Варианты штамма Escherichia coli М17, перспективные для получения эубиотиков Чеснокова, Вероника Ленидовна

Введение к работе

Актуальності» проблемы. Препараты нормофлоры (эубиогики) используются для профилактики и лечения дисбактериозов и других расстройств желудочно-кишечного тракта Они создаются на основе живых культур специально отобранных штаммов-симбионтов, которые являются представшелями нормальной микрофлоры человека и имеют ряд полезных свойств Колибактерин является представителем этой группы лекарственных средств; его основой служит штамм-продуцент Escherichia coli Ml 7, который был выделен из немецкого препарата Mutaflor, впервые разработанного А. Ниссле (Перетц Л.Г., 1955). По результатам многочисленных исследований колибактерин эффективен для лечения дисбактериозов. при вирусных диар-реях. в комплексном лечения острой дизентерии, постдизентерийного колита, затяжных и хронических форм колитов, энтероколитов, неспецифических язвенных колитов и др К сожалению, за годы эксплуатации штамм Е.соН М17 утратил некоторые полезные свойства, в том числе колициногенную активность.

Помимо штамма М17 и его вариантов при производстве колибактерина в 60-е годы стали использовать новый продуцент, входящий в состав препарата, называемого Simbioflor (Германия). Сравнительные исследования трех вышеприведенных штаммов-продуцентов ранее не проводились

В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что казенне адгезии бактериальных клеток к поверхностным рецепторам играет важную роль во взаимодействии микроорганизма с макроорганизмом. Наиболее распространенным типом адгезивных органелл являются пили первого типа. Собственно адгезином служит белок FimH, кодирующийся геном fimH, входящим в состав fim кластра. Вариации в гене адгезина определяют фенотипическую гетерогенность связывания разных бактерий с субстратом. Преимущественное связывание микроорганизма со специфичными субстратными молекулами определяется его принадлежностью к конкретному адгезивному подклассу и отражается как на выборе им жизненного пути в макроорганизме,так и на способности успешно колонизировать разные экологические ниши и вызывать патологический процесс.

Исследование адгезивной активности штамма-продуцента препарата колибактерин проводилось, однако без определения типа образуемых пилей и соответствующего анализа адгезивного фенотипа.

Цель я задачи исследования.

Целью настоящих исследований явилось получение усовершенствованных вариантов продуцента для препарата колибактерин на основе штамма Е.соН М17 с учетом особенностей его адгезивной активности, а также специфики применения препарата на практике.

В связи с этим ставились следующие задачи исследования: сравнительное изучение адгезивной активности трех штаммов-продуцентов препаратов колибактерин, Mutaflor и Simbioflor, исследование функциональных характеристик M^L и М^н адгезивных фенотипов пилей первого типа с использованием изопенных штаммов, в том числе сравнительное изучение связывания с различными субстратами и клетками, определение механизма различий в рецептор-связывающен способности; разработка техники получения модельных штаммов с "выключенным" геном адгезина различными методами; изучение возможности транс-комплементации fimH генов; получение на основании разработанных методик рекомбинантного варианта производственного штамма Е.соН М17 с "выключенным" геном адгезина и оценка его адгезивных свойств; получе-

ниє вариантов производственного штамма Е.со/і МІ7 с повышенной антагонистической активностью (колициногенностью) и устойчивых к антибиотикам и ичучемие свойств полученных штаммов.

Научная новизна. Впервые проведен анализ адгезивных свойств пилей первого типа производственного штамма колибактерина E.coli М17 в сравнении с штаммами-продуцентами эубиотических препаратов Mutaflor и Simbioflor. Проведенные исследования механизма адгезии позволили установить корреляцию между адгезивным фенотипом и поведением микроорганизма в макроорганизмс и определить наиболее благоприятный для колонизации кишечника бактериальный адгезивный фенотип. На основании этих данных, а также специфики практического применения эубиотического препарата были определены возможные пути совершенствования штамма-пролуцента колибактерина, а именно: модификация адгезивного фенотипа, придание антибиотико-устойчивости и колициногенности. Впервые был получен рекомбинантный штамм E.coli М17Дг?/л/У/рСо!ар, устойчивый к ампициллину и канамицнну, продуцирующий колицин Е1 и имеющий дефектный ген адгезина. Все полученные свойства не транс-миссибельны. С помощью транс-комплементации штамму может быть придан любой желательный адгезивный фенотип.

Положення, выносимые па зашиту.

1. Производственный штамм E.coli М17 имеет м" адгезивный фенотип, аналогичный фенотипу родственного штамма продуцента препарата Mutaflor, но отличный от фенотипа продуцента препарата Simbioflor.

2. Имеется по крайней мере два механизма связывания, осуществляемого FimH лекти-нами (адгезинами). Дня первого характерно высокое связывание с моно-маннозидными структурами (типа МанБСА, маннана и т. д.), широкий спектр распознаваемых рецепторов и сниженная устойчивость к действию растворенных ингибиторов. Второй определяется низким уровнем связывания с моно-маннозидами, намного более узким спектром рецепторов и низкой чувствительностью к ннгиби-рованию.

3. Аллельные варианты FimH обладают селективным разнообразием и по-разному приспособлены к заселению кишечной палочкой первичной интестинальной и вторичных ниш в организме человека. При этом лектины второго типа связывания оптимально адаптированы к обеспечению E.coli успешного заселения первичной ниши, в то время как адгезины первой группы плохо подходят для этой роли и преобладают среди бактерий, заселяющих вторичные ниши. При этом такая функциональная "ненормальность" аллели может быть фактором, усиливающим вирулентность бактерии.

4. Используя суицидальную плазмиду рСНЮЗ можно получать штаммы с дефектом в хромосомном гене адгезина/і/л//, которые утрачивают исходный адгезивный фенотип и способны приобретать новый при введении в клетку нормальной копни/ітН.

5. Сконструированная плазмида pColap пригодна для использования в качестве фактора, придающего штамму E.coli — продуценту колибактерина устойчивость к антибиотикам пенициллинового ряда и способность к продукции колицина El.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на научно-практических конференциях НПО "Биомедицинские технологии" (Москва, 1995, 1997 и 1998 гг.), на 3-м международном молодежном медицинском конгрессе (Катовицы, Польша, 1997 г.), на 6-м международном молодежном медицинском конгрессе (Каир, Египет, 1998 г.) и на заседаниях и семинарах кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 1996 и 1997 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на/JfC¹ рисунками н/^таблицами.