Влияние органических растворителей на морфофункциональные и наномеханические свойства родококков Коршунова Ирина Олеговна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Биологические особенности родококков и возможности их использования в биотехнологии 11

Глава 2. Применение органических растворителей в биокатализе гидрофобных соединений 15

2.1. Получение продуктов биокаталитических реакций с использованием устойчивых к растворителям штаммов микроорганизмов 18

2.2. Физиологические основы устойчивости бактерий к воздействию

Глава 3. Использование методов атомно-силовой и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в исследовании морфофункциональной

3.1. Исследование наноморфологии и упруго-механических свойств

3.2. Применение комбинированных систем микрокопирования в микробиологических исследованиях 38

4.1. Бактериальные штаммы и условия культивирования 41

4.2. Определение жизнеспособности родококков после воздействия

4.3. Исследование влияния органических растворителей на структурно-морфологические особенности родококков 48

4.3.1. Морфология клеточной поверхности 48

4.3.2. Адгезионные и упруго-механические характеристики клеток 50

4.4. Исследование влияния органических растворителей на физиологические свойства родококков 51

4.4.1. Дыхательная активность клеток 51

4.4.2. Определение работы эффлюксных насосов 51

4.4.3. Определение суммарных клеточных липидов 52

4.5. Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генов эффлюксных насосов 53

4.6. Статистическая обработка результатов 53

Результаты исследовании и их обсуждение 54

Глава 5. Исследование жизнеспособности родококков при инкубировании

Глава 6. Устойчивость родококков к органическим растворителям в зависимости от условий культивирования 62

Глава 7. Морфофункциональные свойства родококков при инкубировании в органических растворителях 69

Глава 8. Влияние органических растворителей на упруго-механические свойства клеток родококков 86

Глава 9. Изучение активности эффлюксных насосов при формировании ЗАКЛЮЧЕНИЕ 97

Выводы

• Физиологические основы устойчивости бактерий к воздействию
• Бактериальные штаммы и условия культивирования
• Исследование влияния органических растворителей на физиологические свойства родококков
• Морфофункциональные свойства родококков при инкубировании в органических растворителях

Введение к работе

Актуальность проблемы. Биокаталитические системы, включающие органические растворители в качестве среды для биотрансформации гидрофобных соединений, используются при получении регио-, стереоизомеров и энантиомеров с высокой химической чистотой, стабильностью и выходом целевого продукта (Braco, 1995; Cabral et al., 1997; Carrea, Riva, 2000). Существует несколько вариантов таких систем: (1) смеси водной среды и гидрофильного растворителя;

(2) двухфазные системы, состоящие из водной среды и гидрофобного растворителя;

(3) органические системы (Carrea, Riva, 2000; Schmid et al., 2001). При этом
в качестве биокатализаторов применяют целые клетки или ферменты
микроорганизмов. Использование целых клеток снижает стоимость производства
и число этапов пробоподготовки, а также обеспечивает защиту ферментов
от денатурации под действием растворителей (Ishige et al., 2005). Устойчивые
к растворителям бактериальные штаммы все чаще используют в современных
биотехнологических производствах, например, при получении ароматизаторов,
фармацевтических препаратов, химически чистых реактивов (Schmid et al., 2001;
Heipieper et al., 2007). Следует отметить, что проведение биокатализа в органической
или водно-органической среде позволяет увеличить выход целевых продуктов
трансформации водонерастворимых субстратов и облегчить процесс их выделения,
а также снизить вероятность образования побочных продуктов и обеспечить
термодинамическое равновесие реакционной системы (Безбородов и др., 2008; Braco,
1995; Cabral et al., 1997; Carrea, Riva, 2000; Schmid et al., 2001; Bhler et al., 2003;
Bhattacharyya et al., 2012; Zingaro et al., 2013).

