактериальных инфекций глаз S. aureus занимает первое место среди заболеваний, в которых известен этиологически значимый возбудитель, установленный в 33,5% и 27,3%, соответственно, при конъюнктивите и блефарите, а также при кератите [18]. В обзоре Del Giudice P с соавт. сообщено, что ВИ и ИСМП, вызванные MRSA штаммами, различаются: ВИ отмечаются у более молодых субъектов без отягощенного медицинского анамнеза, в основном, проявляются гнойными кожными поражениями и, редко - в виде инвазивных инфекций, таких как некротизирующая пневмония. В США основным циркулирующими штаммами являются MRSA клоны USA300, а в Европе распространение при ВИ таких MRSA штаммов пока остается ограниченным [53].
При геномном секвенировании двух MRSA штаммов S. aureus, вызывающих ВИ (клонов MW2, или USA400, и пандемического - USA300), установлено, что около 20% состава генома обусловлено горизонтальным переносом многочисленных мобильных генетических элементов, включающих профаги и острова патогенности (содержащие специализированные факторы патогенности, такие, как экзотоксины и экзопротеины, способствующие эвазии или разрушению защиты хозяина), которые отсутствуют у традиционных MRSA штаммов (COL, N315 и MRSA252), вызывающих ИСМП [31, 56]. Проведя сравнительный филогенетический анализ авторы установили клональную взаимосвязь штаммов S. aureus Newman и COL, NCTC8325, USA300 и большие эволюционные различия с рядом штаммов, вызывающих ИСМП; они заключили, что профаги и острова патогенности играют основную роль в вирулентности и эволюции S. aureus. Большой проблемой является носительство S. aureus, которое составляет, например, около 41% у часто болеющих тонзиллитом [69]. При мультицентровом исследовании в Великобритании в существенном проценте случаев (82,2%) установлена клональная идентичность штаммов, выделенных при бактериемии и назальном носительстве [145]. К 2010 г. были секвенированы и опубликованы полные геномные последовательности 58 штаммов S. aureus. Проведя их сравнительное исследование McCarthy A.J. и Lindsay J.A. [100] установили, что 24 поверхностных белка (ClfA, ClfB, Cna, Eap, Ebh, EbpS, FnBPA, FnBPB, IsaB, IsdA, IsdB, IsdH, SasB, SasC, SasD, SasF, SasG, SasH, SasK, SdrC, SdrD, SdrE, Spa и SraP) вовлечены в адгезию и 13 секретируемых белков (Coa, Ecb, Efb, Emp, EsaC, EsxA, EssC, FLIPr, FLIPr like, Sbi, SCIN-B, SCIN-C, VWbp) участвуют в уклонении от иммунного ответа и расположены в стабильном ядре генома. Отмечено также, что 8 генов (ebpS, fnbpA, isaB, isdA, isdH, sasF, sasH, spa), кодирующих соответствующие белки, присутствуют во всех секвенированных геномах; из остальных 16 генов 13 отсутствуют в небольшом количестве геномов (clfA, clfB, eap, ebh, fnbpB, isdB, sasB, sasC, sasD, sasG, sdrC, sdrD, sraP) и 3 (cna, sasK, sdrE) – отсутствуют в большинстве геномов. На основании приведенных результатов авторы сделали вывод, что вакцины должны содержать «коктейль» антигенов, представляющих все варианты, или они не будут защищать от всей естественной популяции S. aureus.
Предпосылки для развития новых вакцин и их клинических исследований, играющие ключевую роль, включают: селекцию антигенов на основе разнообразных факторов вирулентности, экспрессируемых S. aureus; определение подходов к мониторингу иммунологического ответа, генерируемого вакциной, для предсказания ее эффективности; тщательное рассмотрение (отбор) группы пациентов для первичного установления эффективности кандидатной вакцины [37].
