Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Особо опасные для Российской Федерации фитопатогенные микроорганизмы и современные методы их диагностики 12
1.2. Использование грибов рода Trichoderma для создания биопрепаратов 26
ГЛАВА II. Материалы и методы 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Измерение концентрации бактериальных клеток на спектрофотометре NanoDrop 2000 39
2.3. Состав питательных сред для культивирования бактерий 40
2.4. Подбор оптимальных условий культивирования A. сitrulli 42
2.5. Искусственное заражение растительного материала бактерией A. citrulli 43
2.6. Применение серологических методов для выявления и идентификации A. citrulli 44
2.6.1. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) 44
2.6.2. Иммуноферментный анализ (ИФА) 45
2.7. Применение молекулярных методов для выявления и идентификации A. citrulli 46
2.7.1. Оптимизация методов выделения ДНК из чистой культуры бактерий и зараженного растительного материала 46
2.7.2. Выявление и идентификация возбудителя A. сitrulli методом ПЦР 50
2.7.3. Идентификация A. citrulli методом секвенирование гена 16S рРНК з
2.8. Изучение влияния метаболитов гриба Trichoderma harzianum Rifai F-180 на фитопатогенные бактерии 53
2.9. Определение зон возможного распространения фитопатогенных бактерий на территории Российской Федерации. 55
ГЛАВА III. Выбор особо опасных фитопатогенных бактерий в качестве объектов исследования, определение зон их возможного распространения . 56
ГЛАВА IV. Исследования с фитопатогенной бактерией E. amylovora 68
4.1. Изучение роста E. amylovora на средах разного состава 68
4.2. Изучение влияния культуральной жидкости гриба Tr.harzianum Rifai F-180 на E. amylovora 70
4.3. Изучение влияния гомогенного фермента L-лизин--оксидазы гриба Tr. harzianum Rifai штамм F-180 на E. amylovora 75
ГЛАВА V. Исследования с фитопатогенной бактерией A. citrulli 78
5.1. Подбор питательной среды и оптимальных условий культивирования A. citrulli 78
5.2. Усовершенстование серологических методов выявления и идентификации A. сitrulli 85
5.2.1. Применение реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для выявления A. сitrulli 85
5.2.2. Применение иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления A. citrulli 88
5.3. Применение молекулярных методов для выявления и идентификации A. citrulli 93
5.3.1. Идентификация полученной бактерии A. сitrulli 93
5.3.2. Оптимизация методов выделения ДНК из чистой культуры A. citrulli и зараженного растительного материала 95
5.3.3. Подбор специфичных праймеров, определение их чувствительности, специфичности и оптимизация условий ПЦР для выявления и идентификации A. citrulli 101
5.4. Изучение влияния метаболитов гриба Tr. harzianum Rifai F-180 на A. citrulli 108
5.4.1. Изучение влияния культуральной жидкости Tr. harzianum Rifai F-180 на A. citrulli.. 108
5.4.2. Изучение влияния гомогенного фермента L-лизин- оксидазы Tr. harzianum Rifai F-180 в отношении A.citrulli 112
Заключение 115
Выводы 124
Библиографический список используемой
Литературы
- Использование грибов рода Trichoderma для создания биопрепаратов
- Искусственное заражение растительного материала бактерией A. citrulli
- Изучение влияния культуральной жидкости гриба Tr.harzianum Rifai F-180 на E. amylovora
- Применение реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для выявления A. сitrulli
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Поиск средств для подавления фитопатогенных бактерий продолжает оставаться актуальной проблемой не только для микробиологии, сельского хозяйства, но и для экологии. Весьма перспективным в этом направлении является использование не химических, а биологических средств защиты, в частности продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.
Грибы рода Trichoderma являются одними из наиболее изучаемых в настоящее время. Это единственный род, каждый вид которого представлен в Генетическом Банке хотя бы одним геном, а многие виды представлены последовательностью двух или более генов (Алимова Ф.К., 2006).
