Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Микробные биопленки 11
1.1.1. Образование биопленок 12
1.1.2. Структура биопленок 14
1.1.3. Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции 16
1.2. Бактерии рода Staphylococcus 18
1.1.1. Бактерии вида S. epiderm idis 19
1.2.1. Роль S. epiderm idis в БАИ 20
1.3. Факторы, влияющие на первые этапы образования биопленок 21
1.3.1. Окружающая среда 21
1.3.2. Поверхность материала 24
1.3.3. Характеристики бактериальной клетки 27
1.3.4. Белки сыворотки и тканей человека 32
1.4. Антибактериальные пептиды 36
Экспериментальная часть 39
Глава 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Бактериальные штаммы и среды 39
2.2. Культивирование и подготовка бактерий S. epidermidis 42
2.3. Определение количества колониеобразующих единиц 42
2.4. Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина 42
2.5. Определение минимальной подавляющей концентрации 42
2.6. Определение дзета-потенциала бактериальных клеток 43
2.7. Выделение полной геномной ДНК 44
2.8. Предобработка поверхности полистирола плазмой, сывороточными белками и катионными пептидами
2.9. Определение гидрофобности поверхностей бактериальных клеток и полистирола 44
2.10. Предобработка бактериальных клеток гидролитическими ферментами и антибактериальными пептидами 45
2.11. Определение адгезионной способности бактериальных клеток 46
2.12. Определение биопленкообразующей способности бактерий 47
2.13.Изучение действия ферментов и антибактериальных соединений на суточные биопленки 48
2.14. Атомно-силовая микроскопия 49
2.15. Получение и анализ фильтратов среды с ранних этапов образования биопленок 49
2.16. Статистика 50
Глава 3. Характеристика использованных в работе штаммов бактерий s epidermidis 51
Глава 4. Влияние физико-химических условий на адгезию бактерий s epidermidis 56
4.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от гидродинамических условий культивирования 56
4.2. Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis 58
4.3. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от кислотности среды 60
4.4. Влияние осмолярности среды на адгезию и образование биопленок бактерий S. epidermidis 61
4.5. Адгезия и образование биопленок бактериями S. epidermidis при внесении в среду глюкозы 65
Глава 5. Влияние соединений, меняющих свойства бактериальной поверхности, на адгезию и образованиебиопленок бактерий s epidermidis 67
5.1. Зависимость адгезии бактерий S. epidermidis от содержания в среде ионов
двухвалентных металлов 67
5.2. Влияние ЭДТА на адгезию и развитие биопленок бактериями S. epidermidisl\
5.3. Действие детергентов на адгезию бактерий S. epiderm idis 73
5.4. Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epiderm idis 74
5.5. Действие мембранотропных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis 77
5.6. Действие гидролитических ферментов, периодата натрия и ДНК на адгезию и формирование биопленок бактериями S. epidermidis 78
5.7. Действие гидролитических ферментов и периодата натрия на сформированные биопленки бактерий S. epidermidis 85
Глава 6. Действие антибиотических соединений на адгезию и образование биопленок бактериями s epidermidis 89
6.1. Действие линезолида на адгезию и образование биопленок бактериями S. epidermidis 89
6.2. Действие антибактериальных пептидов на адгезию и образование биопленок бактериями S. epiderm idis 90
Глава 7. Изучение адгезии бактерий s epidermidis в присутствии компонентов крови 100
Глава 8. Изучение регуляции процессов адгезии бактерий s epidermidis 105
Заключение по выводы 116
Список литературы 1
- Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции
- Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина
- Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis
- Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epiderm idis
Биопленки и биоматериал-ассоциированные инфекции
