Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Биология, экология и патогенность L. monocytogenes 11
1.1.1 Общие сведения о листериях 11
1.1.2. Распространение листериоза среди людей 12
1.1.3. Листериоз домашних животных 16
1.1.4. Распространение листерий в природных очагах 18
1.2 Основные механизмы внутриклеточного размножения 20
1.3 Структурно-функциональная характеристика факторов инвазии семейства интерналинов 24
Глава 2. Материалы и методы 35
2.1.Материалы. 35
2.2 Микробиологические методы 44
2.2.1 Условия культивирования. 44
2.2.2 Подготовка компетентных клеток для электропорации. 44
2.2.3. Подготовка культуры для инфицирования эукариотических клеток 45
2.2.4. Подотовка культуры для инфицирования мышей 45
2.2.5. Приготовление лизатов L. monocytogenes для ПЦР 45
2.2.6. Электропорация 46
2.3. Молекулярно-генетические методы. 46
2.3.1. Праймеры, использованные в работе 46
2.3.2. Полимеразная цепная реакция.
2.3.3 Выделение фрагментов ДНК из геля и подготовка к секвенированию 49
2.3.4 Определение нуклеотидной последовательности
2.3.5. Рестрикция 49
2.3.6. Лигирование 50
2.4. Биологические методы 50
2.4.1. Клеточные линии и условия их культивирования 50
2.4.2. Определение эффективности инвазии. 51
2.4.3. Экспериментальная модель листериоза с внутривенным путем инфицирования. 52
2.4.4 Экспериментальная модель листериоза с интрагастральным путем инфицирования . 52
2.4.5 Экспериментальная модель листериоза с внутрибрюшинным путем инфицирования. 53
2.5. Insilico методы 53
2.5.1. Анализ нуклеотидных последовательностей 53
2.5.2. Построение дендрограм 53
2.5.3. Анализ нуклеотидного разнообразия 53
2.5.4. Статистические методы. 54
Глава 3. Результаты собственных исследований 55
3.1 Характеристика штаммов, использованных в работе 55
3.2 Аллельный анализ inlB 58
3.3 Анализ аллельного разнообразия фрагмента гена inlA, кодирующего интерналиновый домен 67
3.4 Замены аминокислот в природных вариантах факторов инвазии 76
3.5 Структурные различия между природными вариантами интерналинового домена InlB 81
3.6 Конструирование изогенных штаммов L. monocytogenes для анализа функциональных различий между природными вариантами InlB 85
3.7 Различия в эффективности инвазии изогенных штаммов L. monocytogenes в клетки человека и мышей 88
3.8 Различия в эффективности и динамике инфекции мышей линии Balb/c 90
Глава 4. Обсуждение 99
Выводы 113
Список литературы
- Распространение листериоза среди людей
- Подготовка культуры для инфицирования эукариотических клеток
- Экспериментальная модель листериоза с интрагастральным путем инфицирования
- Конструирование изогенных штаммов L. monocytogenes для анализа функциональных различий между природными вариантами InlB
Распространение листериоза среди людей
L. monocytogenes относится к числу возбудителей сапронозов. Возбудители сапронозов в окружающей среде является частью природных микробных экосистем, характерными чертами возбудителя сапронозов являются убиквитарность - способные жить в широком диапазоне экологических условий и полипатогенность. Высокая метаболическая пластичность листерий обусловливает возможность перехода от сапрофитической фазы к паразитической и наоборот. Механизмы, позволяющие осуществить перенос возбудителей из природных очагов в антропургические, связаны с хозяйственной деятельности человека и развитием новых ранее не существовавших экологических условий обеспечивающих эффективное размножение возбудителя.
Другой характерной чертой возбудителей сапронозов являются полигостальность, т.е. способность колонизировать широкикй круг хозяев, и полипатогенность, т.е. способность вызывать патологический процесс в широком круге хозяев. Листерии в полной мере характеризуются этими понятиями. Японскими исследователями в период с 1991 по 1993 было исследовано содержимое кишечника 623 млекопитающих (11 видов) и 996 птиц (18 видов) добытых в 10 префектурах Японии. Было выделено 38 (6,1%) изолятов рода Listeria из 7 видов млекопитающих: японская макака (20%), красная лисица (13,3%), енотовидная собака (11,5%), гималайская цивета (9,1%), японская куница (3,9%), дикий кабан (2,7%), пятнистый олень (1,1%). Среди выделенных изолятов доля L.monocytogenes составила 1,0%.
