Введение к работе
Актуальность темы. Разработка новых биотехнологий для получения
ценных химических веществ, продуктов питания, биотоплива и др.
требует поиска реальных путей увеличения роста и бпосинтетическоГі
активности микроорганизмов. В связи с этим, актуальной является
проблема управления ростом и жіпнргтрятєльнєст;." мпкрииріанизмов
с целью получения пппулянии с определенными заданными
свойствами. Решение её, в значительной мере, связано с
использованием природных и синтетических модификаторов роста,
среди которых достаточно высокой эффективностью отличаются
вещества растительного происхождения или полусинтетические
препараты на их основе (Шигаева и др., 1986). Анализ имеющихся
сведений показывает, что большинство из них обладают свойствами
поверхностно-активных веществ, биологически активны и могут быть
использованы в качестве стимуляторов и ингибиторов роста
микроорганизмов. Так как биологическое действие растительных
препаратов тесно связано с их структурой, для выявления соединений,
высокоэффективных в отношении управления ростом
микроорганизмов, необходимо проведение комплексных
исследований, включающих изучение состава, структуры и механизма действия вещества при определенных параметрах внешней среды.
Практическое использование таких разработок зависит от наличия способов, позволяющих сохранять полученный эффект. По имеющимся данным, наиболее присмлимым путем стабилизации, а в ряде случаев, и активизации метаболической активности клеток микроорганизмов является иммобилизация их включением в гранулы полисахаридных гелей и сорбцией на различных носителях(Кощеенко, Суходольская, 19S7; Mozes, et al, 19S7; Tramper, 1990). Цель и задачи исследования.
Цель данной работы - разработка комплексных подходов управления ростом и метаболической активностью микроорганизмов, использующихся для получения этанола, молочной кислоты и ферментированных напитков.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- Отбор стимуляторов роста микроорганизмов среди новых
химических препаратов растительного происхождения.
- Изучение механизма стимулирующего действия нового препарата-
салииилината сахарозы (СЭС) , включающее выявление его действия
на метаболизм, восстановительную способность и поверхностные
свойства клеток в динамике роста в условиях периодического
культивирования и в "острых" опытах.
- Сравнительное изучение влияния иммобилизации дрожжевых и
.бактериальных клеток включением в матрицу природных и
синтетических гелей и сорбцией на различных носителях на метаболическую активность клеток в условиях работы биореактора периодического и непрерывного действия.
- Повышение сорбционной активности носителей и интенсивности метаболизма иммобилизованных клеток микроорганизмов модифицированием адсорбционных свойств носителей.
- Изучение влияния ростстимулирующего препарата СЭС на
иммобилизованные клетки микроорганизмов.
Разработка способов получения этанола и молочной кислоты иммобилизованными клетками лактозосбраживающих дрожжей и молочнокислых бактерий на основе молочной сыворотки.
- Получение десертных напитков при помощи одновременного и
последовательного сбраживания молочной сыворотки иммобилизован
ными клетками дрожжей и молочнокислых бактерий.
Научная новизна.
Проведен отбор стимуляторов роста среди 37 новых полусинтетических препаратов на основе природных соединений, относящихся к классу природных кислот или их производных.
Установлено, что наиболее эффективным стимулятором роста
является салицилинат сахарозы(СЭС), обладающий свойствами
ненонного ПАВ. !
Для изучения механизма действия препарата впервые проведено определение восстановительной способности и электрофоретической подвижности клеток дрожжей в динамике роста популяции в условиях
стимуляции. Выявлено, что местом приложения действия препарата является клеточная поверхность.
Показано, что дрожжевые клетки, иммобилизованные включением в матрицу природных и синтетических гелей и сорбцией на различных носителях, представляют собой высокоэффективный биокатализатор пролонгированного действия.
Выявлено модифицирующее влияние, микробных ПАВ на сорбционные спойст??. носителей и клеток.