Известно, что органические растворители нарушают структурную

и функциональную целостность мембран, приводя к гибели клеток. Обнаружена корреляция между токсичностью растворителя и его гидрофобностью, измеряемой как коэффициент распределения в системе н-октанол-вода logPo/w. Как правило, чем выше значение logPo/w, тем ниже токсичность растворителя для клеток (Sikkema et al., 1995). Однако, в литературе имеются противоречивые сведения о воздействии растворителей на различные группы микроорганизмов и не выяснены до конца закономерности формирования устойчивых к растворителям фенотипов (Isken, de Bont, 1998; Segura et al., 1999; Duque et al., 2010). Актинобактерии рода Rhodococcus являются перспективными агентами биотехнологии, они способны к селективной трансформации широкого спектра сложных органических веществ и устойчивы к экстремальным физико-химическим факторам среды (Ившина и др. 2007; de Carvahlo, 2010; Kuyukina, Ivshina, 2010; Ivshina et al., 2012). Поэтому актуально исследование механизмов устойчивости родококков к воздействию растворителей.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ) обеспечивает возможность изучения
структуры поверхности и наномеханических свойств микроорганизмов

в физиологических условиях среды (Dufrne, 2002). Сравнительно недавно
появились совмещенные системы сканирования, в частности АСМ и конфокального
лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), перспективные для анализа
морфологических, упруго-механических и наноструктурных перестроек

бактериальных клеток под действием органических растворителей (Flores, Toca-Herrera, 2009).

Цель настоящей работы – исследование влияния органических

растворителей на морфофункциональные и наномеханические свойства родококков и отбор устойчивых штаммов, перспективных для биотехнологического использования.

Основные задачи исследования:

1. Изучить влияние органических растворителей на жизнеспособность родококков и отобрать наиболее устойчивые штаммы.

2. Исследовать динамику морфофункциональных перестроек родококков при воздействии органических растворителей.

3. Определить упруго-механические и адгезионные характеристики устойчивых к растворителям клеток родококков.

4. Оценить роль эффлюксных насосов в формировании устойчивости родококков к органическим растворителям.

Научная новизна. Установлено, что актинобактерии рода Rhodococcus характеризуются высокой (72–119%) устойчивостью к воздействию гидрофобных растворителей (logPo/w 2,5) и чувствительны (22–46%) к гидрофильным растворителям (logPo/w 0,88). Выявлено 1,2–7-кратное повышение степени жизнеспособности родококков в присутствии растворителей при культивировании в богатой органической среде LB по сравнению с клетками, выращенными в минеральной среде RS. Показана способность родококков к диссоциации в присутствии н-декана и циклогексана с формированием более устойчивых (на 36–86%) к растворителям R-форм. С помощью комбинированного КЛСМ-АСМ сканирования впервые изучена динамика морфологических перестроек родококков под действием растворителей, выявлены изменения микро- и нанорельефа (на 14–79 и 1,3–2,5 нм соответственно) и увеличение относительной площади поверхности (на 5–9%) жизнеспособных клеток. В режиме силового АСМ-картирования обнаружено снижение модуля упругости и перераспределение адгезивных участков на поверхности клеток родококков под действием растворителей. Выявленные изменения морфологических и наномеханических свойств коррелировали с повышением количества суммарных липидов (на 9–42%) и скорости дыхания (на 1,4–15 мкл/мин) устойчивых к растворителям родококков. Впервые показано участие H⁺- и Na⁺-зависимых эффлюксных насосов в формировании устойчивости родококков к воздействию органических растворителей.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные
расширяют представления о механизмах устойчивости грамположительных бактерий
к воздействию органических растворителей. Выявленные адаптационные механизмы
включают изменение морфологических и наномеханических свойств и активацию
работы эффлюксных насосов. В результате исследования отобраны штаммы
родококков ‘R. longus’ ИЭГМ 32, ИЭГМ 69, ИЭГМ 589, R. opacus ИЭГМ 57, R. ruber
ИЭГМ 326, обладающие множественной устойчивостью к органическим
растворителям и перспективные для биотехнологического использования.
Разработан метод количественной оценки влияния растворителей на бактерии
с помощью комбинированного КЛСМ-АСМ-сканирования, включающий

дифференцированное определение морфометрических и наноупругих показателей живых и мертвых клеток. Разработанный метод и устойчивые к растворителям штаммы могут использоваться при оптимизации процессов биокатализа в двухфазных водно-органических системах.