Повышенный интерес к грибам рода Trichoderma также обусловлен изучением его ферментных систем. На кафедре биохимии Российского университета дружбы народов было установлено, что Trichoderma harzianum Rifai штамм F-180 является продуцентом фермента L-лизин--оксидазы (ЛО) (Смирнова И.П., Хадуев С.Х., 1984). Было показано, что данный фермент обладает противоопухолевой и антивирусной активностью (Жукова О.С, Хадуев С.Х., Добрынин Я. В., 1985, Смирнова И.П., Алексеев С.Б., и др., 1998, 2009). Впервые было доказано ингибирование L-лизин--оксидазой вирусов INSV и TRSV (Смирнова И.П., Шнейдер Ю.А., 2013, патенты РФ № 2475528, 2481392).
В последние годы на территории Российской Федерации отмечается
увеличение случаев обнаружения заболеваний бактериальной природы среди
других групп фитопатогенных микроорганизмов. Многие возбудители
карантинных бактериальных болезней растений чаще всего могут быть завезены из-за рубежа при импорте семенного и посадочного материала. В связи с этим необходимостью являются определение зон возможного риска их распространения на территории Российской Федерации, совершенствование методов выявления и идентификации возбудителей бактериальных заболеваний растений, также поиск возможных эффективных мер защиты и борьбы с фитопатогенными бактериями.
Влияние метаболитов гриба Tr. harzianum Rifai штамма F-180 в отношении ряда особо опасных (карантинных) возбудителей бактериальных болезней растений до настоящего времени не было исследовано. Изучение новых биологических свойств штамма-продуцента является необходимым и важным, так как представляет не только практический, но и большой теоретический интерес,
Работа является частью исследований, проводимых с Tr. harzianum Rifai F-180 на кафедре биохимии им. академика Березова Т.Т. МИ РУДН, выполняемых в рамках Государственных контрактов НИР/НИОК «Молекулярные основы патологических процессов и система их внутриклеточной регуляции; структура и
биологическая активность ферментов с антиопухолевой и антивирусной активностью» (тема №030522-1-274-1).
Цель работы: определить зоны возможного распространения особо опасных фитопатогенных бактерий на территории Российской Федерации, изучить методы их идентификации и влияние метаболитов Trichoderma harzianum Rifai F-180 на данные бактерии.
Задачи исследования:
провести анализ литературных данных и осуществить выбор особо опасных для Российской Федерации фитопатогенных бактерий;
установить зоны возможного распространения выбранных бактерий на территории Российской Федерации с помощью метода Географических информационных систем (ГИС);
изучить рост данных фитопатогенных микроорганизмов на средах разного состава, подобрать оптимальные условия их культивирования для проведения дальнейших исследований;
усовершенствовать серологические методы выявления и идентификации (РНИФ и ИФА) бактерий;
выбрать оптимальный метод выделения ДНК бактерий, а также усовершенствовать методики ПЦР для выявления и идентификации;
исследовать влияние метаболитов гриба Tr. harzianum Rifai F-180 на особо опасные для РФ фитопатогенные бактерии;
Научная новизна
Впервые с помощью современного метода ГИС были определены зоны возможного распространения фитопатогенов A. citrulli и Е. amylovora на территории Российской Федерации.
Подобраны оптимальные условия культивирования бактерии ,4. citrulli;
Впервые в Российской Федерации показана возможность выявления и идентификации бактерии ,4. citrulli методами РНИФ и ИФА.
Определена и успешно апробирована специфичная пара новых праймеров АС-1 F/R, которая может быть использована при проведении фитосанитарной экспертизы для выявления и идентификации возбудителя^. citrulli.
Впервые установлено наличие ингибирующих свойств культуральной жидкости (КЖ) Tr. harzianum Rifai F-180 при активности L-лизин--оксидазы (ЛО) 0,054 Е/мл в отношении особо опасных фитопатогенных бактерий Е. amylovora и A. citrulli.
Практическая значимость работы:
впервые определены территории РФ, подверженные опасности акклиматизации фитопатогенов A. citrulli и Е. amylovora и установлены зоны их возможного распространения.
подобраны оптимальные условия культивирования A. citrulli;
усовершенствованы серологические методы выявления и идентификации A. citrulli: РНИФ и ИФА. Подобран оптимальный титр кроличьей сыворотки для постановки РНИФ. Сэндвич-метод ИФА (DAS ELISA) позволяет выявлять в исследуемом материале бактерии A. citrulli в количестве 104 КОЕ/мл.