Образование биопленок включают в себя две основные функциональные фазы: первичную адгезию с адаптацией бактерий к поверхности и формирование многослойных клеточных слоев и кластеров, обусловленное продукцией внеклеточного полимерного матрикса (O Toole et al., 2000). На начальной стадии бактериальной колонизации клетки приближаются к поверхности настолько близко, что их подвижность снижается, и возникают кратковременные контакты с поверхностью. В этот период первичная адгезия микроорганизмов в значительной степени определяется физико-химическими свойствами поверхностей как бактериальных клеток, так и атакуемого материала (von Eiff et al., 2002). Главными действующими силами на этом этапе являются силы Ван-дер-Ваальса, уровень гидрофобности клеточной поверхности (Oliveira et al., 2001), величина заряда сорбирующихся клеток (van Loosdrecht et al., 1990), а так же гидрофобность, заряд, шероховатость и химический состав поверхности атакуемого материала (An and Friedman, 2000). Гидрофобность клеточной поверхности и первичная адгезия бактерий, во многом, зависят от присутствия бактериальных поверхностно-ассоциированных белков (von Eiff et ai, 2002). Однако, в природе бактерии чаще прикрепляются, не непосредственно к субстрату, а к слою адсорбированных на его поверхности молекул, так называемой «кондиционной пленке». В этом случае, прикрепление бактериальных клеток, в основном, зависит от специфических взаимодействий бактериальных адгезинов с их комплементарными рецепторами, находящимися на поверхности атакуемого субстрата. Такие особые белковые молекулы известны как компоненты микробной поверхности, узнающие адгезивные молекулы матрикса (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules, MSCRAMMs) (Patti et al., 1994). Одним из примеров такого типа поверхностных белков, взаимодействующих с матричными белками поверхностных структур, может служить Fbe - фибриноген-связывающий белок Staphylococcus epidermidis, локализованный на поверхности клеточной стенки (Vuong and Otto, 2002).
При завершении этапа первичной адгезии к поверхности материала в иммобилизованных бактериях активируются процессы деления и размножения с формированием микроколонии, создающих многослойные клеточные кластеры. В этом процессе принимают участие межклеточные адгезины и синтезируемые внеклеточные полимерные матричные молекулы, включающие белки и полисахариды. С увеличением бактериальной популяции клетки начинают продуцировать химические сигналы, с помощью которых, через системы «quorum sensing» (QS) контактируют с другими бактериальными клетками. Установлено, что данные механизмы способны регулировать широкий спектр физиологических процессов (Ильина и др., 2006), в том числе, активировать гены, ответственные за продукцию экзополисахаридов (Costerson et al, 1999). Продолжающийся рост прикрепленных микроорганизмов приводит к образованию бактериальных агрегатов, погруженных в экзополимерный матрикс, характерный для зрелых биопленок (Wilson, 2001).
Под воздействием сильных механических и гидродинамических усилий, а так же регуляции по механизму QS зрелые биопленки могут вступать в процесс диссеминации с высвобождением в окружающее пространство отдельных клеток или их кластеров. В дальнейшем отделившиеся фрагменты могут колонизировать другой район субстрата с образованием новых микроколоний или диссеминировать в пространстве и формировать очаги образования биопленок на отдаленных от локализации первоначальной пленки субстратах (Chmielewski and Frank, 2003).
Протяженность процесса образования биопленок стафилококками, стрептококками и псевдомонадами чаще всего составляет около 2-4 дней и распределяется по основным этапам следующим образом: планктонные бактерии сорбируются на абиотической поверхности в течение нескольких минут (Frank, 2001); в течение последующих 2-4 ч образуются прочно соединенные микроколонии; в течение 6-12 часов с момента прикрепления к субстрату активируется продукция внеклеточных полисахаридов, и вместе с ней, появляется устойчивость к неблагоприятным условиям среды; затем в течение 2-4 дней в зависимости от вида бактерий и условий роста зрелые колонии биоплёнки, проходят процесс созревания и диссеминации от поверхности с высвобождением планктонных бактерий (Афиногенова и Даровская, 2011).