Основные положения, выносимые на защиту:

5. Актинобактерии рода Rhodococcus характеризуются высокой (72–119%) устойчивостью к воздействию гидрофобных (logPo/w 2,5) и чувствительны (22–46%) к гидрофильным (logPo/w 0,88) растворителям. При этом отдельные представители ‘R. longus’, R. opacus и R. ruber характеризуются множественной устойчивостью к растворителям.

6. Родококки используют различные приемы морфофизиологической адаптации (изменение шероховатости и относительной площади поверхности, диссоциация и коагрегация клеток, повышение количества суммарных липидов и дыхательной активности) к воздействию органических растворителей.

7. Органические растворители снижают эластичность и изменяют характер распределения адгезивных участков на поверхности клеток родококков.

8. В формировании устойчивости родококков к органическим растворителям принимают участие H⁺ и Na⁺-зависимые, но не АТФ-зависимые эффлюксные насосы.

Апробация работы и публикации. Основные результаты исследований
доложены и обсуждены на VI, VII и VIII Всероссийском с международным участием
Конгрессе молодых ученых-биологов «Симбиоз-Россия», Иркутск, 2013,

Екатеринбург, 2014, Новосибирск, 2015; 18-ой и 19-ой международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2014, 2015; II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии», Пермь, 2015; 18^th International Microscopy Congress, Прага, 2014; 12^th Mutinational Congress on Microscopy, Эгер, 2015.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в утвержденный ВАК перечень рецензируемых научных изданий и в международную систему научного цитирования Scopus (Прикладная биохимия и микробиология, Journal of Microbiological Methods).

Объем и структура работы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 27 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка сокращений и списка цитируемой литературы, включающего 239 наименований работ, в том числе 28 отечественных и 211 зарубежных авторов.

Связь работы с крупными программами и собственный вклад автора.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Изучение функционального и видового разнообразия микроорганизмов, полезных для экоценозов и практической деятельности человека» (номер госрегистрации 01201353247). Работа поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (12-П-4-1052), грантами Российского фонда фундаментальных исследований 14-14-00643 и госзаданием Минобрнауки (6.1194.2014/К).

Научные положения и выводы базируются на результатах собственных исследований автора.

Физиологические основы устойчивости бактерий к воздействию

Применение целых клеток микроорганизмов в биокатализе гидрофобных соединений имеет преимущество перед ферментными препаратами, так как клеточная стенка и мембрана обеспечивают защиту ферментов от денатурации под действием растворителей. Метаболически активные клетки часто используют в реакциях биосинтеза, требующих участия коферментов и кофакторов, таких как НАД(Ф)Н или АТФ. Использование целых клеток позволяет проводить многостадийные биокаталитические реакции, что делает данный процесс экономически выгодным (Schmid et al., 2001; Ishige et al., 2005; Heipieper et al., 2007; Kim et al., 2007). Впервые штамм Pseudomonas putida IH-2000, устойчивый к высоким концентрациям толуола ( 50%) и не использующий его в качестве источника углерода и энергии, был выделен Inoue и Horikoshi (1989). В дальнейшем были обнаружены другие представители рода Pseudomonas, а также Sphingomonas, Arthrobacter, Bacillus, Staphylococcus, Rhodococcus, устойчивые к воздействию толуола, диметилфталата, гептанола, бензола, хлороформа и других растворителей (Heipieper et al., 2007).

Биокаталитические системы, в которых используются клетки микроорганизмов, включают в свой состав органические растворители в качестве среды для биотрансформации гидрофобных соединений. Существует несколько вариантов таких систем: (1) смеси водной среды и гидрофильного растворителя; (2) двухфазные системы, состоящие из водной среды и гидрофобного растворителя; (3) растворители (Саггеа and Riva, 2000; Schmid et al., 2001).

Многие неполярные субстраты и продукты биокаталитических реакций (ароматические, алифатические или гетероциклические соединения) токсичны для клеток, они нарушают структурную и функциональную целостность мембран, приводя к гибели микроорганизмов. Использование двухфазных водно-органических систем, в которых клетки находятся в водной среде, а субстрат и продукты трансформации - в растворителе, делает возможным исключить или снизить данный токсический эффект на клетки. При этом также снижается ингибирующий эффект продуктов реакции на клетки и облегчается процесс их выделения. Возможность добавлять субстрат в процессе трансформации и контролировать его концентрацию в среде позволяет проводить реакции в течении длительного времени и, как следствие, получать больше продукта. Согласно данным ряда европейских химических и фармацевтических компаний, объем производства продуктов, получаемых данным способом, может составлять от единиц до нескольких тысяч тонн в год. В связи с этим, в биотехнологических процессах чаще используются двухфазные водно-органические системы (Salter, Kell, 1995; Isken, de Bont, 1998; Schmid et al., 2001; Heipieper et al., 2007).