установлен оптимальный метод экстракции ДНК A. citrulli из чистых культур и зараженного растительного материала - при использовании набора «DNeasyKit» (Qiagen, США). Выделенные образцы ДНК были использованы при проведении классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени»;
определена и апробирована специфичная пара праймеров AC-1 F/R, которая может быть использована для выявления и идентификации бактерии ,4. citrulli;
впервые доказано наличие ингибирующих свойств КЖ Tr. harzianum Rifai F-180 с активностью ЛО 0,054 Е/мл в отношении Е. amylovora и A. citrulli.
Практическая значимость данной работы подтверждена: патентами на изобретения - патент РФ № 2493247 Смирнова И.П., Каримова Е.В., Шнейдер Ю.А. Ингибитор возбудителя бактериального ожога плодовых культур (Erwinia amylovora) от 20.09.2013 г.;
патент РФ № 2535983 Смирнова И.П., Каримова Е.В. Продуцент ингибитора возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур (Acidovorax citrulli), от 20.12.2014г.;
разработкой методических рекомендаций по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Shaad et al.). УДК 57 (094), № госрегистрации 115081710028. Инв. № 67-2015 МР ВНИИКР, Москва 2015;
подана заявка на патент: Каримова Е.В., Шнейдер Ю.А., Смирнова И.П. Регистрационный № 2012105552//Набор праймеров для выявления возбудителя Acidovorax citrulli и способ выявления возбудителя Acidovorax citrulli от 18.02.2016.
Основные положения, выносимые на защиту:
- проведен анализ литературных данных с целью выбора особо опасных для
Российской Федерации фитопатогенных бактерий: Е amylovora и A citrulli.
Установлены зоны их возможного распространения с помощью ГИС;
- подобраны оптимальная питательная среда и условия культивирования A citrulli;
адаптированы методы РНИФ, ИФА и ПЦР для выявления и идентификации
фитопатогенной бактерии ,4. citrulli;
- впервые определена и успешно апробирована специфичная пара новых
праймеров AC-1 F/R, которая может быть использована для выявления и
идентификации возбудителя^. citrulli методом ПЦР;
впервые установлено ингибирующее влияние продуктов метаболизма гриба Tr. harzianum Rifai F-180 на фитопатогенные бактерии Е. amylovora и A. citrulli при активности ЛО 0,054 Е/мл и гомогенного фермента ЛО с активностью 5,0 и 10,0 Е/мг.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XVI, XVII, XVIII Научно-практических конференциях по медицинской микологии (Кашкинские чтения) (С.-Петербург, 2013, 2014, 2015); Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» (Москва, 2012); Третьем всероссийском съезде по защите растений (С.-Петербург, 2013); Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии биологических средств защиты растений в производстве органической сельскохозяйственной продукции» (Краснодар, 2014) и Конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные исследования молодых ученых в биологии, защите растений и смежных отраслях» (Москва, 2014).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ. Из них 8 – статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций. Получено два патента: № 2493247 от 20.09.2013 г., № 2535983 от 20.12.2014 г. Подана заявка на патент: регистрационный № 2012105552 от 18.02.2016 г. Разработаны методические рекомендации.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственного исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка и приложения. Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц, 27 рисунков, 5 приложений. Библиографический список используемой литературы включает 196 источников, из которых 135 зарубежных.
Использование грибов рода Trichoderma для создания биопрепаратов
При сохранении объемов передвижения растительной продукции через границы РФ можно предположить, что все возбудители бактериальных болезней, для которых климатические условия территории нашей страны являются благоприятными, рано или поздно, возможно, будут завезены.
В связи с вступлением Российской Федерации в Евразийский экономический союз (ЕАЭС) и взаимодействием со странами Всемирной Торговой Организации (ВТО) был подготовлен Проект Единого перечня карантинных объектов, в который было предложено добавить наиболее опасные вредные организмы, способные нанести существенный вред сельскому хозяйству Российской Федерации.
Среди возбудителей бактериозов, включенных в перечень карантинных объектов, одним из наиболее опасных является возбудитель бактериального ожога плодовых культур Erwinia amylovora.