Культивирование штаммов, получение белоксодержащих антигенов из культуральной жидкости и их разделение
Основная часть экспериментов проведена при культивировании продуцентов белоксодержащих соединений на втором варианте среды. Выращивание S. aureus и отделение микробной массы. Для подготовки посевных культур флакон с 200 мл питательной среды инокулировали 5-7 изолированными колониями агаровой культуры и после 12-14-часовой инкубации при 37 C выросшую культуру переносили в бутыль с 2 л среды, сохраняя соотношение культуры к среде 1:10, затем инкубировали при 37 C и перемешивании со скоростью 90 об/мин на Biosan Multi-Shaker. Бактерии отделяли от среды культивирования стерилизующей фильтрацией через фильтры PLASMAFILTER PLASMAFLUX PSu 2S.
Рост бактерий контролировали по оптической плотности при длинне волны 565 нм (на спектрофотометре Genesys 10 UV, Thermo Spectronic, Rochester, NY, USA) и определением числа КОЕ/мл, которое подсчитывали после 24 ч инкубации чашек с 1,5% питательным агаром («Биотехновация», Москва, Россия), инокулированных серийными разведениями бактериальной культуры. Продуктивность процесса культивирования по накоплению биомассы рассчитывали по среднему увеличению количества клеток в час.
Выделение и разделение внеклеточных белоксодержащих антигенов. Последующее выделение белков из полученного фильтрата проводили методом высаливания сульфатом аммония до 80% насыщения по методу [85]. Осадок отделяли центрифугированием при 10 000 g в течение 30 мин, растворяли в 0,01 М Трис-буфере (pH=7,4) с 0,01% натрия азидом и проводили микрофильтрацию через мембрану 0,22 мкм с последующим обессоливанием - переводом в 50 мМ карбонат аммония с помощью колонки PD-10, заполненной сефадексом G25 (GE Healthcare, USA). Выделенный белоксодержащий антиген, обозначенный как «исходный», использовали для первого протеомного анализа и определения протективной активности. В последующих исследованиях осадок S. aureus растворяли в 50 мл фосфатного буфера (pH=7,4).
Фракционирование белоксодержащих соединений проводили с помощью ионообменной хроматографии. Для получения I фракции «исходный» антиген S. aureus наносили на колонку Q-Sepharose, предварительно уравновешенную 0,15 М NaCl, и элюировали 1,5 М NaCl. Для получения II фракции «исходный» антиген наносили на колонку с ионообменным носителем DEAE-Sepharose, предварительно уравновешенную 50 мМ цитратным буфером, и элюировали 0,1 М цитратным буфером. Фракционирование по молекулярной массе проводили с помощью ультрафильтрации на двух мембранах с порогом отсечения белка ниже 30 кДа и выше 90 кДа.
Выделение и разделение внеклеточных белков выполнено при участии автора на базе лаборатории клеточного иммунитета РОНЦ им. Н.Н. Блохина (зав. лаб. д.м.н., проф. М.В. Киселевский) в.н.с., д.м.н., проф. Ф.В. Доненко, за что выражаем глубокую благодарность.