Эффективность биокаталитического процесса зависит от состава среды культивирования, возраста и плотности инокулята, температуры и давления, уровня рН среды, степени аэрации и продолжительности инкубирования (Zingaro et al., 2013). При этом основной проблемой использования целых бактерий в качестве биокатализаторов является их низкая стабильность и активность в результате токсического действия растворителя (Isken, de Bont, 1998).

Выявлена корреляция между токсичностью растворителя и его гидрофобностью, измеряемой как логарифм коэффициента распределения в системе н-октанол-вода logPo/w (отношения равновесных концентраций тестируемого вещества в н-октаноле, насыщенном водой (Со), и в воде, насыщенной н-октанолом (Cw)): logPo/w = log(Co/Cw) (1) Как правило, чем выше значение logPo/w, тем ниже токсичность растворителя для клеток (так называемое правило Овертона) (Sikkema et al., 1992). Растворители со значением коэффициента logPo/w 2 считаются наиболее токсичными для клеток, /ogPo/w 4 - нетоксичными. Чувствительность к растворителям со значением коэффициента /ogPo/w от 2 до 4 зависит от видовой и штаммовой принадлежности микроорганизма (Sardessai, Bhosle, 2004; de Carvahlo, 2010). Другими авторами предложены различные методы оценки воздействия растворителей, такие как параметр растворимости Гильдебранда, сольватохромизм красителя, диэлектрическая постоянная, дипольный момент, но для коэффициента /ogPo/w показана лучшая корреляция с подавлением активности ферментов и степенью токсичности для клеток (Gupta, 1992; Sardessai, Bhosle, 2004; Heipieper et al., 2007; Jasti et al., 2014). Показано, что токсический эффект растворителя зависит не столько от структурных особенностей его молекул, сколько от его способности аккумулироваться в мембране, т.е. от степени гидрофобности, которая как раз и отражена в показателе /ogPo/w (Heipieper, de Bont, 1994). Значение коэффициента /ogPo/w рассчитывается экспериментально (OECD, Test No. 123:2006, IDT; ГОСТ 32291-2013) или с помощью специальных программ, таких как Molinspiration (http://www.molinspiration.com), основанных на анализе структуры молекулы растворителя и соотнесения ее со структурами молекул в уже имеющейся базе данных, насчитывающей более 12-ти тысяч соединений.

Рядом исследователей (Gupta, 1992; Isken, de Bont, 1998; Sardessai, Bhosle, 2004; de Carvahlo, 2010; Zingaro et al., 2013) отмечено, что вышеуказанная зависимость токсичности растворителя от коэффициента /ogPo/w наблюдается не во всех случаях. Следует отметить, что данный способ оценки не учитывает молекулярную структуру и природу функциональных групп растворителя, которые могут вовлекаться в специфические взаимодействия с бактериальными клетками, поверхностные свойства которых, в свою очередь, могут меняться в зависимости от вида или штамма (Heipieper et al., 2007). Свойства разных растворителей, такие как полярность, поверхностный заряд, электрохимический потенциал, оказывают влияние на селективность реакций

Бактериальные штаммы и условия культивирования

Наномеханические свойства родококков определяли с помощью АСМ в режиме силовой спектроскопии. Перед сканированием проводили иммобилизацию клеток на подложке. Для этого 15-20 мкл водного раствора поли-Ь-лизина (0,1 мг/мл) (Sigma-Aldrich, США) помещали на покровное стекло, высушивали на воздухе в течение 30-40 мин, после чего на модифицированную поверхность наносили каплю клеточной суспензии аналогичного объема, подсушивали на воздухе в течение 10-15 мин и промывали деионизированной водой для удаления незакрепившихся клеток.