Данный фитопатогенный микроорганизм находится в списке карантинных для территории Российской Федерации вредных организмов, однако в последние годы специалистами фитосанитарной службы бактериоз был обнаружен в пятнадцати регионах Российской Федерации, где он наносит значительный ущерб производителем сельскохозяйственной продукции, личным подсобным хозяйствам, рекреационным зонам и др. [22]. В связи с этим в последнее время исследователями уделяется повышенное внимание возбудителю бактериального ожога плодовых культур E. amylovora.
Впервые вспышка E. amylovora была отмечена в конце XVIII века на востоке США, в штате Нью-Йорк [175]. За полтора столетия фитопатоген распространился по всей Северной Америке [83]. Данный бактериоз был обнаружен в пяти частях света, на четырех континентах. В настоящее время 54 страны официально подтвердили наличие возбудителя бактериального ожога плодовых культур E. amylovora. Страны Южной Америки отрицают присутствие данного фитопатогенного микроорганизма на своей территории [99]. Австралия – единственная страна (континент), чьей карантинной службе удалось ликвидировать карантинную бактерию E. amylovora на своей территории [97, 99].
Фитопатогенный микроорганизм E. amylovora в настоящее время является одним из наиболее опасных бактериальных возбудителей болезней плодовых культур во всем мире [73, 124, 134, 145, 151, 153, 177, 178], Возбудитель ожога плодовых деревьев – бактерия Erwinia amylovora (Burrill) Winslow et al. представляет собой подвижные, мелкие палочки размером 0,6-0,9 1,2-1,6 мкм, не образующие спор, располагаются одиночно, парами и короткими цепочками, подвижные, с 5-8 перитрихально расположенными жгутиками, имеют капсулу, грамотрицательные, факультативные анаэробы. Оптимальная температура роста 26-28С, минимальная – 6-8 С, погибают при 43-50С [14, 56, 93, 99, 160, 175]. E. amylovora поражает более 180 видов плодовых и декоративных культур растений семейства розоцветных Rosaceae подсемейства Pomoideae. Кизильник (Cotoneaster Medik) — самая восприимчивая к бактериальному ожогу культура, среди плодовых деревьев больше всего страдает от заболевания груша (Pyrus L). Возбудитель болезни также поражает боярышник (Crataegus L.), айву (Cydonia Mill.), хеномелес (Chaenomeles Lindl), яблоню (Malus P. Mill.), рябину (Sorbus L.), иргу (Amelanchier Medik), мушмулу (Mespilus L.), пираканту (Pyracantha M.Roem.), странвезию (Stranvaesia L.), дикую грушу (Pyrus communis L.), розу (Rоsa L.) [97, 99]. В последнее время отмечены случаи обнаружения бактерии E. amylovora на нехарактерных для нее растениях-хозяевах, в частности на сливе (Prunus domestica) [179] и абрикосе (Prunus armeniaca) [180]. Все перечисленные выше растения-хозяева бактерии E. amylovora имеют широкое распространение на территории РФ.
Для Российской Федерации E. amylovora является карантинным объектом. В результате мониторинга, проводимого с целью уточнения карантинного состояния территории России на наличие ожога плодовых деревьев, специалистами ФГБУ «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») впервые были выявлены очаги возбудителя болезни в 2003 году – в Калининградской области, в 2007 году – в Воронежской, Тамбовской областях и Карачаево-Черкесии, в 2008 году – в Самарской, Саратовской, Белгородской областях, в 2009 году – в Кабардино-Балкарии, в 2010 году – в Волгоградской области и Ставропольском крае, в 2011 году – в Липецкой области [1, 16, 22, 56, 93], в 2015 году – в Смоленской и Брянской областях.
E. amylovora обладает очень высокой скоростью распространения. Перенос фитопатогенной бактерии в новые регионы осуществляется посадочным и прививочным материалом, насекомыми-опылителями, естественным путем и др [93, 97, 99].
Опасность этого заболевания заключается в быстрой (в течение 3 месяцев) гибели зараженных растений. Вызывая быструю гибель зараженных растений, фитопатоген E. amylovora не только причиняет ущерб урожаю текущего года, но и резко снижает продуктивность деревьев в последующем [14, 16, 22, 56].