Определение белка Содержание белка в препаратах определяли по методу Бредфорда [35] по калибровочной кривой, построенной по стандартным растворам бычьего сывороточного альбумина. Определение углеводов Содержание углеводов определяли по калибровочной кривой, построенной по стандартным растворам глюкозы, используя метод Дюбуа [58]. Определение нуклеиновых кислот Долю нуклеиновых кислот определяли по поглощению при длине волны 260 нм [150]. При этом исходили из расчета, что поглощению в одну оптическую единицу соответствует наличие 50 мкг нуклеиновых кислот в 1 мл водного раствора препарата. Двойная иммунодиффузия в геле по Оухтерлони
Двойную иммунодиффузию [112] проводили в 0,1 % геле агарозы. На пластине с гелем делали трафаретом лунки, в которые вносили белоксодержащие соединения и антисыворотки. В центральную лунку вносили кроличьи или мышиные сыворотки, полученные к выделенным белоксодержащим препаратам, в периферические лунки – анализируемые белоксодержашие соединения в концентрации до 1 мг/мл. Пластину помещали во влажную камеру и инкубировали 48 часов при 20-22 С. Гель отжимали под слоями фильтровальной бумаги, отмывали в течение 10-12 часов физиологическим раствором, для удаления избытка сыворотки, вновь отжимали и высушивали на воздухе. Окраску преципитатов проводили в 1,25% растворе Coomassie brilliant blue R-250, отмывали от избытка красителя в смеси вода:уксусная кислота:этанол (6:1:2) и высушивали на воздухе. Электрофоретический анализ в PAAG
Для электрофоретического анализа полученные белоксодержащие соединения изучали в электрофорезе в 12,5% полиакриламидном геле (SDS-PAGE) по методу Лэммли [89]. Полученные образцы растворяли в буфере, состоящем из 63 мM Трис/HCl, pH=6,8, 10% (об/об) глицерола, 2% (в/об) натрия додецилсульфата (SDS) и 30 мкM бромфенолового синего. После SDS-PAGE гель окрашивали с помощью Coomassie brilliant blue R-250.
При подготовке образцов проводили трипсинолиз в денатурирующем буфере, обессоливание полученных триптических пептидов с использованием картриджей Discovery DSC-18 (1 ml tubes, 50 mg) (Supelco, USA), высушивание в вакуумной центрифуге и хранение при – 80 oC до LC-MS/MS анализа. Для анализа LС-MS/MS данные были конвертированы в mgf файл с помощью программы ProteinPilot (version 4.5). Для этой процедуры ProteinPilot был запущен в режиме идентификации со следующими параметрами: алкилирование цистеинов йодацетамидом, гидролиз трипсином, прибор TripleTOF 5600 и поиск белков, детектируемых с порогом 95,0%, по базе данных SwissProt, таксон HomoSapiens (версия 2013 03, со 150600 элементами). Для идентификации белков был сгенерирован список пиков, который анализировали программой MASCOT (версия 2.2.07) и X! Tandem (CYCLONE, 2013.2.01) с использованием базы данных Uniprot KB, таксон S. aureus (штамм Newman) (версия 03.02.2014). Проверка статистической достоверности идентификаций осуществлялась на основании поиска по реверсированной базе данных белковых последовательностей (decoy reversed database).
Для определения функциональной аннотации идентифицированных белков был использован онлайн-сервис STRING-db [http://string-db.org] и баз данных Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Gene Ontology (GO), PFAM и INTERPRO, было достоверно (p 0,05) выявлено более 100 кластеров взаимодействующих белков.
Данный раздел работы выполнен в соответствии с [131] на базе Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова под руководством Р.К. Зиганшина сотрудником В.О. Шендер, за что выражаем глубокую благодарность. Полученные данные позволили автору определить основные функциональные группы протеинов, входящих в состав антигенных препаратов.
Культивирование штамма S. aureus №6 для последующего использования в качестве продуцента белоксодержащих антигенов
При сравнительном изучении геномных последовательностей 58 секвенированных штаммов S. aureus было определено, что 24 поверхностных белка вовлечены в адгезию и 13 секретируемых белков участвуют в уклонении от иммунного ответа, причем только 8 генов, кодирующих соответствующие белки, присутствуют во всех секвенированных геномах и 13 – в большинстве [100]. Это позволило авторам заключить, что в состав эффективной вакцины должна входить смесь, отражающая все варианты антигенов, входящих в состав естественной популяции S. aureus. Поэтому группа исследователей провела протеомный анализ различных изолятов S. aureus и показала, что они продуцируют поверхностные секретируемые белки IsaA, LytM, Nuc, пропептид Atl (pro-Atl) и 4 фенол-растворимых модулина (PSM) [105, 141, 143]. У пациентов, колонизированных S. aureus, был установлен высокий уровень IgG ко всем приведенным белкам. При изучении влияния на бактериемию и кожную инфекцию этой 8-компонентной смеси при активной иммунизации (при 2-кратном подкожном введении мышам BALB/cBYJ) был также установлен высокий уровень IgG антител ко всем антигенам (кроме pro-Atl, который был на 1 log ниже), что свидетельствует о распознавании этих антигенов иммунной системой мышей. При этом, у иммунизированных мышей, по сравнению с контролем (неиммунизированные мыши), не отмечено ни снижения высеваемости (из крови, легких, селезенки, печени и почек на модели бактериемии при заражении 3105 КОЕ S. aureus USA300), ни летальности, не выявлено ослабления кожной инфекции (при внутрикожном заражении изолятом S. aureus Pв дозе 3107 КОЕ) [143]. Эти результаты, по мнению авторов, свидетельствуют об иммуногенной активности изученных антигенов, как на мышиной модели, так и на людях, при отсутствии на мышиной модели их протективного действия.