Сканирование проводили в жидкой среде (НФБ) с использованием кремний-нитридных кантилеверов TR400PB (Olympus Corporation, Япония) с Cr/Au напылением, резонансной частотой 7-14 кГц, константой жесткости 0,01-0,05 Н/м, радиусом кривизны зонда 42 нм. Стартовое расстояние, расстояние силы и резонансную частоту кантилевера определяли согласно протоколу компании-производителя (Asylum Research, США). Получали АСМ-изображения размером 10 мкм в контактном режиме со скоростью 1 Гц, после чего проводили силовое картирование сканированной области, путем приближения зонда к образцу и получения силовых кривых в каждой точке (32 х 32 = 1024 точки) и получали карты адгезии зонда кантилевера к поверхности.

Модуль упругости (Юнга) измеряли путем индентирования клеток в центре и регистрации силовых кривых. Значение модуля упругости рассчитывали по модели Герца с использованием программы Igor Pro 6.22А согласно формуле: (5) где F - регистрируемая сила (Н), 5 - глубина продавливания образца (нм), Е - модуль Юнга (Па), v - коэффициент Пуассона (= 0,33), а - 0,5 угла вершины зонда () (Francius et ai, 2011; Formosa et ah, 2012).

Определение дыхательной активности родококков проводили с помощью 6-канального респирометра Micro-Oxymax (Columbus Instruments, США) в стеклянных флаконах Micro-Oxymax вместимостью 300 мл, содержащих 100 мл бактериальной суспензии (ОП6оонм 0,5) в НФБ, или среде RS, или среде LB и 20 об. % н-декана или 1 об. % этанола. Постоянное перемешивание (400 об. /мин) осуществляли с помощью многоместной магнитной мешалки RT 10 (Power IKAMAG, Германия) в течение 1 сут при температуре 25±2 С. Оценивали скорость дыхания (мкл/мин). В качестве контро лей использовали бактериальную суспензию в НФБ, в среде RS или в среде LB без добавления растворителя.

В 100-мл колбы Эрленмейера одновременно вносили суспензию клеток в среде LB, органический растворитель и ингибитор эффлюкных насосов в подобранных соотношениях до конечного объема 20 мл. При этом концентрация клеток соответствовала значению ОПбоонм 0,05. Концентрация растворителей со значением logPo/w 3 (н-декан, н-гексан, циклогексан) составляла 20 об. %, со значением logPo/w 3 (толуол, бутанол-1, этанол, ацетон, этилацетат, ацетонитрил) - 1 об. %. В качестве ингибиторов эффлюксных насосов использовали ЮмМ орто-ванадат натрия, 0,025 мМ парокситина гидрохлорид и 0,1 мМ фениларгинин Р-нафтиламида (ФАрН) дигидрохлорид (Sigma- Aldrich, США). Подобранные концентрации растворителей и ингибиторов по отдельности не оказывали подавляющего воздействия на рост родококков.

В качестве биотических контролей использовали варианты опытов без добавления (1) ингибиторов; (2) растворителей; (3) растворителей и ингибиторов. В качестве абиотического контроля использовали неинокулированную среду LB. Суспензии инкубировали на орбитальном шейкере при 28 С и 160 об./мин. Рост клеток контролировали путем измерения ОПбоонм через 6-12 ч.

Суммарные клеточные липиды экстрагировали традиционным методом (Кейтс, 1975). При этом 0,05 г сухой биомассы, суспендировали в 1 мл дистиллированной воды с последующим добавлением 3 мл смеси хлороформ-метанол (2 : 1). Полученную смесь встряхивали в течение 2 мин и оставляли на 1 сут. Затем центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Хлороформеный слой сливали в отдельную центрифужную пробирку, а к осадку добавляли 5 мл смеси хлороформ-метанол-вода (2 : 1 : 0,8), встряхивали и центрифугировали. Хлороформеную часть объединяли с ранее полученным экстрактом и добавляли 5 мл смеси хлороформ-вода (1 : 1), повторно центрифугировали. Экстракт переносили в предварительно взвешенную кругло донную колбу и упаривали на роторном испарителе при 60 С, после чего колбу взвешивали до достижения постоянной массы на высокоточных аналитических весах AUW 120D (Shimadzu, Япония). Количество общих липидов выражали в процентах от сухой массы клеток.