На территории Дальнего Востока РФ, т.е. в регионе, географически близком Японии также были выявлены природные очаги листериоза. Так, в совместной работе ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России и ФГБНУ «НИИЭМ им. Г.П. Сомова» были выделены изоляты L.monocytogenes из объектов окружающей среды и продуктов питания, от диких животных, мышевидных грызунов, гидробионтов. Было исследовано 654 образца биоматериала от диких грызунов, L.monocytogenes была обнаружена в 1,1% проб. Из 986 образцов, полученных от гидробионтов, листерии обнаружены в 1,4%. В пробах воды L.monocytogenes выделена из 4,9% образцов. В пищевых продуктах листерии были обнаружены в 0,4% морепродуктов, 1,4% в мясе, 0,6% молочных продуктов, 2,0% мясе птицы. (Zaytseva et al, 2007). В европейской части России так же найдены несколько очагов листериоза. В результате исследований фекалий животных установлено, что дикие парнокопытные, обитающие на территориях Тверской, Московской, Калужской и Владимирской областей являются носителями в желудочно-кишечном тракте листерий - Listeria monocytogenes и Listeria innocua. На территориях ГПЗФЗ «Таруса» и НП «Завидово», расположенных в Калужской, Тверской, Московской областях, где выполняются все необходимые профилактические мероприятия, листерионосительство пятнистым оленем составило 5,5 и 8,7 %, кабаном - 6,6 и 7,8 %, а маралом - 0 и 6,0 %, соответственно. Аналогичные показатели для пятнистого оленя и кабана, обитающих на территории Суздальского ГООХ Владимирской области, где не имеется возможности проведения в полном объеме ветеринарно-санитарных и охото-устроительных мероприятий, составили 34,5 и 24,0 %, соответственно. (Егорова И. Ю.,2013).
Значительная роль в распространении листериоза принадлежит грызунам. Описаны многочисленные случаи выделения листерий от серых крыс, домовых мышей, рыжих полевок, землероек, а также от гамазовых клещей и вшей, очесанных с грызунов на территории Москвы и Московской области в 60-е годы. Анализ частоты выделения листерий от грызунов показал, что листериями заражено 0,14% особей. Более пораженными оказались грызуны, отловленные в овощехранилищах и различных коммунальных объектах. В овощехранилищах в 1981-1984 гг. исследовали 1 547 проб и выделили 51 или 3,25% штамм листерий.
Таким образом, приведенные данные показывают, что листериоз является тяжелым заболеванием с высокой летальностью, а листерии -убиквитарными бактериями, широко распространенными в природных и антропургических очагах. Для контроля этой инфекции необходимо глубокое понимание механизмов ее развития и особенно, деталей взаимодействия листерий с эукариотической клеткой – местом размножения возбудителя в ходе инфекции.
Подготовка культуры для инфицирования эукариотических клеток
Реакционная смесь в объеме 25 мкл содержала: 2,5 мкл 10-кратного буфера, 1,5 мкл 25мМ MgCl2, 0,8 мкл 10мМ смеси НТФ, по 1 мкл каждого праймера в концентрации 3,75 пМ, 2,5 Ед фермента ДНК-полимеразы Taq (ООО «Бионем», Россия). На смесь наслаивали минеральное масло в объеме 15 мкл. ПЦР проводили в термоциклере Терцик (ДНК-технология, Россия) по следующей программе: 1 этап (1 цикл): 940С – 4 мин; 2 этап (30 циклов): 940С – 30 сек, 520С – 30 сек, 720С – 2 мин; 3 этап (1 цикл): 72 0С – 10 мин; Продукты амплификации выявляли методом гель-электрофореза, в 1% агарозном геле, приготовленном на основе трис-ацетатного буфера, с добавлением бромистого этидия до 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводили при напряжении 12В/см в течение 30 минут. Объем пробы составлял 5 мкл. 2.3.3 Выделение фрагментов ДНК из геля и подготовка к секвенированию.