Установлено, чю комплексный подход, включающий иммобилизацию микробных клеток, оптимизацию условий культивирования и использование модификаторов роста позволяет значительно увеличить эффективность бродильных процессов и выход конечных продуктов метаболизма. Практическая значимость.
Для определения механизма действия химических соединений, используемых в качестве стимуляторов н ингибиторов, рекомендуется изучение восстановительной способности и электрофоретической подвижности клеток микроорганизмов - параметров отражающих свойства клеточной поверхности.
Иммобилизация клеток дрожжей и молочнокислых бактерий включением в матрицу полисахаридных гелей и сорбцией на натипных и модифицированных носителях повышает пх бродильную активность и создает основу дчя получения новых типов биокатализаторов.
Способы получения молочной кислоты и этанола ферментацией
молочной сыворотки свободными и иммобилизованными клетками
высокоактивных штаммов молочнокислых бактерий и
лактозосбраживающих дрожжей рекомендуются для производств, в которых в качестве побочного продукта образуется молочная сыворотка.
Для сбраживания молочной сыворотки с целью получения напитков массового потребления и специализированного назначения рекомендуется использовать моно- и смешанные культуры дрожжей и молочнокислых бактерий в иммобилизованном состоянии.
Положения, выносимые на зашиту:
1. Неспецифические стимуляторы и ингибиторы, местом приложения
которых является лаг-фаза, вызывают изменение свойств
поверхностных структур чувствительных клеток.
2. Иммобилизация клеток микроорганизмов повышает и
стабилизирует их метаболическую активность.
3. Включение клеток микроорганизмов в гранулы природных гелей не
препятствуют действию на них стимуляторов и ингибиторов роста.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на
111 всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), на 4 и 5-ой
конференциях биохимиков Средней Азии и Казахстана(Ашхабад, 1986;
Ташкент, 1991); 4-х всесоюзных конференциях ( "Биофизика
микробных популяций", Красноярск, 1987; "Микробиологические
процессы при промышленной переработке сельскохозяйственного
сырья", Пущино, 1990; "Биотехнология и биофизика микробных
популяций", Алматы, 1991; "Поверхностные силы", 1992), ежегодных
научных конференциях КазГУ им.Аль-Фараби.
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 31 печатных работах. Получены положительные решения Патентного Ведомства РК на выдачу патентов по четырем заявкам. Структура и объем диссертационной работы. Работа изложена на 275 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, 7 глав, содержащих результаты экспериментов, заключения, выводов, списка цитированной литературы (335 источников) и приложения.
В работе использовались следующие культуры:
Дрожжи Torulopsis kefyr var. kumis шт. 17 из коллекции кафедры
микробиологии КазГУ им. Аль-Фараби. Культура выделена из кумыса
(М.Х.Шигаева, М.Ш.Оспанова, 1983).
Производственные штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae:
гибрид 512 и Р 12, полученные из Госагропрома РК.
Молочнокислые бактерии: Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus 221, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis 21 и Lactococcus lactis 40 из коллекции кафедры микробиологии КазГУ им. Аль-Фараби.
Дрожжевые культуры поддерживали на скошенном сусло-агаре. Для экспериментов биомассу получали выращиванием клеток дрожжей в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл сусла (8 Б). при nH fi-7 ic.'.iiicpaTvpe 23 - 3G"C в течение 24 - 4S часпч. Молочнокисл!,:е бактерии хранили в пробирках, содержащих 10 мл гидролнзованного молока. Для получения накопительной культуры молочнокислые бактерии переносили из пробирок в колбы объёмом 750 мл, содержащих 200 мл молочной сыворотки и культивировали их при температурах 28 С (лактококки) и 37С(лактобациллы) в течение 24 часов.