Поиск нуклеотидных последовательностей в геноме R. ruber ИЭГМ 231, соответствующих генам устойчивости к веществам с лекарственной активностью (drug/multidrug resistance) и генам, кодирующим белки эффлюксных насосов (efflux protein) осуществляли по базе данных MicroScope (https://www.genoscope.cns.fr/agc/microscope). Поиск и анализ гомологичных последовательностей производили по базам данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью компьютерной программы Microsoft Office Exel 2003 (Microsoft Corporation, США). Рассчитывали среднее арифметическое, стандартное отклонение, стандартную ошибку. Достоверность различий между двумя несвязанными выборками оценивали с помощью расчета t-критерия Стьюдента в программе STATISTICA 8 (StatSoft, США).

Исследование влияния органических растворителей на физиологические свойства родококков

Как и следовало ожидать, родококки были чувствительны к действию более гидрофильных (/ogPo/w 1) растворителей: бутанола-1, изобутанола, этилацетата, ацетона, этанола и ацетонитрила (рисунок 7). Так, штаммы из 9-ой (устойчивой) группы сохраняли лишь 25-39%-ную жизнеспособность при инкубировании с бутанолом-1 (/ogPo/w = 0,88). Еще более низкие показатели выживаемости (5-21%) зафиксированы для 10-ой (чувствительной) группы штаммов. Изобутанол (/ogPo/w = 0,81) приводил к 76-84% гибели 12-ой (чувствительной) группы, тогда как при концентрации до 50 об. % родококки сохраняли 60%-ную жизнеспособность, а при воздействии 80 об. % растворителя наблюдался 30%-ный рост числа жизнеспособных клеток у отдельных штаммов 11-ой (устойчивой) группы. В частности, исключительно высокую устойчивость к изобутанолу проявили штаммы R. longus ИЭГМ 69 и ИЭГМ 589. При воздействии этилацетата (/ogPo/w = 0,73) сохранялась 42-60% жизнеспособность родококков устойчивой (13-ой) группы, а жизнеспособность чувствительных штаммов (14-ой группы) составляла всего 20-22%. Ацетон (/ogPo/w = -0,23), вызывал 75-78% снижение жизнеспособности штаммов 16-ой (чувствительной) группы. Устойчивые штаммы (15-ой группы) сохраняли 45-68% жизнеспособность. В то же время, в присутствии этанола (/ogPo/w = -0,29), наблюдалось 19-81%-ное сохранение жизнеспособности родококков из 17-ой (устойчивой) группы. Однако выживаемость бактерий из 18-ой (чувствительной) группы составляла всего 8-36% в зависимости от процентной концентрации растворителя. При воздействии ацетонитрила (/ogPo/w = -0,33) жизнеспособность 19-ой (устойчивой) группы составила в среднем 50-62%, а 20-ой (чувствительной) - 20-22%.

Нами не обнаружено строгой концентрационной зависимости токсического действия растворителей на клетки родококков. Напротив, в некоторых случаях наблюдалось увеличение числа жизнеспособных клеток при повышении концентрации растворителя (см. рисунок 6, 7). Для менее токсичных н-декана, н-гексана, циклогексана и толуола выявленный факт может быть связан со способностью родококков использовать данные соединения в качестве ростовых субстратов (Ившина и др., 2007; de Carvalho, 2010), увеличение концентрации которых в среде приводило к повышению роста бактерий. В работе de Carvalho et al. (2005) также отмечено повышение жизнеспособности клеток R. erythropolis DCL14 при увеличении концентрации гидрофобного н-до декана в среде инкубирования. При воздействии более токсичных гидрофильных растворителей аналогичный результат может быть частично обусловлен агрегацией клеток (Ившина и др., 2007). Как видно из рисунка 8, после воздействия растворителя наблюдается гибель родококков на поверхности агрегатов. При этом, вследствие защиты клеток, находящихся внутри агрегатов, сохраняется высокая жизнеспособность клеточной популяции даже при повышенных концентрациях токсичных растворителей (Cassidy et al., 1996).