С помощью современных видов микроскопии, таких как конфокальная лазерная сканирующая микроскопия, а так же молекулярных и электрохимических методов высокого разрешения были исследованы структурная организация и функции сообщества биопленок. Исходя из современных данных, зрелые биопленки представляют собой высокогетерогенное организованное сообщество, структура которого представляет микроколонии бактериальных клеток, заключенные в разделенный водными каналами внеклеточный полимерный матрикс (Donlan and Costerton, 2002). В основном, всем типам биопленок присущи некоторые универсальные структурные атрибуты, но, несмотря на это, каждое микробное сообщество уникально (Tolker-Nielsen and Molin, 2000). В зависимости от свойств поверхности, доступности питательных веществ, состава и уровня гетерогенности микробного сообщества и гидродинамики структура биопленок может колебаться от модели плотной биопленки до рыхлой мозаичной модели, структура которой представляет собой сложную организацию, включающую грибоподобные агрегаты, разделенные водными пространствами (Николаев и Плакунов, 2007). Последний тип структуры обычно рассматривается как типичная архитектура биопленок (Costerton, 1995), характерная для сообществ, образованных при низких концентрациях питательных веществ, высоком сдвигающем усилии потока и отсутствии механических, абразивных и сжимающих сил (Wilson, 2001).
Считается, что вода является главным компонентом матрикса биопленки, на долю которого приходится до 97% (Zhang et al., 1998). Тогда как содержание бактерий составляет 10-50% от общего объема биопленки (Costerton, 1995). Количество внеклеточных полимерных веществ колеблется в пределах 50-90% от общего количества органического углерода в биопленках (Flemming et al., 2000). Кроме полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот или фосфолипидов в матриксе биопленок также могут быть обнаружены другие неклеточные материалы, такие как кристаллы минеральных соединений или компоненты крови, присутствие которых зависит от окружающей среды, в которой развивалось это сообщество (Donlan, 2002).
Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина
В ряде экспериментов использовали донорскую плазму крови человека, бычий сывороточный альбумин (БСА) и фибронектин человека (Фн). Для получения плазмы цельную кровь здоровых доноров собирали в пробирки с ЭДТА («Improvacuter», Китай) и форменные элементы крови отделяли центрифугированием (3500xg, 5 мин, 5415R, «Eppendorf», Германия). Надосадочную жидкость использовали для приготовления 10 об.% раствора плазмы в 0,9% NaCl. Растворы БСА (5 мг/мл) и фибронектина (25 мкг/мл) готовили из лиофилизированных коммерческих препаратов в этом же растворе NaCl. 2.2. Культивирование и подготовка бактерий S. epidermidis
Бактерии S. epidermidis переносили со скошенного LB-агара в жидкую питательную среду LB и культивировали в термостате при 37 С в течение 14-16 ч, затем культуру пересевали в свежую среду LB и выращивали при 37С на шейкере Certomax IS («Sartorius», Германия) с аэрацией (160 об/мин) до достижения бактериальной популяцией логарифмической или стационарной фаз роста, затем клетки осаждали на центрифуге 5415R («Eppendorf», Германия) в течение 5 мин при 12000xg, осадки дважды промывали 0,9% раствором NaCl, используя те же условия осаждения клеток, после чего суспендировали до содержания бактерий 10 КОЕ/мл в среде LB, если исследовали действие факторов в питательной среде, или в ФБ в случае дальнейших исследований в ФБ или 0,9% растворе NaCl.
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ/мл) выявляли микрометодом точечных высевов последовательных десятикратных разведений бактериальных суспензий на агаризованную среду LB (Herigstad et al, 2001).
Определение способности бактерий S. epidermidis к секреции полисахаридного межклеточного адгезина Тестирование бактерий S. epidermidis на способность к секреции полисахаридного межклеточного адгезина (PIA) проводили с использованием среды с добавлением индикатора Конго красный (Freeman et al., 1989). Для постановки данного теста в чашки Петри вносили 15 мл агаризованной среды, содержащей 0,08% Конго красного. После затвердевания среды производили посев суточных культур стафилококков, выращенных на LB с добавлением 0,5% глюкозы. Инкубацию проводили в термостате в течение 24 ч при 37 С, после чего фиксировали результат.