Приведенные выше данные свидетельствуют об антигенной активности выделенных белоксодержащих антигенов (высоком уровне IgG к ним), что определило интерес к проведению их протеомного анализа.
Ранее был определен спектр белков «исходного» препарата, которые синтезирует и выделяет в культуральную среду S. aureus № 6 на ранней стадии роста – в конце экспоненциальной фазы [57]. С помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим (LC-MS) анализом был исследован спектр секретированных белков с молекулярной массой, преимущественно 30-50 кДа, для которых были получены предварительные результаты о протективной активности. В результате исследования всего было выявлено 208 пептидов, из них было идентифицировано 11 белков; остальные компоненты, обнаруженные при электрофорезе в геле, предположительно являлись полисахаридами или пептидогликанами, как ранее отмечено в секретируемых белковых препаратах K. рneumoniaе [25]. С помощью программы PSORTb, базы знаний UniProt (UniProt Knowledgebase) [140] и базы данных Европейского института биоинформатики было установлено цитоплазматическое происхождение 7 из 11 идентифицированных белков. Учитывая изоэлектрические точки идентифицированных белков (два белка находятся в щелочном диапазоне, остальные – в области кислых значений рН) было высказано предположение об образовании комплексов, имеющих нейтральный заряд, что является одним из важных условий молекулярного транспорта белкового комплекса через клеточную мембрану. Таким образом, в исследовании было выявлено минимальное количество белков, которые синтезирует бактерия при выходе из фазы покоя: это 2 белка – экспортера, содержат N-концевые сигнальные пептиды, 5 - ферменты углеводного обмена, 2 - участвуютв биосинтезе жирных кислот и декарбоксилировании глицина и супероксиддисмутаза – фермент, способный обеспечивать течение окислительно-восстановительных реакций. Успешная работа этих ферментов обеспечивает бактерию всем необходимым для дальнейшего развития, а нарушение их работы может быть сигналом о плохих внешних условиях, что может блокировать развитие популяции. Следует отметить, что изученный «исходный» белоксодержащий препарат явился основой для фракционирования.