Оставшуюся после аналитического электрофореза часть амплификационной смеси (примерно 20 мкл) разделяли в 1,5% легкоплавком агарозном геле (Bio-Rad, USA). Электрофорез проводили при напряжении 10В/см в течение 45 минут. Фрагменты ДНК вырезали из геля и очищали с помощью набора Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, USA). Подготовку проб к сиквенированию проводили по рекомендации Центра коллективного пользования «ГЕНОМ» (http://www.genome-centre.narod.ru/).
Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили в Межинститутском Центре коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/), организованном при поддержке РФФИ, с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730Applied Biosystems.
Рестрикцию ДНК осуществляли эндонуклеазой BamH1(Fermentas, Литва). Для проведения реакции в объеме 20 мкл брали: 0,9-1мкг ДНК, 16мкл деминерализованной воды свободной от нуклеаз(Sigma, США ), 2 мкл 10-кратного буфера для BamH1, фермента 20ед. Инкубировали в течение 2 часов, при температуре 37С. Инактивацию фермента проводили путем прогревания реакционной смеси при 80С в течение 20 минут.
Рестрикцию ДНК по сайтам узнавания эндонуклеазы XhoI(Fermentas, Литва) проводили при следующих условиях: 0,9-1мкг ДНК, 10ед. фермента XhoI, 2мкл 10-кратного буфера для XhoI, воды свободной от нуклеаз(Sigma,США) до 20мкл. Реакционную смесь инкубировали в течение 2 часов, при температуре 37С. Инактивацию фермента осуществляли при 80С в течение 20 минут.
Состав реакции для расщепления ДНК по сайтам SmaI, аналогичен приведенным выше, за исключением условий реакции. Реакционную смесь инкубировали при 30С в течение двух часов. Фермент инактивировали прогревая реакционную смесь при 65С в течение 25 минут.
Лигирование фрагментов ДНК осуществляли Т4ДНК лигазой (Fermentas, Литва). Состав реакции на 10мкл: ДНК-вектор 100нг, ДНК-вставка 20нг, 10-кратный буфер для Т4ДНК лигазы 1мкл, фермент 1-2ед. Инкубировали 18 часов, при 15С. Инактивацию проводили прогреванием при 65С - 15минут.
Для определения эффективности инвазии были использованы клеточные линии, полученные от человека НЕК293(ИБГ РАН), и мышевидных грызунов С26(ИБГ РАН). Клетки культивировали в среде DMEM (Пан-Эко, Москва) с добавлением 10% фетальной телячье сыворотки (HyClone, Бразилия), при 37С в атмосфере с 5% СО2. Для отделения клеток от пластика использовали раствор версена с трипсином 0,25%(Пан-Эко, Москва). Кратность пересевов использовали принятую для используемых клеточных линий 1:3-1:5. Криоконсервацию полученных линий производили в экспоненциальной фазе роста, для этого снимали монослой используя раствор Версена с трипсином, после отделения клеток от пластика добавляли к суспензии ростовую среду и центрифугировали 1000об/мин, 5 минут, после чего осадок ресуспендировали в среде для криоконсервации производства HyClone, согласно инструкции производителя. Для подготовки 24-луночного планшета, в каждую лунку вносили 1 104 клеток и культивировали при 37С в атмосфере с 5% СО2, до формирования 70-80% монослоя, после чего использовали для определения эффективности инвазии.
Указанные клетки выращивали на среде DMEM (ПанЭко, Москва) с добавкой 10% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, Бразилия) в 24-луночном планшете до монослоя 70-80%. После чего подсчитывали численность клеток в одной лунке. Для заражения использовали подготовленные культуры изогенных вариантов. Бактериальную суспензию разводили в среде DMEM без сыворотки используя множественность заражения 1:100. Инкубировали 1час при 37С в атмосфере с 5%СО2, после чего трижды промывали фосфатно-солевым буфером и вносили в лунки среду DMEM с добавкой гентамицина 100мкг/мл. Инкубировали 1час при 37С в атмосфере с 5%СО2. На следующем этапе трехкратно промывали лунки фосфатно-солевым буфером и вносили по 400мкл 1% Тритона Х-100. Инкубировали 10 минут, при 37С в атмосфере с 5%СО2, из полученного клеточного лизата приготовляли серийные разведения и делали высевы на плотные среды (ГРМ№1, Оболенск). Эффективность инвазии рассчитывали как отношение внутриклеточных бактерий к числу взятых для заражения.