Определение минимальной подавляющей концентрации Минимальные подавляющие концентрации (МІЖ) ЭДТА, детергентов и линезолида для всех исследуемых штаммов определяли методом серийных разведений согласно МУК 4.2.1890-04. Для этого в лунки 96-луночного полистиролового планшета для иммуноферментного анализа («Медполимер», Россия) вносили по 100 мкл среды LB, затем в первую лунку ряда вносили 100 мкл раствора исследуемого соединения и готовили серию двукратных разведений. Затем в каждую лунку вносили 10 мкл суспензии клеток исследуемого штамма S. epidermidis, содержащей 1x10 КОЕ/мл. Результаты оценивали через 16-18 ч культивирования при 37С. В качестве МІЖ принимали самую низкую концентрацию препаратов, вызывающую полную задержку роста бактерий.
МІЖ катионных пептидов (варнерина и хоминина) определяли указанным выше способом с последующим установлением содержания антибактериальных пептидов в образце путем сравнения МІЖ исследуемого препарата для бактерий S. epidermidis GISK 33 со значением МІЖ референс-образца с точно известным количеством антибактериального пептида.
Количество пептида в референс-образце было установлено с помощью аминокислотного анализа очищенного гомогенного препарата варнерина и хоминина. 2.6. Определение дзета-потенциала бактериальных клеток
Дзета-потенциал бактерий S. epidermidis определяли на лазерном анализаторе размера частиц и дзета-потенциала Zetasizer NanoZS («Malvern», Великобритания) с программным обеспечением «ZetaSizer Software 6.20» («Malvern», Великобритания) методом динамического светорассеяния под углом 90 по изменению распределения частиц в электрическом поле. Для этого отмытые бактериальные клетки S. epidermidis непосредственно перед измерением суспендировали до содержания 10 КОЕ/мл в питательной среде LB без КС1, содержащей двухвалентные ионы кальция, магния, цинка или марганца в определенной концентрации и проводили измерения при 37С в течение 30 мин. исследования проведены научным руководителем работы В.П. Коробовым в лаборатории биохимии пептидов Абердинского университета (Абердин, Великобритания) 2.7. Выделение полной геномной ДНК
Для оценки действия внеклеточной ДНК на адгезию бактерий S. epidermidis 33 использовали препараты полной геномной ДНК, выделенные из бактерий этого штамма и из бактерий P. acnes АС 1450. Для этого из ночных культур бактерий этих штаммов, выращенных на среде LB, выделяли полную геномную ДНК с применением набора «Bacterial Genomic DNA Miniperp Kit» («Axygen», США) по прописи фирмы-изготовителя. Количество полученной ДНК определяли по степени поглощения на спектрофотометре UV-1700 («Zhimadzu», Япония) при длине волны 260 нм. В качестве референс-образца использовали раствор препарата ДНК КРС. Затем полученные препараты ДНК вносили в питательную среду LB до одинаковой конечной концентрации и использовали в экспериментах.
На поверхность полистироловых чашек Петри (диаметр 40 мм, «Медполимер», Россия) наносили по 2 мл подготовленных растворов плазмы крови человека (10 об.%), БСА (5 мг/мл), Фн (25 мкг/мл), варнерина (32 мкг/мл) или хоминина (32 мкг/мл). В качестве контролей использовали чашки, предобработанные 0,9% раствором NaCl. Предобработку поверхностей чашек Петри проводили в течение 60 мин при 37С, затем жидкие среды удаляли аспирацией, чашки однократно промывали 2 мл ФБ (10 мМ, рН 7,2) и на поверхность чашек наносили бактериальные суспензии.
