Введение к работе
Актуальность проблеми. В ответ н» :-С:^н^чме томаератури, рН и осмотического лявлп::л, иогдейстние ультрафиолетового света, ток-і.і-іо =w*x лймии^скж-: соединений, голодание индуцируется синтез специфических протеинов, важных для адаптации к новым условиям, а также для защиты организмов против дальнейшего потенциального воздействия стресса.
С другой стороны, известно, что факторы внешней среды модифицируют мутагенную активность химических соединений как в микробных тест-системах, так и в культурах клеток млекопитающих. Как было выяснено, одна из причин - это химическое разложение соединений под влиянием таких факторов, как температура, рН раствора. Деструкция веществ ведет к появлению продуктов со сниженной или повышенной мутагенной активностью. Итак, мутагенная и генотоксическая активность веществ до момента попадания в клетку или живой организм изменяется под влиянием физических факторов и зависит от физико-химических свойств соединений.
В клетке, или в живом организме химические соединения подвергаются биотрансформации. Метаболизм и продукты реакции конъюгации ксенобиотиков с биомолекулами способствуют усилению или снижению потенциальной генотоксической активности химических веществ.
Кроме того, исследования в области физиологии и биохимии свидетельствуют о влиянии условий культивирования на структуру и функции клеточной мембраны, что определяет транспорт химических веществ в клетку. При попадании в клетку химические вещества вмешиваются в критические для клетки события, синтез ДНК, протеинов ( Chu G.L. et al., 1987; Lenaire J. et al., 1986; Morgan R.W. et al., 1986; Reiner A. et al., 1990). Активность многих ферментативных систем в клетках зависит от значений цитоплазматического рН, от изменения направления протонной движущей силы, регуляция которой находится под контролем системы гомеостаза клетки (Doppler W. et al., 1987; Qrinstein S. et, al., 1989; Ober S. et al., 1987).
Исследования по тестированию химических соединений на мута-
генную активность свидетельствуют, что даже в случае тщательного учета физико-химических характеристик соединений и идентификации продуктов их метаболизма, обладающих мутагенной активностью, возможно появление ложных позитивных и ложных негативных ответов. Причинами появления таких результатов являются сопутствующие факторы, специфические для используемых тест-систем (фаза роста или стадия клеточного цикла, функциональное состояние клеток, эффект взаимодействия тестируемого вещества с культуральной средой и условия культивирования) (Тарасов В.А., 1994). Вариабельность результатов тестирования ксенобиотиков в различных краткосрочных тест-системах является одним из препятствий для прогностической оценки их генотоксической активности. Выяснение причин вариабельности ответов при биотестировании химических соединений открывает путь для решения этой проблемы.
Данные, полученные как на бактериальных тест-системах, так и на культурах клеток эукариот, свидетельствуют об индукции геноток-сических эффектов физико-химическими факторами ( Керкис Ю.Я., 1939; Лобашев М.Е., 1976; Claes R., 1989).. Широко известные явления такие, как инсерции, рекомбиногенные события, непропорциональная репликация ДНК, амплификация различных групп генов, в том числе и онкогенов, а также изменение экспрессии генов через метилирование цитозина индуцируются стрессами, что в конечном итоге ведет либо к изменению уровня спонтанного мутирования, либо к потере контроля точности хромосомной сегрегации в митозе клеток эукариот (Ayres К. et al., 1982; Babich М. et al., 1986; Bonatti S. et al., 1989; Bradbury J. et al., 1983). Кроме того, существуют факты, дающие основание предполагать, что события,'развивающиеся при воздействии различных видов стрессов, могут быть обычными метаболическими ситуациями, связанными с фазами клеточного роста бактериальных культур, или стадиями клеточного цикла клеток млекопитающих (Bradbury J. et al., 1983; Doppler W. et al., 1987; Grinstein S. et al., 1989; 6ross J.D., 1983).
Так как, в процессе деления клеток, клеточные системы находятся в состоянии периодически меняющегося ферментативного профиля, обеспечиваощего переход клеток на другой уровень метаболизма, то активное вмешательство в критические моменты клеточного цикла сопровождается нарушениями, которые могут проявиться в ингибирова-нии митозов, одно-двунитевых разрывах ДНК, снижении синтеза ДНК,
усилении репарационных процессов и ингибировании трансляции (Ing-ber D.E. et al., 1990; IngrahamJ., 1987; Konlngs A.W., 1986; L'Allemain G. et al., 1984; Lugtenberg B. et al., 1976; Matters G.L. et al., 1986). Известно, что в ответ на изменение условий инкубирования как в бактериальных клетках, так и в клетках эукариот индуцируются несколько высококонсервативных совместно регулируй»-систем: гены теплового шокд, ха"сг*^«-;а и рМ-гсы-иигаая ( Rtnghaiii f>.J. cL ні., 1330; Botsf'ord J.L., 19УО; Csonka L.N., 1989; Gross С A. et al., 1990).
С другой стороны, анализ литературы показал, что одной из общих точек, между ответом клетки на иаменение условий среды и процессом реализации повреждения наследственного материала клеток, является система метаболизма тиол-содержащих низкомолекулярных соединений, в: частности глутатиона (GSH). Существуют доказательства об участии низкомолекулярных тиолов в снижении или усилении мутагенного потенциала химических соединений. В то же время, различные виды стресса регулируют содержание низкомолекулярных тиолов в клетке ( Alsicu P. et al., 1987; Bayer U. et al., 1981; Oktyabrsky O.N. et al., 1993a; Oktyabrsky O.N., et al 1993b).