Для наблюдения динамики инфекционного процесса была использована модель с внутривенным заражением мышей линии BALB/c. В эксперименте использовались самки массой 16-18 грамм. Заражали их внутривенно в дозе 106 микробных клеток, в объеме 100мкл. Динамику инфекционного процесса наблюдали, производя вскрытие опытных групп и высевы из внутренних органов печени и селезенки, через 6 часов, 24, 72 часа и пятые сутки.
Для внутрижелудочного заражения брали мышей линии BALB/c, самок массой 16-18 грамм. Животные перед введением были на 12часов лишены корма. Бактериальную суспензию в концентрации 1,5х108 вводили внутрижелудочно зондом, после чего мыши получали свободный доступ к корму. Оценку накопления бактерий в печени и селезенке проводили на третьи сутки.
Экспериментальная модель листериоза с интрагастральным путем инфицирования
Анализ аминокислотных замен в природных вариантах Iвторого фактора инвазии nlA показало, что, в отличие от InlB, у которого все идентифицированные аллели отличались также на уровне пептидной последовательности, аминокислотная последовательность InlA гораздо более консервативна (Рис. 5).
Аминокислотные замены в природных вариантах интерналинового домена фактора инвазии InlA. Показано разделение интерналинового домена на структурно-функциональные части: центральный LRR-домен и N-концевой C-cap-домен. Аллели разделены в соответствии с кластерами, к которым принадлежат на дендрограмме максимальной схожести (Рис.3). Фиксированные замены между филогенетическими линиями выделены розовым цветом. Фиксированная замена, отличающая кластеры выделена розовым. Аллели, кодирующие одинаковые аминокислотные последовательности сгруппированы и окрашены в разные цвета. Различающиеся аминокислотные последовательности обозначены римскими цифрами от I до VII.
12 аллелей давали всего 7 вариантов аминокислотной последовательности. В кластере I четыре и два аллеля, формирующие субкластеры на дендрограмме максимальной схожести нуклеотидной последовательности кодировали идентичные белковые последовательсноти (обозначенные I и II на Рис. 5). Аллель 1, формирующий независимую ветвь в рамках того же кластера, кодировал еще один вариант InlA. Единственным исключением был аллель 5, который входил в кластер, кодирующий вариант I, но кодировал, по нашим данным, белок с заменой аланина на пролин в 54 положении. В кластере II, родственные аллели 10 и 11 кодировали идентичные аминокислотные последовательности, а отдельные ветви, формируемые аллелями 7 и 8, – кодировали аминокислотные последовательности с заменами. Из 6 замен только одна, аспарагиновой кислоты на аспарагин в положении 118, фиксировано отличала кластер I от кластера II. Остальные замены не были фиксированными, что коррелирует с анализом нуклеотидной последовательности (Табл.12). Анализ амнокислотных посдедовательностей позволил выявить доминирующие варианты InlA (Табл. 16). Среди последовательностей, представленных в GenBank, для кластера I доминирует вариант I, кодируемый аллелями 2,3,4,12, а для кластера II – вариант VI, кодируемый аллелями 10 и 11.
В целом, анализ аминокислотных последовательностей подтвердил вывод, сделанный на основе анализа нуклеотидных последовательностей, о том, что фактор инвазии InlA более консервативен по сравнению с фактором инвазии InlB. Выявление аллельных комплексов, кодирующих идентичные последовательности, свидетельствует о реализации нейтральной модели отбора для InlA, поддерживающей оптимизированные аминокислотные последовательности. Такая модель более характерна для генов общего метаболизма. С другой стороны, эволюционное становление InlB, по-видимому, продолжается, о чем свидетельствуют большая вариабельность как на уровне нуклеотидной, так и аминокислотной последовательностей, а также данные эволюционного анализа, проведенного другими авторами (Tsai et al., 2006), и поэтому не повторенного в данной работе. Перечисленные наблюдения, а также то, что InlB характеризуется более выраженной связью с клональной структурой вида, более заметными различиями в представленности между штаммами в зависимости от источника выделения, и, наконец, наличием доминантных аллелей, занимающих выраженное доминирующее положение не только среди штаммов коллекции, но и среди популяции L. monocytogenes в целом, дали нам основания выбрать для дальнейшего исследования фактор инвазии InlB.