КЛСМ-АСМ изображения R. ruber ИЭГМ 231 до (А) и после (Б) 24 ч инкубирования в органическом растворителе. Светящиеся зеленым цветом - живые, красным - мертвые клетки Выявлены штаммы, обладающие множественной устойчивостью к растворителям с высоким и низким значением коэффициента /ogPo/w (рисунок 9). Так, R. longus ИЭГМ 32 проявил устойчивость к н-декану, толуолу, изобутанолу, этилацетату, ацетону, ацетонитрилу, R. longus ИЭГМ 69 - к н-декану, толуолу, этилацетату, бутанолу-1, изобутанолу, этилацетату и ацетонитрилу. R. longus ИЭГМ 589 сохранял высокие показатели выживаемости при воздействии высокотоксичных изобутанола, этилацетата, ацетона и ацетонитрила. R. opacus ИЭГМ 57 был устойчив к н-гексану, изобутанолу, этилацетату, ацетону, этанолу, ацетонитрилу, R. opacus ИЭГМ 58 - к н-гексану, толуолу, бутанолу-1, этанолу, R. ruber ИЭГМ 326 - к н-гексану, бутанолу-1, этилацетату, ацетону, этанолу, ацетонитрилу, R. ruber ИЭГМ 343 - к н-гексану, бутанолу-1, этанолу.

Следует отметить выявленную высокую устойчивость к н-гексану и этанолу штамма R. rhodochrous ИЭГМ 66, способного к биотрансформации бетулина (Тарасова, 2014) и органических сульфидов (Елькин, 2011), а так же устойчивость штамма R. rhodochrous ИЭГМ 647, являющегося активным деструктором дротаверина гидрохлорида (Мухутдинова, 2014), к н-декану, бутанолу-1 и этанолу и штамма R. opacus ИЭГМ 249, способного к био деградации нефтяных углеводородов (Серебренникова, 2014) - к этанолу. Полученные данные свидетельствуют о возможности проведения биотрансформации данных соединений родококками в присутствии органических растворителей.

Установлена сильная положительная корреляция (R = 0,78, mr = 0,22) между средними показателями жизнеспособности исследованных штаммов родококков и степенью гидрофобности (/ogPo/w) растворителей. Наряду с этим, отмечена индивидуальная восприимчивость бактерий к растворителям, что подтверждает мнение многих исследователей о влиянии штаммовых особенностей на устойчивость к данным соединениям (Gupta, 1992; Sikkema et al., 1995; Isken, de Bont, 1998; Sardessai, Bhosle, 2004; de Carvalho, 2010).

Морфофункциональные свойства родококков при инкубировании в органических растворителях

Так, в геноме родококков присутствуют последовательности (RHRU231vl_600003, RHRU231vl_330072), кодирующие белки систем эффлюкса тяжелых металлов Со2+, Zn2+ и Cd2+ (CzcD) (Nies, Silver, 1995). Найден ген emrB (RHRU231vl_450049) и гены, кодирующие белки подсемейства EmrB/QacA (RHRU231vl_200048, RHRU231vl_960069, RHRU231vl_480072). Последние являются функциональным гомологами и относятся к семейству MFS Независимых эффлюксных насосов, обеспечивающих, как правило, выведение антибиотиков из клеток (Lomovskaya, Lewis, 1992; Furakawa et al., 1993). В работе Sekavec с соавт. (2013) показано участие данных белков в формировании устойчивости Aeromonas hydrophila к хлоргексидину. Кроме того, у родококков обнаружен ген (RHRU231vl_230213), кодирующий белки Bcr/CflA эффлюксных насосов (семейство MFS). В работе Garcia с соавт. (2010) отмечено участие АТФ-зависимых эффлюксных насосов в выведении толуола из клеток Pseudomonas putida DOTIE, однако гомологи Bcr/CflA не учавствовали в данном процессе. Также в геноме R. ruber присутствуют пять других последовательностей (RHRU231vl_450058, RHRU231vl_560022, RHRU231vl_710017, RHRU231vl_710087, RHRU231vl_810021), соответсвующих эффлюксам из семейства MFS, и одна последовательность (RHRU231vl_450270), соответствующая эффлюксам из семейства ABC. Участие АТФ-зависимых транспортеров (семейство ABC) в выведении растворителей из клеток показано для S. cerevisiae КК-211 (Nishida et al., 2013). Также в работе Venca (2012) показано участие АТФ- и Независимых насосов в формировании устойчивости Rhodococcus erythropolis DCL14 к антибиотикам ванкомицину и ципрофлоксацину. Таблица 9 - Результаты сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей R. ruber ИЭГМ 231 (номер в GenBank CCSD01000001-CCSD01000115) и R. aetherivorans IcdPl (номер в GenBank СР011341.1)