Бактерии проникают через цветки или повреждения на растениях. Заболевание начинается с соцветий, а затем переходит на побеги и ветки. Почки не раскрываются, листья и цветки чернеют, засыхают, но не опадают. Молодые ветки и листья начинают чернеть с кончиков, затем скручиваются, образуя симптом, названный «shepherd s crook» (пастуший посох), затем инфекция быстро распространяется вниз по дереву, которое производит впечатление обожженного огнем [14, 56, 99]. Кора размягчается, наблюдается выделение экссудата в виде капель жидкости молочно-белого цвета. Бактерия поражает и плоды, чаще незрелые; они чернеют, но так же, как и листья, не опадают, а остаются на дереве [14, 56].
Искусственное заражение растительного материала бактерией A. citrulli
Иммуноферментный анализ сэндвич-методом был проведен в соответствии с модификацией M. Clark и A. Adams [89].
В лунки 96-ти луночного микропланшета вносили по 200 мкл иммуноглобулинов (Loewe, Германия), разведенных в покрывающем буфере (состав буферов см. в приложении 2) для нанесения антител, после чего микропланшеты инкубировали в течение 4 часов при 37С в шейкере-термостате ST 3 (Elmi, Латвия). Затем осуществляли трёхкратную промывку лунок: содержимое лунок выливали, микропланшеты тщательно стряхивали, заполняли лунки промывающим буфером (PBS Tween) и оставляли на 3 мин. После последней промывки микропланшеты тщательно стряхивали и подсушивали на фильтровальной бумаге.
Далее в лунки микропланшета вносли по 200 мкл каждого тестируемого образца бактерии A. citrulli (по 2 лунки на образец), разведенного в экстрагирующем буфере в соотношении 1:10. В экспериментах использовали четыре штамма бактерии. Микропланшеты инкубировали в течение 16-18 часов при 4-6С, затем осуществляли процедуру промывки микропланшета, как описано выше.
На следующем этапе в лунки микропланшета вносили по 200 мкл кроличьих антител, конъюгированных фосфотазой (Loewe, Германия), разведенных в экстрагирующем буфере, микропланшеты инкубировали в течение 4 часов при 37С, затем осуществляли стандартную процедуру их промывки.
После в каждую лунку вносли по 200 мкл субстратного буфера с 4-нитрофенилфосфатом. Инкубировали при комнатной температуре до появления светло-жёлтой окраски. Результаты реакции оценивали после одного часа инкубации с помощью микропланшетного фотометра Thermo Scientific Multiscan Ascent (США) при длине волны 405 нм.
Для улучшения качества выделенной ДНК возбудителя, снижения получения ложноотрицательных результатов, сокращения материальных затрат и времени проведения анализа была поставлена задача определить оптимальный метод выделения ДНК фитопатогена A. citrulli.
Определение способа экстракции ДНК из чистой культуры четырех штаммов A. citrulli (№№51, 2609, 2726, 3000), образцы которых были предварительно секвенированы, проводили с помощью серии 10-кратных последовательных разведений. Из каждого разведения в трехкратной повторности выделяли ДНК разными методами для получения высокоотчищенной бактериальной ДНК целевого объекта и выбора наилучшего набора и метода: 1) коммерческим набором «НК-М-Сорб» – ЗАО «Синтол» (Россия). Особенность набора реагентов – использование магнитных частиц. Принцип метода основан на лизисе клеток и последующей сорбции ДНК на магнитных частицах, с которых она снимается с помощью элюирующего раствора. 2) коммерческим набором «Проба ГС» – ООО «АгроДиагностика» (Россия). Набор основан на использовании гуанидина тиоционата (GuSCN) для лизиса клеток с последующей сорбцией ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она снимается элюирующим раствором. 3) Методом кипячения для получения чистой ДНК бактериальной культуры [12]. Пробирки Eppendorf объемом 1,5 мл с суспензией бактерий A. сitrulli разной концентрации выдерживали в термостате «Гном» («ДНК-Технология», Россия) при температуре 96С в течении 10 минут. По истечении времени пробирки устанавливали в штатив и оставляли в морозильной камере на 3 минуты при температуре -20С, далее их центрифугировали на центрифуге с охлаждением Sigma 1-15 (Sigma Laborzentrifugen, Германия) в течение 3 минут на скорости 7000 оборотов в минуту. Супернатант использовали для постановки ПЦР. 4) коммерческим набором “ДНК-Экстран-3” для выделения ДНК из культуры бактерий (ЗАО «Синтол», Москва). Особенность метода состоит в обработке образца лизоцимом для лизиса клеточной стенки бактерий. 5) коммерческим набором “ДНК-Экстран-4” (ЗАО «Синтол», Москва). Отличие данного метода от предыдущего состоит в применении РНКазы А для очистки ДНК от РНК и в использовании более высокой температуры для инкубации при лизисе клеток (60С). 6) Коммерческим набором «DNeasyKit» (Qiagen, США).