В клеточном метаболизме как прокариот так и эукариот глутати-он выполняет важные функции: защита макрсмолекудярных веществ элиминированием патологических дисульфидных мостиков белковых молекул; участие в реакциях, катализируемых глутатион-Б-трансферазой; связывание реактивных интермедиатов, в результате чего формируются глутатион-кояъюгаты, которые могут взаимодействовать с клеточными макромолекулами; участие в синтезе дезоксирибонуклеотидов, предшественников ДНК и в синтезе эндогенных компонентов эукариотичес-ких клеток (Chan J.Y.H. et al., 1986; Cochrane Ch.G., 1991; Crystal R.G., 1991). Кроме того, сульфгидрил/дисульфидное соотношение определяет активность ряда ферментов, участвующих в транспорте аминокислот через мембрану клетки, ответ клеток на митогены, синтез ДНК, протеинов и т.д. (Cole S.P.C. et al., 1991; De Flora S. et al., 1989; De Flora S., et al., 1991; Hill K.E., et al., 1984).
Несмотря на общность физиологических функций глутатиона у микроорганизмов и эукариот, отличия в его содержании, зависимость кинетики метаболизма глутатиона от физиологического состояния клетки являются индивидуальными характеристиками не только различных видов, но и штаммов одного вида клеток. Например, уровень глу-
татиона, изменение его концентрации при воздействии стресса и период восстановления после снятия стресса различны у двух штаммов Escherichia coli - К12 и В/г (Oktyabrsky O.N. et al., 1993b) и культур клеток Chinese hamster ovary (CHO) и Chinese hamster ovary Kl (CHO Kl) (Griffith O.W. et al., 1979). Выяснение звеньев цепи: условия инкубирования —> содержание глутатиона —> генотокси-ческая активность, - по нашему мнению, могут дать полезную информацию для интерпретации генотоксической активности химических соединений в различных краткосрочных тест-системах.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение влияния стресса на мутагенную активность алкилирующих соединений и асбеста, и определение роли низкомолекулярных тиолов в формировании генотоксических эффектов, вызванных различными типами стресса.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
изучение влияния рН среды на частоту индуцированных мутаций в бактериальной тест-системе и в клетках Chinese hamster ovary (CHO);
изучение влияния ацетат и метиламина на мутагенную активность ал-килирующего соединения (на микроорганизмах и клетках эукариот) и асбеста (на клетках эукариот);
изучение влияния температурного шока на мутагенез;
изучение модифицирующего действия гиперосмотического шока на частоту мутаций;
изучение влияния содержания внутриклеточного глутатиона на мутагенез, пролиферативную активность и кариотипическую нестабильность клеток в условиях стресса.
Научная новизна и ценность работы.
. В работе впервые выявлена наиболее значимая в прогностическом отношении модификация мутагенной активности прямого и потенциального алкилирующих соединений и асбеста в ответ на изменение условий инкубирования. Дан сравнительный анализ мутагенной активности соединений в трех краткосрочных тест-системах, широко используемых в практике тестирования химических соединений. На основании анализа результатов установлено: чувствительность или резистентность тест-объектов к мутагенному действию химических соединений зависят от состояния репарационной системы и является видоспецифической. Впервые показано, что одним из звеньев механизма"видоспецифической
зависимости является активность глутатион-зависимых реакций и индивидуальная особенность регулирования содержания глутатиона в клетке. Снижение уровня восстановленного глутатиона под влиянием стрессов или в результате ингибирования глутатион-зависимых реакций снижает мутагенную активность алкилирующих соединений типа Н-метил-ЬІ'-нитро-І^-нитрозогуанидина (МННГ) или циклпфпгл~~—„, Проведено изучение зависимости ттрс^ііорА-гкннсй активносте :і корио-т'^ті'лг-ііой ннст?.5;ишНости кл?тс-к СПи с нормальным и истощенным со-дораанием редуцированного глутатиона.
Блок синтеза глутатиона активирует процессы ответственные за кариотипическую нестабильность культуры клеток СНО. Количество клеток с гетероплоидным набором хромосом, в культурах обработанных мутагенами, может быть снижено изменением условий культивирования и ингибированием глутатион-зависимых реакций.
Основные положения диссертации выносимые на защиту:
-
Экспериментальное обоснование модифицирующего воздействия различных видов стрессов на процесс мутагенеза в штаммах Esheric-hia coli В/г WP2, Salmonella typhimurium ТА 1535 и в клетках Chinese hamster ovary.
-
Особенности развития мутагенеза в культурах клеток с нормальным и сниженным содержанием восстановленного глутатиона.
-
Доказательства, подтверждающие влияние различных видов стрессов на пролиферативную активность и кариотипическую стабильность культур в зависимости от уровня восстановленного глутатиона в клетке.
-
Экспериментальные данные, подтверждающие влияние стрессов на цитостатическую активность циклофосфамида и асбеста и их способность индуцировать количественные хромосомные изменения в культурах с нормальным и сниженным содержанием глутатиона.
Работа проведена согласно координационному плану РАН (регист
рационный номер от шифр )" " и выполнена в Институте экологии
и генетики микроорганизмов УрО РАН на базе лаборатории химического мутагенеза (руководитель - к.м.н. В.А. Демаков).
Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на Координационном совещании по проблеме "Эколого-генетические последствия воздействия на окружающую среду антропогенных факторов", г.Сыктывкар, 1989; на Международной конференции "Мутагены и канцерогены", Прага, 1991; на Международной конференции "Загрязне-
- б -
ниє окружающей среды", С.-Петербург, 1995.
По теме диссертации опубликовано 6 работ. Объем и структура работы.
Диссертация состоит из введения, 3 глав, обсуждения, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 128 страницах машинописного текста, включая 27 таблиц. Список литературы содержит 212 наименований работ на русском и английском языках.