Примечание. «-» - нет названия гена, с/о - сходство отсутствует. При этом авторами были использованы тиоридазин, верапамил и орто-вшадат натрия (ингибиторы насосов семейства ABC), ./ие/ш-хлорофенилгидразон цианида и омепразол (ингибиторы семейства MFS). Таким образом, в геноме исследуемого нами штамма R. ruber ИЭГМ 231 выявлено два гена белков эффлюкса тяжелых металлов, один - транспортных насосов семейства ABC, и 10 последовательностей эффлюксов семейства MFS. При сравнении найденных нами последовательностей с опубликованными в базе данных GenBank установлен наиболее высокий (89-99%) процент гомологии с фрагментами генома штамма Rhodococcus aetherivorans IcdPl, кодирующими транспортные белки.

Далее нами проведено сравнение генов acrA, acrB, tolC штамма Е. coli К-12 (substr. MG1655; номер эталонной последовательности в GenBank NC_000913.3) и техА, техВ, оргМ штамма Pseudomonas aeruginosa PAOl (номер эталонной последовательности NC002516.2), кодирующих структурные белки Независимых эффлюксных насосов семейства RND, с полным геномом R. ruber ИЭГМ 231. При этом не было выявлено сходства (качество покрытия - всего 1-2 %) между генами транспортных каналов грамотрицательных бактерий и таковых генома родококков, что может свидетельствовать о наличии у последних уникальных последовательностей, кодирующих белки эффлюксных насосов.

Таким образом, показано возможное участие Н+- и Ка+-зависимых эффлюксных насосов в формировании устойчивости родококков к растворителям и наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей, ассоциированных с функциональными белками эффлюксных насосов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Устойчивые к органическим растворителям микроорганизмы используются для селективной трансформации гидрофобных субстратов с целью получения прекурсоров и интермедиатов фармакологически активных веществ, ароматизаторов, красителей, химически чистых реактивов (Ishige et al., 2005). Применение органических и водно-органических систем в качестве сред для биотранформации сложных соединений при оптимальном подборе условий инкубирования биокатализаторов (Kim et al., 2007; Zingaro et al., 2013) позволяет добиться высокой специфичности химических реакций и выхода целевого продукта с минимальным образованием побочных продуктов (Carrea, Riva, 2000; Klibanov, 2001; Schmid et al., 2001). При этом, в некоторых случаях, показано увеличение ферментативной активности в средах с органическими растворителями по сравнению с водными средами (Zaks, Klibanov, 1988; Mozhaev et al., 1989; Khmelnitsky et al., 1991). В биокаталитических процессах с использованием органических растворителей применяются целые клетки бактерий и грибов (Schmid et al., 2001; Heipieper et al., 2007). Перспективными для биотехнологии являются актинобактерии рода Rhodococcus, обладающие широкой субстратной специфичностью и высокой устойчивостью к высокотоксичным органическим соединениям (Larkin et al., 2005; Kuyukina, Ivshina, 2010b).

Устойчивость бактерий к органическим растворителям обусловлена их способностью к цис/транс-томещзтщи жирных кислот и снижению текучести мембраны, увеличению количества мембранных липидов, биотрансформации или биодеструкции растворителей (Isken, de Bont, 1998; Heipieper et al., 2007; Heipieper, Martnez, 2010), а также работой эффлюксных насосов (Zheleznova et al., 2000; Ramos et al., 2001; Borges-Walmsley et al., 2003; Marques, 2005). У родококков важную роль играет клеточная стенка, выступающая в качестве физического барьера от токсического воздействия растворителя (de Carvalho, 2010). Одним