При протеомном исследовании II фракции из всех обнаруженных белков особое внимание было уделено белкам с молекулярной массой 30-90 кДа. В некоторых случаях были также учтены белки (5 белков, отмеченных в табл. 8), идентифицированные ранее при протеомном анализе «исходного» препарата (фруктозо-1,6-бифосфат альдолаза 1 класса, фосфоглицерат киназа, триозофосфат изомераза, супероксиддисмутаза, белок Н системы расщепления глицина) [57] или относящиеся к факторам вирулентности и стрессовым белкам, которые, по своему участию в биологических процессах, были разделены на 4 группы (таблица 8): – наиболее многочисленную (19 белков), как и в первом исследовании, составляют ферменты углеводного обмена с цитоплазматической локализацией (13 белков; один белок № 9 – фосфопируват гидратаза – отмечается также внеклеточно); у 6 белков локализация не установлена. Из белков этой группы 9 (№№ 1-9) участвуют в гликолизе / глюконеогенезе, в метаболизме и катаболизме углеводов; 2 фермента (№ 10 – глицеральдегид 3фосфат дегидрогеназа А и № 11 – глицеральдегид-3фосфат дегидрогеназа В) – в гликолизе, в метаболизме углеводов; № 12 – глюкозо-6-фосфат-1 дегидрогеназа – в метаболизме углеводов, в окислительно восстановительном процессе; № 13 – пируваткарбоксилаза – в глюконеогенезе; № 14 – 6-фосфоглюконат дегидрогеназа – в пентозофосфатном цикле, в метаболизме и катаболизме углеводов, 2 фермента (№ 15 – дигидролипоамид-ацетил-трансфераза (Е2) и № 16 – дигидролипоамид дегидрогеназа (Е3)) – в гликолизе, относясь к ферментам пируват-дегидрогеназного комплекса; №17 – D-аланин-полифосфорибитол лигаза и № 18 – рибокиназа – участвуют, соответственно, в биосинтезе липотейхоевой кислоты и в метаболизме пентозы на этапе фосфорилирования. Следует подчеркнуть, что 8 приведенных ферментов (№№ 7, 10, 11, 4, 8, 9, 5, 6) участвуют в ключевых этапах гликолиза: изомеризация производного глюкозы и дальнейшее фосфорилирирование с возникновением триозофосфата, который окисляется до 3 фосфоглицериновой кислоты с последующим переходом через 2-фосфоглицерат в пируват, который на заключительном этапе гликолиза превращается в лактат. Кроме того, часть пирувата декарбоксилируется в аэробных условиях при участии ферментов пируватдегидрогеназного комплекса (№№ 15 и 16) и окисляется в ацетил-КоА, который затем проходит превращения в цикле трикарбоновых кислот. При этом, особенно в дыхательной цепи (в аэробном процессе), а также в анаэробном гликолизе происходит накопление энергии; среди идентифицированных белков отмечены также 6 белков, относящихся к факторам патогенности (№№ 20 и 21 – хлопьеобразующие факторы А и В, №№ 23 и 24 – серин-аспартатные белки С и Е, № 25 – гаптоглобин связывающий поверхностный белок) и 4 стрессовых белка (№ 26 – молекулярный шаперон Hsp31, № 27 – супероксиддисмутаза, № 28 – тиоредоксинредуктаза, № 29 – АТФ-зависимая протеиназа). Следует обратить внимание на супероксиддисмутазу, являющуюся хорошо известным компонентом ответа на окислительный стресс. Ранее было показано резкое повышение экспрессии этого ферментаименно в конце экспоненциальной фазы роста S. aureus [47] и его способность участвовать в окислительно-восстановительных реакциях, в частности, в транспорте энергии, которая высвобождается при метаболизме углеводов; остальные белки (№№ 30-46) составляют обширную группу белков, участвующих в других метаболических и биосинтетических процессах.