В сотрудничестве с лабораторией биологически активных наноструктур нами было проведено изучение структурных различий между вариантами InlB, кодируемыми доминантными аллелями. Как указано в предыдущих разделах результатов, доминантный аллель был выявлен в каждом из субкластеров дендрограммы максимальной схожести. Различия между доминантными аллелями включали фиксированные замены между кластерами, коррелирующими с филогенетическими линиями и субкластерами внутри линий. Такие замены были выявлены во всех структурно-функциональных частях интерналинового домена: LRR –домене и фланкирющих N-cap и Ig-подобном доменах.
Ни одна из замен не касалась ароматических остатков, необходимых для белок-белковых взаимодействий между InlB и его таргетным рецептором Met (Machner et al., 2001). В LRR – домене были выявлены 5 замен, изменяющие его гидрофобное ядро. Это замены I91V, I132V, L138I , L176I и I181V (Рис. 3 и Рис. 6, 7). Гидрофобное ядро погружено вглубь пептидной глобулы, поддерживает ее структуру и не участвует во взаимодействиях с другими белками. Однако по крайней мере одна замена, а именно валина на изолейцин в 91-й позиции, могла влиять на функциональные свойства InlB. Эта замена в 1м повторе LRR-домена (Рис. 6 и 7). Замена относительно небольшого валина на значительно более крупный изолейцин приводит к стерическому взаимодействию между изолейцином и фенилаланином в положении 53 N-cap-домена (Рис. 6 и рис. 8), что в свою очередь приводит к изменению взаимного расположения N-cap – и LRR-доменов и, соответственно, в конформации С-концевой части интерналинового домена.
Конструирование изогенных штаммов L. monocytogenes для анализа функциональных различий между природными вариантами InlB
В работах группы Roche (Temoin et al., 2008; Roche et al., 2009), XIV аллель inlB был идентифицирован в группе штаммов с низкой вирулентностью, отличавшихся от референс-штамма EGDe, несущего аллель XIII, также заменами в других основных факторах, включая InlA, PrfА, PI-PLC, ЛЛО, а также имевших протяженную делецию в гене фактора полимеризации актина ActA, нарушавшую способность этих штаммов к перемещению из клетки в клетку. Указанные штаммы показывали чрезвычайно низкий уровень инвазии в клетки человека кишечного эпителия человека СаСо-2 фибробласты Vero (Temoin et al., 2008). Авторы продемонстрировали, что экспрессия XIII аллеля inlB в этих штаммов существенно (в 50- 100 раз) повышает эффективность инвазии в эти типы клеток (Temoin et al., 2008). Полученные нами результаты находятся в соответствии с результатами других авторов, хотя увиденные нами на клетках эпителия почек НЕК293 отличия между XIII и XIVаллелями были существенно ниже – 3,5- 4 раза. Количественная разница между нашими и процитированными результатами может быть связана с типом клеток, а также условиями экспрессии: в то время как мы использовали изогенные штаммы, экспрессирующие один тип InlB, авторы использовали генетически близкие, но не изогенные штаммы, несущие как хромосомную копию inlB XIV аллеля, так и плазмидную копию inlB XIII аллеля, так что в результате могли быть получены гетерологичные варианты димеров InlB, поведение которых может отличаться. Как было отмечено выше, на клетках мышей С-26 результат изменений в эффективности инвазии был противоположный с большей эффективностью XIV аллеля.
В целом, результаты, полученные при изучении инвазии изогенных рекомбинантных штаммов in vitro, продемонстрировал, что все природные варианты InlB функционально активны, но уровени инвазии, опосредованные разными аллелями зависят от вида млекопитающего, из которого выделены клетки, а также, возможно, от типа клеток.