Набор основан на использовании диоксида кремния (силикагель) для очистки ДНК в пробирках со спинколонками (рис. 5). Для очистки не используют органические вещества, такие как фенол, хлороформ и преципитацию этанолом. ДНК связывается с мембраной колонок, в то время как примеси (белки, полисахариды) выпадают в осадок и удаляются в процессе промывки. Мембрана в колонках сочетает в себе связывающие свойства мембраны на основе силикагеля в сочетании с технологией микроспин. ДНК адсорбируется на мембране. Используемый в дальнейшем буфер позволяет адсорбировать ДНК на мембране, содержащей силикагель, и эффективно удалить присутствующие примеси.
Изучение влияния культуральной жидкости гриба Tr.harzianum Rifai F-180 на E. amylovora
К настоящему времени методы выявления и идентификации фитопатогенной бактерии E. amylovora разработаны, апробированы, валидированы и продолжают совершенствоваться сотрудниками фитосанитарной службы. К данным методам относятся: биохимический анализ, реакция иммунофлюоресценции, иммуноферментный анализ, флэш-ПЦР, ПЦР в реальном времени, био-ПЦР, секвенирование и другие. Также отработаны методы изоляции патогена (прямая, с обогащением), изучены культуральные особености E. amylovora.
Предварительное изучение продуктов метаболизма гриба Tr. harzianum Rifai F-180 показало перспективность их использования при создании средств для борьбы с вирусами растений – некротической пятнистости бальзамина (INSV) и кольцевой пятнисости томата (TRSV). В связи с этим было интересно исследовать влияние КЖ Tr. harzianum Rifai F-180на особо опасные фитопатогенные бактерии.
Однако для проведения исследований по изучению действия продуктов метаболизма Tr. harzianum Rifai F-180 на возбудителя бактериального ожога плодовых культур, предварительно необходимо было изучить рост E. amylovora на питательных средах разного состава, с последующим выбором среды, на которой будут культивированы бактерии. В данном исследовании использовали питательные среды, описанные в главе II, традиционные для фитопатологической экспертизы. E. amylovora высевали на чашки Петри с помощью шпателя для получения отдельных колоний. Чашки инкубировали в термостате при температуре 27оС на протяжении от 72 до 96 ч. Повторность проводимых опытов – трехкратная. Общие результаты представлены в таблице 12. Таблица 12 Краткое описание колоний бактерии E. amylovora на питательных средах разного состава Среда Время появленияколоний после начала инкубации Краткое описание колоний №1 (King B) 24 ч Беловато-кремовые, округлые, плосковатые до выпуклых, не флуоресцируют. №2 (YDC) 24 ч Белые, округлые, слегка выпуклые, слизистые, не флуоресцируют. №3 (NBY) 36 – 48 ч Кремовые, округлые, не флуоресцируют. №4 (NA) 36 – 48 ч Кремовые, округлые, не флуоресцируют. №5 (EBB) - Роста колоний микроорганизма не было. №6 (mEBB) - Роста колоний микроорганизма не было. Рисунок 13. Колонии бактерии E. amylovora на средах разного состава: А) King B, Б) YDC, В) NBY, Г) NA. На питательной среде King B колонии фитопатогенной бактерии E. amylovora появлялись уже через 24 ч после начала инкубации. Колонии были беловато-кремовые, отдельные, четкие, округлые (см. рис. 13). На средах №№ 2, 3, 4 колонии бактерии росли достаточно хорошо, но более медленно, кроме того часто колонии не были четко ограниченными, сливались. На средах №№ 5, 6 роста колоний микроорганизма не наблюдалось в период до 96 ч инкубации. Таким образом, из изученных нами сред, среда King B (№1) является оптимальной для культивирования бактерии E. amylovora.