С использованием таких же протеомных методов исследователи идентифицировали сотни белков [102, 132, 151]. Так, A.K. Ziebandt с соавт. [151] определили 43 внеклеточных белка S. aureus, а M. Nakano с соавт. [102] идентифицировали 29 внеклеточных белков, образуемых метициллин-резистентными штаммами S. aureus. При изучении встречаемости белков в экзопротеоме 25 клинических изолятов S. aureus, из 63 идентифицированных секретированных белков только 7 выявлены во всех изолятах (Aly, IsaA, Lip, LytM, Nuc, SA0620 и SA2097) [132]. Следует отметить, что, несмотря на использование в анализе той же программы Mascot, которая была применена и в нашем исследовании «исходного» белоксодержащего антигена, в нем выявлен лишь белок – SA0295, один из редко отмеченных авторами (менее, чем в 20% изученных штаммов). Как уже отмечено (глава 1.3), M.J. Sibbald [132] заключает, что пластичность генома S. aureus является одним из факторов, влияющих на гетерогенность профиля экзопротеома, и обоснованно делает важные предположения о том, что, во-первых, гетерогенная экспрессия генов, в частности, генов вирулентности, наблюдаемая in vitro, в еще большей степени влияет на вариабельность in vivo; во-вторых, с этими различиями в вирулентности штаммов могут быть связаны различия в клинических симптомах хозяина; в-третьих, поскольку сравнение профилей экспрессии генов вирулентности штаммов-изолятов выявило, что они индуцируют весьма сходные симптомы, исследователи надеются идентифицировать протеомное обозначение симптомов, что поможет понять специфические механизмы патогенности; в-четвертых, показано, что носительство S. aureus повышает уровень высоко селективного и протективного антительного ответа на суперантигены колонизирующих штаммов. Подобно этому, специфический адаптивный иммунный ответ может усиливаться в ответ на другие факторы вирулентности, которые также варьируют между штаммами. Автор предполагает, что этим можно объяснить тот факт, что у носителей S. aureus, у которых впоследствии развивается бактериемия, лучший прогноз, чем у не носителей.
Протеомный анализ внеклеточных белоксодержащих антигенов
Ранее с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс спектрометрическим анализом был изучен спектр секретированных белков «исходного» препарата [57]; в настоящей работе проанализированы по своему участию в биологических процессах и охарактеризованы белки, входящие в состав II фракции: установлено, что из 46 идентифицированых белков 19 участвуют в углеводном обмене, 6 и 4 относятся, соответственно, к факторам патогенности и стрессовым белкам; остальные 17 участвуют в других метаболических и биосинтетических процессах. Из идентифицированных белков лишь 5 были выявлены среди 11 охарактеризованных ранее в составе «исходного» препарата [57], в том числе супероксиддисмутаза. Важно отметить, что в состав перспективной кандидатной вакцины SA4Ag фирмы Pfiser, находящейся на II фазе клинических испытаний, входит MntC - металл-связывающий компонент, являющийся в том числе кофактором супероксиддисмутазы, которая экспрессируется in vivo, и на основании этого исследователи предполагают MntC перспективным компонентом для включения в вакцину [72]. Необходимо подчеркнуть, что в исследованиях других авторов с использованием таких же протеомных методов, как в наших исследованиях, идентифицированы сотни белков [102, 132, 151], однако изучение встречаемости белков в экзопротеоме клинических изолятов S. aureus показало, например, у 25 изолятов наличие лишь 7 из 63 идентифицированных белков [132]. Такая гетерогенность профиля экзопротеома, по мнению автора [132], сказывается на гетерогенной экспрессии генов, в частности, генов вирулентности, наблюдаемой in vitro, и, в ещё большей степени, влияет на вариабельность in vivo. Все это, особенно учитывая большое количество факторов патогенности и сложности моделирования стафилококковой инфекции, в итоге влияет на успешность поиска универсальных протективных комплексов.
Для изучения иммуногенной активности выделенных антигенов были получены сыворотки по разработанным нами схемам и установлен высокий уровень специфических IgG-антител, особенно в кроличьих сыворотках. Эти сыворотки изучены в экспериментах пассивной защиты мышей и установлены значимые различия их протективной активности в сравнении с контролем. Изучение протективной активности белоксодержащих антигенных препаратов, в опытах активной защиты мышей разными иммунизирующими дозами показало высокий индекс эффективности (2,63 – 4,28) при иммунизирующих дозах: «исходного» - 3,0 и 12,0мкг, I и II антигенов – по 1,2 мкг.
