Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Увеличение
заболеваемости эпидемическим сыпным тифом на 33,3% в 1996г по сравнению с предыдущим обусловило необходимость повышения эффективности эпидемиологического надзора за данной группой риккетсиозов. Важная роль при этом отводится методическому уровню клинической и эпидемиологической диагностики инфекций (И.В.Тарасевич и соавт.,1990), главными особенностями которых в современных условиях являются: преобладание рецидивной формы в общей структуре сыпнотифозных инфекций, регистрация наибольшего числа нозологических форм заболевания среди населения старших возрастных групп, спорадический характер заболеваемости, отсутствие типичной для эпидемического сыпного тифа, зимне-весенней сезонности (М.М.Додонов,1991; Н.Д.КлимчукД994; А.И.Фролова,1997). Эти особенности, а также разнообразие клинических форм проявления сыпнотифозной инфекции затрудняет и в ряде случаев делает невозможной дифференциальную клиническую диагностику (К.М.Лобан, И.В.Тарасевич, 1983). Поэтому в постановке окончательного диагноза решающее значение приобретают серологические методы исследования. Известно, что достоверность полученных результатов в основном зависит от качества специфических диагностических
реагентов. Исходя из этого стандартизацию диагностических
препаратов, повышение их дифференцирующих свойств,
создание и применение единых диагностических систем
следует рассматривать как одну из ведущих и интенсивно
разрабатываемых проблем, определяющих своевременность и
эффективность всего комплекса необходимых
противоэпидемических мероприятий (И.В.Тарасевич и соавт.,1990).
В России медицинской промышленностью выпускается ряд диагностических препаратов для различных серологических реакций: реакции связывания комплемента (РСК), реакции агглютинации (РА), реакции непрямой гемагглютинации(РНГА), иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). По мере углубления знаний об особенностях антигенной структуры риккетсий Провачека разрабатывались более чувствительные и специфичные лабораторные методы, позволяющие расширить возможности эпидемиологического надзора за сыпнотифозной инфекцией. Одним из них является непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА), который рекомендован ВОЗ как для диагностики, так и для широкого эпидемиологического обследования населения (В.А.Яблонская и соавт.,1984). Внедрение данного метода в практику здравоохранения тормозится из-за отсутствия коммерческих стандартизованных высокоочищенных корпускулярных антигенов для МФА.
Анализируя качество сыпнотифозных диагностических
препаратов, исследователи указывают на наличие в них,
помимо специфических антигенов, компонентов среды
культивирования (М.Е.Еремеева, 1994). "
Широкий спектр выпускаемых антигенных
диагностических препаратов для РСК, РА, РНГА, ИФРМА обусловил и многообразие технологических процессов их изготовления, общим для которых является использование этилового эфира на стадии очистки риккетсии, что позволяет, с одной стороны, удалить жировые и тканевые компоненты среды культивирования, с другой стороны, вызывает снижение специфической активности препаратов в результате элиминации активных антигенных структур - белковых и фосфолипидных комплексов. Этот нежелательный эффект, а также загрязнение окружающей производственной среды токсическими парами эфира потребовали разработки методов очистки риккетсии, исключающих его применение (Н.М.Балаева и соавт, 1968; В.А.Яблонская и соавт.,1986; Л.Л.Анискович,1989; В.В.Демкин, И.Б.Рыдкина,1994; E.Weiss et al.,1975; B.A.Hanson et al.,1981). Данные методы при самостоятельном использовании либо не гарантировали полной очистки риккетсии от тканевых компонентов среды культивирования, либо трудоемки в исполнении и поэтому не вышли за рамки экспериментальных исследований.
Таким образом, до настоящего времени проблема очистки риккетсий от компонентов среды культивирования с сохранением антигенной структуры на уровне нативной клетки еще не решена, что делает актуальными изыскания в этой области.
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Целью исследований явилось усовершенствование технологии получения корпускулярного антигена риккетсий Провачека.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
Разработать способ очистки риккетсий Провачека.
-
Получить риккетсий по антигенной структуре максимально приближенные к нативной клетке.
-
Провести серологическое изучение чувствительности и специфичности антигена в РСК, РНАг, МФА в сравнении с коммерческими антигенами.
.4. Дать иммунохимическую характеристику антигену.
5. Оптимизировать технологию применительно к условиям производства.
Решению основных задач предшествовали работы по их методическому обеспечению, которые включали:
- исследование возможности применения метода мембранной фильтрации на стадии очистки антигена риккетсий;
исследование возможности применения фотоэлектроколориметрическогр метода для стандартизации готового препарата;
разработку производственной технологии антигена.
1. Обоснована и разработана методика получения
корпускулярного антигена, основанная на сочетанием
использовании гомогенизаций, дифференциального
центрифугирования и мембранной фильтрации.
Новизна исследований подтверждена патентом №2062110 на "Способ получения диагностикума риккетсиозного Провачека, корпускулярного".
-
Впервые применен электрофотоколориметрический метод определения количества риккетсий, для которого построена калибровочная кривая на основе метода прямого счета с помощью флуоресцирующих Fab-фрагментов антител к риккетсиям Провачека.
-
Экспериментально подтверждено, что корпускулярные антигены, полученные по разработанной технологии, могут быть использованы в РСК, РНАг, МФА и, в отличие от выпускаемых диагностикумов, обеспечивают более достоверные результаты межвидовой дифференциации сывороток к риккетсиям группы сыпного тифа.
-
Способ получения риккетсий Провачека, основанный на сочетанном использовании гомогенизаций, дифференциального центрифугирования, микрофильтрации, а также стандартизации и стабилизации лиофильным высушиванием.
-
Использование корпускулярного антигена риккетсий Провачека как единого для тестирования сывороток крови людей и экспериментальных животных в РСК, РНАг и МФА.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. На основании проведенных исследований получен «Диагностикум риккетсиозный Провачека корпускулярный для РСК, РНАг и МФА».
На препарат составлена и утверждена нормативно-
техническая документация в виде Экспериментально-
производственного регламента №401-92, Временной
Фармакопейной Статьи 42-373 ВС-92 и Инструкции по
применению на "Диагностикум риккетсиозный Провачека
корпускулярный сухой для РСК, РНАг, МФА".
В 1992-1993г.г. при непосредственном участии автора проведено освоение препарата в производстве НПО "Биомед".
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения
диссертационной работы доложены на научно-практической ,
конференции молодых ученых "Теоретические и прикладные исследования в иммунологии" (Пермь, 1990).
В завершенном виде диссертационная работа доложена на Ученом Совете НПО «Биомед» (19 февраля 1997г.) и рекомендована к защите.
ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 31 рисунком и 9 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, двух глав экспериментальной части, общих выводов. Список литературы включает 227 наименований работ отечественных и зарубежных авторов.