Не смотря на активное изучение бактерии E. amylovora, как в РФ, так и во всем мире, до сих пор не найдено действующего вещества и не разработано эффективной стратегии борьбы с данным фитопатогеном. В настоящее время единственным надежным методом для предотвращения или замедления скорости распространения E. amylovora в незараженных районах является соблюдение строгих фитосанитарных мер в отношении важнейших растениий–хозяев, ликвидация зараженных растений и запрет выращивания восприимчивых к фитопатогенной бактерии растений в карантинной зоне в течение нескольких лет [16, 22, 56].
Изучая опыт зарубежных стран по борьбе с данной фитопатогенной бактерией, можно сделать вывод, что наиболее важными химическими веществами для контроля E. amylovora являются соединения меди и антибиотики. Антибиотики стрептомицин и окситетрациклин используют в садах США уже более 50 лет [63, 143]. Стрептомицин также зарегистрирован как средство для борьбы с E. amylovora в Израиле, Новой Зеландии, Канаде и Мексике. После нескольких лет применения антибиотиков в садах этих стран были обнаружены резистентные изоляты E. amylovora [153]. Следует отметить, что в Российской Федерации и ряде стран Европейского союза соблюдается строгий запрет на использование антибиотиков медицинского назначения в сельском хозяйстве. Что касается препаратов на основе меди, из-за фитотоксичного эффекта, оказываемого препаратами на формирующиеся плоды, их следует применять только в периоды покоя и цветения. Также использование медь негативно сказывается на качестве урожая. В связи с вышесказанным в настоящее время во всем мире ведется поиск таких веществ, которые были бы эффективны в подавлении фитопатогенной бактерии E. amylovora и как можно более безопасны для людей и окружающей среды.
Ранее на кафедре биохимии им. академика Березова Т.Т. МИ РУДН, впервые было доказано ингибирующее действие метаболитов гриба Tr. harzianum F-180 (культуральной жидкости и чистого фермента L-лизин--оксидазы) в отношении опасных вирусов растений. В связи с этим была поставлена задача, исследовать действие метаболитов гриба Tr. harzianum F-180 в отношении опасных бактериозов растений.
Изучение эффективности вещества в отношении возбудителей карантинных бактериальных болезней основывается в первую очередь на выяснении его возможности подавлять рост и развитие этих патогенов и, таким образом, снижать ущерб, наносимый растениям-хозяевам.
В данном исследовании проводилось изучение способности культуральной жидкости подавлять рост чистой культуры E. amylovora. На чашках Петри с питательной средой King B, засеянной бактерией E. amylovora, готовили по 3 лунки, в которые вносили КЖ гриба Tr. harzianum Rifai F-180 разной активностью L-лизин--оксидазы. Исходная активность L-лизин--оксидазы в КЖ составляла 0,54 Е/мл. Чашки помещали в термостат с температурой 27С и выдерживали до трех суток. Измерение зоны подавления роста культуры E. amylovora проводили через 24 ч после начала опыта. Опыт проводили в трехкратной повторности. Результаты представлены в таблице 13 и на рисунках 14, 15.
Применение реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) для выявления A. сitrulli
На следующем этапе проводили оценку специфичности и чувствительности подобранных праймеров. Специфичность для каждой пары праймеров была проверена отдельно. Для оценки специфичности праймеров использовали ДНК культур, представленных в таблице 4. Из рисунка 23 следует, что неспецифичных продуктов реакции при постановке ПЦР с праймерами AC-1 F/R, подобранными для A. citrulli, не наблюдалось. В результате реакции был получен продукт нужной длины размером 140 п.о.
При проверке чувствительности предварительно были подготовлены последовательные разведения штамма 51 с концентрацией бактерий от 101 до 109 КОЕ/мл.
