Введение к работе
Актуальность проблемы. В народном хозяйстве ЛРЕ средіг традиционных сельскохозяйственных культур зернобобовые занимают одно из .ведущих мест, как культуры, имеющие .большое значение в питании местного населения. В связи с растущей ролью биологического азота в земледелии Египта, его вы* сокой экономичностью и экологической чистотой, важно задать условия, способствующие усилению процесса симбиотической азотфиксации. Это и определило проведение наших .исследований, связанных с выяснением характера влияния Веществ с фитогормональным эффектом на клубеньковые бактерии для обоснования и разработки приемов регуляции бобово-ризобн-ального симбиоза.
Соединения фитогорманальной природы, такие как ауксины и цитокинины (Тагиев, 1966; Phillips, Torrey, 1972; Сабель— никова, 1983); регулируют ростовые процессы у бобовых растений. Использование, регуляторов роста на практике дает новые эффективные приемы зоздействия на урожай сельскохозяйственных культур (Турецкая, 1953).
Если характер влияния ауксинов и цитокинимов на бобово-ризобиальный симбиоз и изучался довольно интенсивно в последние годы, то о влиянии гамма-аминомасляной кислоты (ГАМ'К)—фактора опухолевого роста растений (Peters, Lip-pincott, 1973) и соединений геряеноидной природы — отходов целлюлозной промышленности, которые, .как оказалось, стимулируют развитие томатов, огурцов, ячменя и других растений, на клубеньковые бактерии в чистой культуре и условиях симбиоза данных практически иет. Вместе с тем исследование их фитогормокального эффекта может расширить способы реализации планов повышения эффективного сельского хозяйства на современном этапе, а положительное решение о возможности использования отходов целлюлозной промышленности будет способствовать не только более полной утилизации материальных ресурсов, созданию безотходных технологий, но и обеспечению охрааш окружающей среды от загрязнения.
Цель «и задачи исследования. Цель — выявить из использо-
гросга-^чУ^им-ы^к+шетины, ГАМК и фрак-
НАУЧНЛП R v 'ЗЯ.-.О ГСП Л Моек, селлгкоха і. акад~. к*
им. К. А. Тимиэяэола Ино.г,>эс/-
ванных регуляторо
ции соединений — отходов целлюлозной промышленности) наиболее эффективные в отношении бобово-ризобизльного симбиоза.
Задачи — изучить влияние указанных соединений на клу,-беньковые бактерии в чистой культуре, установить дозы оптимальные, ингибирующие и стимулирующие их рост и развитие, возможность синтеза данных веществ (ауксина, кинети-на) клубеньковьши бактериями н проверить их действие в условиях симбиоза с растением-хозяином.
Научная новизна. Впервые выявлено стимулирующее дей
ствие ряда фракции терпеноидной природы — отходов целлю
лозной-промышленности на процесс инокуляции растений лю
церны. Подтвержден стимулирующий-эффект ауксинов на бо-
бово-рнзобиальный симбиоз. Показана неоднозначность дей
ствия исследованных соединений на разные виды клубенько
вых бактерий в условиях чистой культуры и симбиоза. ,; :
Практическая г ценность. Полученные данные свидетельст
вуют о перспективности приема инокуляции бобовых культур
в ^сочетании с обработкой семян ростовыми веществами. Ре
зультаты исследований могут быть использованы в лекцион
ных курсах по общей и сельскохозяйственной микробиологии.
.Автор приносит глубокую благодарность научному руково
дителю профессору Викторине Кузьминичне Шильниковой; за
повседневное внимание и большую помощь при выполнении и
написании.давной работы. ; . .:.*
Автор благодарит также заведующего кафедрой микробиологии ТСХА профессора Всеволода Тихоновича Емадева за содействие и поддержку гари проведении данной работы.
Апробация работы. Результаты работы дакладьивались и обсуждались на заседаниях кафедры микробиологии ТСХА, на научной конференции ТСХА в июне 1985 г.
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 90 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц, 2 рисунка. Состоит из б глав, выводов. Список литературы включает 187 наименований, в том числе 110 зарубежных: авторов.
Использовали эффективные (эф.) и неэффективные (неэф.) штаммы клубеньковых бактерий коллекции культур ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Пушкин Ленинградской обл.): Rhizobium leguminosarum — штаммы 245а и 250а эф; и 2246 неэф., Rh. meliloti —штаммы 441 зф„ 434 неэф., Ph. phaseoli — штаммы 674 эф., 680 неэф., Rh. japonicum — штаммы 629а эф. и 6346 неэф., Rh. lupini — штаммы 359а, 363а эф. и 400 неэф. и другие.