Выяснив эти факты, мы перешли к сравнению вирулентности изогенных рекомбинантных штаммов in vivo, на модели экспериментального листериоза лабораторных мышей. Несмотря на то, что естественным путем распространения листериозной инфекции являесят алиментарный, в качестве лабораторной модели чаще всего используют модель с внутривенным путем заржения (Milon, 1997; Condotta et al., 2012) Отчасти это связано, что первыми модель листериозной инфекции использовали иммунологи, а не микробиологи (Milon. 1997). Преимуществом внутривенного способа инфекции по сравнению с внутрибрюшинным является очень четкая и воспроизводимая динамика инфекции (Cabanes et al., 2008). Но больше всего именно внутривенная и отчасти внутрибрюшинная модели инфекции получили распространение, потому что пероральная (интрагастральная) инфекция мало эффективна по сравнению с другими путями инфекции (Cabanes et al., 2008; Disson et al., 2009).
В рамках нашей работы мы впервые показали, что относительная эффективность интрагастральной инфекции в лабораторных мышах зависит от последовательности InlB. Наихудшие результаты при таком способе заражения показывали бактерии, несущие IX аллель. Этот аллель бы найден в штаммах, относящихся к так называемому Эпидемическому клону 2 (epidemic clone 2, ЕС2). Этот вариант, связанные со вспышками пищевого листериоза на разных континентах, тем не менее, редко выявляется в животных, а случаев его выделения из природных очагов описано не было (Ragon et al., 2008). Согласно нашим данным и данным НИИЭМ им. Сомова и ВНИИВВиМ РАСХН, среди штаммов, выделенных в природных источниках, у I филогенетической линии чаще всего встречается I аллель InlB, а у II линии – аллель XIV (Zaitseva et al., 2007; Adgamov et al., 2012; Егорова, 2013; Voronina et al., 2015). Именно эти аллели показывали максимальную эффективность при интрагастральной инфекции, демонстрируя максимальное накопление в печени мышей, почти в 100 раз превышающее данные, полученные для IX аллеля. Аллель XIII, встречающийся как среди человеческих, так и животных изолятов, демонстрировал среднюю эффективность. Таким образом, наши данные впервые показывают, что аллели, распространенные среди изолятов, выделенных от животных – обитателей природных очагов, обеспечивают максимальную эффективность инфекции при пероральнм заражении лабораторных мышей.
Вместе с тем, данные по накоплению возбудителя во внутренних органах при внутривенном и внутрибрюшинном путях инфекции отличались от данных, полученных при интрагастральном заражении. Наиболее яркое отличие касалось XIV аллеля. Бактерии, несушие этот аллель, демонстрировали наибольшую эффективность инвазии в клетки мышей С26, наибольшее накопление на 31 день посе инфекции в печени, но при этом они были самыми малочисленными в печени и селезенке мышей, зараженных внутривенно. Значение этих данных не совсем понятно. Известно, что при внутривенном заражении 90 % бактерий через 10 минут после введения оказываются в печени, где уже через два часа регистрируется массовое скопление нейтрофилов (Wing and Gregory, 2002). Через 6 часов нагрузка возбудителя в печени падает в 10 раз, что обусловлено взаимодействием нейтрофилов и Купферовских клеток, первых клеток, куда листерии попадают в печени при внутривенной инфекции (Gregory et al., 2002). Роль активной инвазии в этом первом взамодействии не известна. Более того, Gregory и Wing предполагают, что InlB не является необходимым фактором патогенности при начальном взаимодействии, обеспечивая более поздние этапы инфекции, когда бактерии добираются до гепатоцитов (Gregory et al., 1997). Возможно, что более инвазивные бактерии более чувствительны к первому ряду обороны при внутриенной инфекции, хотя точные механизмы этого феномена не известны. Процесс развития интрагастральной инфекции детально изучен только на стадии пересечения эпителиального барьера, важная роль в котором принадлежит InlB (Pentecost et al., 2010). Вероятно, и дальнейшие этапы этого пути инфекции также в значительной мере зависят от InlB.