Разработанная пара праймеров AC-1 F/R обладала высокой чувствительностью, что в ходе наших исследований позволяло обнаружить фитопатогена в концентрации до 102 КОЕ/мл.
Электрофореграмма продуктов амплификации при проверке чувствительности праймеров AC-1 F/R. Наличие светлой полосы на электрофореграмме говорит о прохождении реакции.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования пары праймеров AC-1 F/R при проведении фитосанитарной экспертизы для выявления и идентификации фитопатогенного микроорганизма A. citrulli. В серии опытов по изучению специфичности праймеров AC-2 F/R были получены неудовлетворительные результаты. На элетрофореграммах можно было видеть, что в процессе амплификации происходил синтез неспецифичной ДНК, что отображалось в большом количестве дополнительных бендов и шмер. Изменение температурно-временных условий амлификации (повышение температуры и времени отжига праймеров, изменение количество циклов), а также уменьшение концентрации праймеров, изменение состава реакционной смеси, замена Master-Мix 5Х MasCFETagMIX – 2025 (Диалат, Россия) на Encyclo (Евроген,
Россия), DreamTaq Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, США), Tersus (Евроген, Россия) не повлияло на улучшение результатов. В связи с отсутствием специфичности был сделан вывод, что пара праймеров AC-2 F/R не может применяться для выявления и идентификации A. citrulli. В ходе исследований было показано, что из трех пар праймеров подобранных для возможной диагностики фитопатогенного микроорганизма – возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур A. citrulli, только разработанная пара праймеров AC-1 F/R отвечает предъявляемым требованиям, обладая подлинностью, высокой специфичностью и чувствительностью. В результате экспериментов были определены оптимальный состав реакционной смеси, температура отжига, которая составляла 63С. Таким образом, подобранная нами специфичная пара праймеров AC-1 F/R может быть успешно использована и расширяет возможности проведении диагностики A. citrulli. Следует отметить, что результаты данных исследований A. citrulli легли в основу методических рекомендаций по выявлению и идентификации возбудителя бактериальной пятнистости тыквенных культур Acidovorax citrulli (Shaad et al.), используемых карантинными лабораториями при проведении фитосанитарной экспертизы (Шнейдер Е.Ю., Каримова Е.В., 2015).
Изучение влияния культуральной жидкости гриба Tr. harzianum Rifai штамм F180 в отношении A. citrulli проводили согласно методике описанной в главе материалы и методы. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 26, на рисунках 25 и 26. Изучение действия культуральной жидкости гриба Tr. harzianum Rifai F-180 в отношении A. citrulli методом диффузии в агар Активность L-лизин--оксидазы в КЖ, Емл Средний радиус зоны подавления роста культуры, мм Среднеезначение зоныподавления 1 повторность 2 повторность 3 повторность 0,54 12 13,15 12,5 12,6 a
Ингибирующее действие КЖ гриба Tr. harzianum Rifai штамм F-180 при разной активности L-лизин--оксидазы на рост бактерии A. citrulli (24 ч. после начала постановки опыта).
При анализе результатов, представленных в таблице 27, можно отметить, что в лабораторных условиях культуральная жидкость гриба Tr. harzianum Rifai штамма F-180 с исследуемой активностью в различной степени подавляет рост чистой культуры бактерии A. citrulli.
При сравнении результатов исследования (см. таблицу 14), можно сделать вывод, что биологическая эффективность культуральной жидкости Tr. harzianum в отношении A. citrulli c исследуемой активностью была в среднем на 28% выше, чем в отношении бактерии E. amylovora.
Наибольший средний радиус зоны подавления роста чистой культуры бактерии A. citrulli был отмечен при использовании КЖ без разведения с активностью L-лизин--оксидазы 0,54 Емл, он составил 13,15 мм; наименьший – 4,0 мм был при активности L-лизин--оксидазы в КЖ 0,054 Е/мл.
В целом, в данном исследовании были получены результаты, аналогичные опытам с фитопатогенной бактерией E. amylovora. Степень подавления роста чистой культуры бактерии была прямо пропорциональна активности: чем выше используемая активность культуральной жидкости, тем больше радиус зоны подавления роста культуры.