Уровень гидрофобности поверхностей бактерий S. epidermidis определяли с помощью ВАТН-теста в двухфазной системе с гексадеканом (Rosenberg, et al., 1980). Для этого подготовленные бактериальные клетки ресуспендировали в 0,9% растворе NaCl до OD6oo 0,3-0,5. Готовые суспензии (1,2 мл) вносили в фотометрические откалиброванные пробирки диаметром 10 мм, а затем на их поверхность аккуратно наслаивали по 0,2 мл гексадекана и измеряли оптическую плотность водной фазы (Ао) при 600 нм на спектрофотометре PD-303 («Apel», Япония). Затем пробирки выдерживали в течение 10 мин при комнатной температуре для насыщения, интенсивно перемешивали на вортексе («Biosan», Латвия) на максимальной скорости в течение 120 с и оставляли при комнатной температуре на 15 мин для полного расслаивания эмульсии, после чего снова измеряли оптическую плотность водной фазы (Аі). В контрольные пробы вносили 0,9% раствор NaCl. Степень гидрофобности (Af, %) определяли по формуле (1):
Определение уровня гидрофобности поверхностей полистирола проводили путем измерением краевого угла смачивания по модифицированному методу сидячей капли. На исследуемую поверхность наносили несколько капель дистиллированной воды объемом 10 мкл, затем в течение 60 с после контакта фотографировали профиль полученных капель, используя цифровую фотокамеру D90 («Nikon», Япония). После чего на полученных фотографиях с помощью программного обеспечения «GIMP 2.0» вручную измеряли радиус (г) и высоту (h) капли. Контактный угол (0, ) вычисляли по формуле (2) (Yuan and Lee, 2013)
Изучение влияния температуры среды инкубации на адгезию бактерий S. epidermidis
Учитывая данные о наличии в пленках стафилококков белковых компонентов (Gotz, 2002), было проведено изучение влияния на адгезию и рост формирующихся пленок ионов биологически активных металлов, так как известно, что их присутствие во многом определяет активность внеклеточных протеаз и пептидаз (Mikhailova et al., 2005).
Исследования показали, что наличие в среде культивирования катионов кальция снижает количество сорбированных клеток и интенсивность формирования биопленок S. epidermidis 33. Количество адгезированных клеток штаммов 12228 и 29887 практически не меняется в присутствии Са , однако интенсивность формирования пленок снижается в 2 раза (Рисунок 17). различия статистически значимы при сравнении с контролем (LB) (р 0,05) Рисунок 17. Влияние ионов кальция (2,5 мМ) и цинка (2,5 мМ) в среде LB на адгезию (А) и образование биопленок (Б) бактериями S. epidermidis.
Обнаружено также, что ингибирующим эффектом как на адгезию, так и образование биопленок для всех исследованных штаммов S. epidermidis обладают ионы цинка (2,5 мМ). Влияние ионов цинка наиболее значительно проявляется на первых этапах образования биопленок, приводя к уменьшению числа сорбированных клеток на 85-97 %, при этом образование биопленок снижается всего в 1,5-2 раза (Рисунок 17).
Отмечено, что ингибирующий эффект ионов цинка не связан с его бактерицидным действием, так как количество живых клеток после 30 мин адгезии не изменилось по сравнению с контролем (Таблица 6).
Для более детального изучения влияния двухвалентных катионов было проведено исследование адгезии и образования биопленок бактериями S. epidermidis 33 при внесении в среду двухвалентных катионов (Са , Mg , Zn ,
Mn ) в диапазоне концентраций от 0 до 2,5 мМ (Рисунок 18). Результаты экспериментов (Рисунок 18А, Г) показали, что увеличение концентрации ионов кальция и марганца в среде культивирования до 0,5 мМ ведет к незначительной активации образования биопленок. Дальнейшее увеличение содержания ионов
Важно отметить, что возрастание содержания в среде ионов Mg до 2,5 мМ повышает способность бактерий образовывать биопленки примерно в 2 раза (Рисунок 18Б). В тоже время, присутствие в среде ионов цинка оказывает ингибирующее действие на образование биопленок (Рисунок 18В), начиная от самой минимальной исследованной концентрации. Одновременно с этим, адгезия бактериальных клеток в значительной мере подавляется в присутствии всех исследованных в работе катионов.
Выраженное ингибирование пленкообразования S. epidermidis 33 при введении в среду роста ионов Са , Zn , Мп может рассматриваться как следствие активации внеклеточных протеолитических ферментов (Gossas and Danielson, 2006), приводящей к дефициту полноценных белковых компонентов, необходимых для построения матрикса формирующихся биопленок коагулазонегативных стафилококков.