Штаммы быстрорастущих культур выращивали и хранили на бобовом агаре, медленнорастущих—на среде Н. М. Лазаревой (1953).
Все физиологически активные вещества применяли в концентрациях от 0,1 до 0,00001 %.
Влияние физиологически активных веществ на клубеньковые бактерии в.чистой культуре определяли путем регистрации эффекта стимулирования или ингп&ирования степени роста клубеньковых бактерий методом дисков .и путем одновременного внесения инокулюма и физиологически активмых веществ в разных дозах в питательную среду для ризобий.
Опыты с инокулированными растениями ставили в 1983— 1984 гг. в стерильных лабораторных условиях на кафедре агрохимии ТСХЛ. Повторность опытов 6-кратная. Гетероауксин (бета-иадолилуксусную кислоту,". ИУК) определяли в клетках ризо&ий методом Полевого (1959), в клубеньках — методом Ракитина, Поволоцкой (1966) в модификации В; И. Сабелыш-ковой.
Семена растений стерилизовали по методу Натмана (Nut» man, 1949), концентрированной серной кислотой в течение 3 мин. с последующим многократным отмыванием стерильной водопроводной водой, затем их раскладывали на специально приготовленные стерильные чашки Петри со смоченными стерильной водопроводной водой ватой и фильтровальной бумагой. Семена проращивали в течение суток при температуре 28 С, наклюнувшиеся семена (длина проростков 2—3 мм) обрабатывали в соответствии со схемой опыта в течение 30 мин суспензиями клубеньковых бактерий из расчета 20—-30 тыс. клеток на семя (Калниншь с соавт.; 1978). Норму инокуляции определяли «методом посева. Для опыта использовали агаризо-ванную среду С. А. Ковровцевой (1933). Среду различали в 500 мл колбы Эрленмейера. (по 60 мл) « стерилизовали. В каждую колбу высевали по 10 инокулировамных семян люцерны^ (Семена получали на кафедре растениеводства ТСХА).
Растения, выращивали под лампой дневного света на кафедре агрохимии.ТСХА. За процессом инфицирования бобовых растений-и образованием клубеньков наблюдали ежедневно в первые пять дней опыта.и с интервалом в 2—3 дня в последующие сроки. Корни растений просматривали под световым микроскопом МБИ-15 по всей длине участками по 3 мм. На каждом участке подсчитывали общее количество корневых волосков и волосков искривленных и с инфекционными нитями; В каждом варианте визуально учитывали количество образовавшихся клубеньков.
Изучение цитокшшнной активности культур клубеньковых бактерий проводили методом биотеста по О. Н. Кулаевой (1973). Клубеньковые бактерии тороха, фасоли, люцерны, лю-
пина и сои выращивали в жидкой бобозой среде в течение б— 8 дней на качалке при 28С.,Культурзльную жидкость исследуемых культур обрабатывали в делительной воронке этиловым эфиром с уксусной кислотой, а затем испытывали на цитокинин-иую активность путем нанесения на выбитые из листьев ячменя диски в чашках Петри. После пяти суток инкубации на рассеянном свету на дисков экстрагировали хлорофилл в 96-ном этаноле. Определяли хлорофилл количественно на спектрометре Хитачи (Hitachi).
Концентрацию хлорофилла вычисляли по формуле Винтер-мане и Де Монге (Шлык, 1968) в смеси без разведения.
В качестве ГЛМК брали катсулы ноотропила и пирацета-ма (2-окоо-1-пнрролидшшл-ацетоамид). В одной капсуле 0,4 г действующего вещества ГЛМК. Чашки Петри заливали ага-рнзованной средой (0,1% агзра) «по градиенту концентрации» (шаг 0,02 г).
Фракцию Б-153 и ее производные, (фракции КСД и КТС) любезно предостааил нам зав. кафедрой органической химии .ТСХЛ проф. И. И. Грандберг, за что мы ему чрезвычайно при-" знательны. По'предварительным данным кафедры органической химии ТСХЛ, фракция Б-153 содержит терпеновые спирты, сееквитерпеновые углеводороды (соединения с тремя изо-преновьши группировками) спирты и дитерпены (соединения с 4-:.'я изогсреновыми группировками).