Для определения влияния антигенных препаратов на течение инфекционного процесса была разработана модель генерализованной стафилококковой инфекции, заключающаяся в ретроорбитальном заражении мышей линии BALB/c сублетальной дозой, составляющей 0,1 LD50 S. aureus № 6, с последующим через 1, 4 и 7 суток изучением высеваемости S. aureus из органов. Через 4 суток у мышей, иммунизированных «исходным» препаратом, установлено отсутствие высеваемости из селезенки при дозе 12,0 мкг и тенденция к снижению - при 3,0 мкг. Изучение динамики высеваемости из почек показало значимые различия с контролем при иммунизирующих дозах 3,0 мкг – через 7 суток и 12,0 мкг – через 4 суток; выявлена тенденция к снижению количества мышей с высевами (в %) через 9 суток после заражения при иммунизации 1,8 мкг «исходного» и 1,2 мкг II антигенов, по сравнению с контролем. Анализ высеваемости из почек (по КОЕ/г) показал значимые различия с контролем через 7 и 9 суток после заражения при иммунизации, соответственно, 3,0 мкг «исходного» и 1,2 мкг II антигенов. Таким образом, наряду с установленным протективным действием изучаемых антигенных препаратов при иммунизации мышей, выявлено и снижение высеваемости из органов.
В процессе последующих исследований, особенно с учетом сложности моделирования стафилококковой инфекции, определилась необходимость установления воздействия антигенных препаратов на микроструктуру органов мышей при иммунизации. Так, изучение влияния «исходного» препарата на микроструктуру органов мышей при иммунизации 3,0 мкг не выявило значительных изменений в почках, лёгких и селезёнке животных. В тоже время при увеличении дозы до 12 мкг отмечены существенные изменения структуры почки: просветы канальцев были заполнены белковыми массами и наблюдалась гидропическая дистрофия эпителия канальцев, которая, однако, не приобрела характер массового поражения всех канальцев почки. Были отмечены также выраженные морфологические изменения при анализе препаратов легких и селезенки при введении максимальной иммунизирующей дозы. Эти результаты подтвердили целесообразность дальнейшего фракционирования «исходного» белоксодержащего антигена, несмотря на установленную его протективную активность, и поиска необходимых критериев для детального исследования влияния изучаемых антигенов на морфологическом уровне.
В связи с этим была разработана «почечная модель» при генерализованной стафилококковой инфекции, что позволило провести изучение морфологических изменений почек мышей, иммунизированных «исходным» антигеном и выделенными из него фракциями - I и II, в том числе после заражения S. aureus. Анализ показал, что, в целом, структура почки не нарушалась – в органе четко определялись корковое вещество с почечными тельцами и извитыми канальцами, мозговое вещество, система кровеносных сосудов, осуществляющих кровоснабжение корковых и юкстагломерулярных нефронов, хорошо выявлялся сосочек и почечная лоханка. Наблюдалась лейкоцитарная инфильтрация стромы различной степени выраженности, наиболее значительная - в почках контрольных (не иммунизированных) мышей. При иммунизации II препаратом было установлено значимое снижение межканальцевой и периваскулярной лейкоцитарной инфильтрации. При этом, в почках контрольных мышей (неиммунизированных, зараженных S. aureus) выявлены изменения, специфичные для поражения стафилококковой инфекцией (некротический папиллит), значительно чаще встречалось уплощение эпителия канальцев и гиперемия органа.
Оценка формирования абсцессов в почках с использованием предложенных объективных показателей - определения процента площади почки, поврежденной абсцессами, и процента полей зрения с абсцессами -выявило способность «исходного» (в иммунизирующих дозах 3,0 и 1,8 мкг) и II антигенов снижать эти показатели, что свидетельствует об уменьшении количества формирующихся абсцессов и их величины и согласуется с результатами высеваемости стафилококка из почек.
Известно, что бактериальные токсины являются одной из причин развития гидропической дистрофии почек, которая резко снижает функцию органов и тканей и со временем может привести к фокальному колликвационному некрозу клетки [23]. Анализ морфологических изменений в почке экспериментальных мышей показал, что при иммунизации белоксодержащими антигенами, в особенности II фракцией, достоверно снижался процент полей зрения с повреждениями почки гидропической дистрофией после заражения S. aureus, то есть иммунизация данными препаратами способствовала защите почек от повреждения стафилококковыми токсинами.