Известно, что ионы кальция и марганца способны ингибировать адгезию к полистиролу, межклеточную агрегацию и образование Вар-зависимых биопленок бактериями S. aureus (Arrizubieta et al., 2004). По-видимому, это обусловлено связыванием ионов кальция с белком Вар через EF-мотив данного белка, что приводит к неспособности к межклеточной агрегации и, тем самым, к образованию биопленок. Можно предположить, что подобный эффект характерен и для бактерий S. epidermidis, обладающих Р1А-отрицательным фенотипом. Считается, что за адгезию стафилококков ответственны белки клеточной стенки Аар и SasG, которые имеют Zn-связывающие домены (Conrady et al, 2008). В соответствии с этим можно предположить, что избыток ионов цинка способен оказывать влияние на количество сорбированных клеток. Ионы марганца, возможно, связывались с этими белками не специфически, и тем самым, по-видимому, могли блокировать их основные функции и приводить к заметному снижению способности клеток стафилококков сорбироваться на поверхности полистирола.
Кроме того, в составе клеточной стенки грамположительных бактерий имеются компоненты (экзополисахариды, липотейхоевые кислоты), способные связывать ионы кальция (Josefsson et al, 1998; Потехина, 2006). Важно отметить, что такое неспецифическое связывание металлов с поверхностными структурами бактерий может приводить к изменению их электростатических свойств.
Действительно, результаты исследования влияния двухвалентных катионов на дзета-потенциал клеток S. epidermidis 33 подтвердили предположение об их способности оказывать влияние на электрический заряд бактериальных клеток (Таблица 7). Максимальное действие на величину дзета-потенциала бактериальных клеток оказывали ионы магния, изменяя его практически на 30%, меньший эффект проявляли ионы кальция, цинка (на 20 и 18%, соответственно) и, наконец, ионы марганца, вызывавшие изменение дзета-потенциала лишь на 7%.
Таким образом, присутствие двухвалентных катионов в среде, по-видимому, оказывает влияние на адгезию бактерий S. epidermidis с помощью двух различных механизмов: специфического связывания с белками и неспецифического связывания с отрицательно-заряженными группировками на поверхности бактериальных клеток, приводящего к изменению дзета-потенциала клеток. 5.2. Влияние ЭДТА на адгезию и развитие биопленок бактериями S. epidermidis
Как было показано выше, катионы двухвалентных металлов обладают значительном влиянием на первые этапы взаимодействия бактериальных клеток с поверхностями материала. Поэтому присутствие в среде ЭДТА, известного в качестве универсального хелатирующего агента, также может оказывать ингибирующее действие на процессы сорбции бактериальных клеток на полистироле (Dunne Jr and Burd, 1992).
Действительно, внесение в среду ЭДТА (2,5 мМ) вызывало ингибирование процесса адгезии бактерий всех использованных в работе штаммов, а так же снижение интенсивности образования биопленок у S. epidermidis 33 и 29887 почти в 3 раза (Рисунок 19).
Влияние бактерицидных соединений на адгезию и образование биопленок бактериями S. epiderm idis
Известно, что устойчивость биопленок стафилококков к действию периодата натрия и лизостафина, в основном, проявляется при отсутствии или низком содержании полисахаридного межклеточного адгезина в матриксе биопленок (Qin et al., 2007а). Биопленки, образованные бактериями с PIA-отрицательным фенотипом, так же характеризуются чувствительностью к обработке трипсином (Rohde et al., 2007) и протеиназой К (Kogan et al., 2006), в связи с тем, что основным компонентом матрикса биопленки являются белки. Действительно, проведенные нами эксперименты показали, что внесение трипсина и протеиназы К вызывало разрушение сформированных биопленок (S.epidermidis 12228 и 29887). Вместе с тем необходимо отметить, что суточные биопленки всех изученных нами штаммов обладали устойчивостью к лизоциму и окислительному действию периодата натрия.
Таким образом, полученные нами результаты действительно свидетельствуют о том, бактерии S. epidermidis 33, 12228 и 29887 используют PIA-независимый механизм формирования биопленок.
Общая сравнительная характеристика действия некоторых гидролаз и периодата натрия на процессы адгезии и формирования биопленок (Рисунок 26), а также разрушения сформированных биопленок бактерий S. epidermidis (Рисунок 31) приведена в Таблице 11.
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод, о том, что факторы, ингибирующие процессы адгезии клеток к полистиролу, не всегда оказывают разрушающее действие на сформированные биопленки.
Так, наши исследования показали, что снижение количества сорбированных клеток под действием гидролаз хорошо согласуется с торможением процесса формирования биопленок в целом. Однако, в процессе развития биопленок стафилококков соотношение компонентов в матриксе, вероятнее всего, претерпевает существенные изменения, что приводит к изменению чувствительности биопленок к гидролитическим ферментам по сравнению с их действием на первых этапах развития этих бактериальных сообществ.
Исходя из полученных данных о том, что процессы адгезии и формирования биопленок существенно (в 2 раза) ингибировались трипсином и периодатом натрия, можно предполагать, что поверхностные белковые и углеводные структуры бактерий вносят важный сопоставимый вклад в колонизацию поверхности на первых этапах образования биопленок Р1А-отрицательными стафилококками. Данный факт особо интересен в связи с тем, что согласно данным литературы (Rohde et al., 2007) и нашим результатам относительно чувствительности суточных биопленок стафилококков к трипсину и устойчивости к периодату натрия, матрикс суточных биопленок, образованных бактериями исследованных нами штаммов, имеет в своем составе преимущественно белковые компоненты.
Данные литературы свидетельствуют также о том, что ингибирование процесса образования биопленок при добавлении ДНКазы одновременно с инокулятом проявляется в большей степени (Qui et al., 2007b). В тоже время, нашими исследованиями показано, что собственная внеклеточная ДНК играет большую роль на всех этапах развития биопленок Р1А-отрицательных стафилококков, так как внесение в среду инкубации ДНКазы вызывало значительное подавление процессов бактериальной колонизации поверхности, а также деструкцию суточных биопленок двух из трех штаммов S. epidermidis. Несмотря на это, дополнительное внесение в среду инкубации препаратов чужеродной ДНК (КРС) не оказывало влияния на все стадии развития биопленок.
Интересно отметить, что все исследованные бактериальные штаммы проявляли различную чувствительность к действию РНКазы (Таблица 11). В связи с тем, что в литературе практически нет данных о каком-либо действии РНКазы на процессы образования биопленок стафилококков (Qin et al., 2007b), и РНК не считается важным компонентом матрикса биопленок, можно предполагать, что обнаруженные эффекты в первую очередь связаны с разрушением мРНК или тРНК, которые участвуют в процессах синтеза белка.
Таким образом, активными участниками процессов первичной адгезии бактерий S. epidermidis к поверхности полистирола и формирования многослойных клеточных кластеров являются разнообразные поверхностно-ассоциированные структуры бактерий, в том числе, белковые молекулы и полисахариды. Изменение этих структур за счет взаимодействия с ионами металлов, детергентами, бактерицидными соединениями или вследствие их ферментативного разрушения в большинстве случаев приводит к снижению сорбционных характеристик бактериальных клеток. Важную роль во взаимодействии бактерий S. epidermidis с поверхностью играет изменение поверхностного заряда бактериальных клеток под действием ионов двухвалентных металлов или мембранотропных соединений, а также за счет наличия аутологичной экзогенной ДНК.
Полученные ранее результаты исследований показали, что основным механизмом адгезии и формирования биопленок изученных штаммов стафилококков на полистироле, вероятно, являются белковые взаимодействия, как на межклеточном уровне, так и на уровне «клетка-поверхность». В связи с этим дальнейшие эксперименты были направлены на исследование адгезионной способности клеток стафилококков в присутствии линезолида - антибиотика, ингибирующего синтез белка (Skripkin et al., 2008).
Обнаружено, что линезолид в концентрации 0,05хМПК не оказывал влияния на адгезию и образование биопленок всеми исследованными штаммами стафилококков (Рисунок 32). Внесение антибиотика в концентрации 0,5хМПК (Таблица 4) снижало как адгезию, так и способность образовывать биопленки бактериями S. epidermidis 33, 12228 и 29887 (Рисунок 32).