В качестве питательных сред использовали солодовое сусло, полученное на пивзаводе г. Алматы, и творожную молочную сыворотку , полученную в детской кухне Советского района или на молочном комбинате г. Алматы. По физико-химическим показателям используемая в работе сыворотка соответствует требованиям ГОСТа (отраслевой стандарт - СТ 4992 - 75 "сыворотка молочная"). Стерилизацию сред проводили при 0,5 атм. в течение 30 минут.
Ростстимулируюшее действие 37 новых полусин готических препаратов на основе растительных соединений, полученных в лаборатории "Химии растений" ИХІІ ПАН РК и отнесенных к классам органических кислот, терпенов и стероидов, изучали на кул,.гурах Е. coli WP2 и St. aureus-209, типичных представителях грамотрицательных и грамположнтельных бактерий. Выявленные стимуляторы испытывались на производственном штамме S. cerevisiae гибрид 512. Микроорганизмы выращивали на полноценных питательных средах (МПА, МПБ, неохмеленнос солодовое сусло, сусло-агар).
Для иммобилизации микроорганизмов использовали методы включения клеток в синтетические и природные полимеры и сорбции на различных носителях.
Иммобилизацию микробных клеток в полиакриламидный гель (ПААГ) проводили по методу К.А.Кошеенко, Г.В.Суходольской (1988), в альгинатный гель - по методу D.Toth, et al (1989), в каррагинановый гель - по методу П.Марека (1988).
Для вычисления клеточной нагрузки на носителе определенное количество гранул растирали в ступке и суспендировали в 10 мл стерильной дистиллированной воды. Из этой .смеси готовили несколько разведений (10-5 - 10-8) „ по о,1 мл высевали на чашки Петри с твердой средой (сусло-агар). Через 24 - 48 часов роста при оптимальных
для каждой культуры температурах производили подсчет выросших колоний (Кощеенко, Скрябин, 1984).
Для определения "показателя жизнеспособности" (ПЖ) иммобилизованных клеток использовали метод микрокультурального анализа (Пуста, Фихте, J 990). Для количественной оценки включения клеток в различные гели использовали метод определения количества белка в гранулах модифицированным методом Фримана ( Хансон, Филлипс, 1984). Изучение действия акриламида на дрожжевые клетки проводили методом Луста К.А. и Старостиной Н.Г. (1985).
Для иммобилизации клеток микроорганизмов методом сорбции использовали следующие носители: пенополиуретан (ПГТУ, ГОСТ 1473-71), полимерные волокна диаметром 1 мм и "вии" ( структура из синтетических нитей в форме ресниц, использующаяся в качестве сорбента в очистных системах).
В случае иммобилизации дрожжевых клеток адсорбцией или включением в матрицу различных гелей количество иммобилизованных клеток вычисляли по разнице в концентрации клеток в исходной суспензии и в смывах после промывания носителя (подсчет клеток проводили в камере Горяева или высевом суспензии на твердые среды и последующим подсчетом выросших колоний).
Сорбционную способность носителей і и клеток определяли методом Г.Н.Никовской, А.С. Гордиенко, Л.Н.Глоба (1986) в "острых" опытах. Для этого сорбцию микробных клеток на различных носителях проводили в 500 мл физиологического раствора в течение 24
часов встряхиванием микробной суспензии в концентрации ),0 х 10'-4,0 х10^ клеток в 1 мл с определенным количеством носителя. Для определения времени завершения сорбции и установления сорбционного равновесия определяли оптическую плотность образцов, отобранных через равные промежутки времени (ФЭК-М, светофильтр N6, кювета - 10 мм). Концентрацию клеток рассчитывали по калибровочной кривой.
Удельную сорбцию микроергашимов вычисляли по уравнению: а = (Со - Ср ) х 1000/т (кл/г) или а = (Со - Ср ) х 1000/mS (кл/мм2), где: Со и Ср - исходная и равновесная концентрация клеток, найденные по калибровочной кривой (кл/мл), m - концентрация носителя (г/мл), S - удельная поверхность носителя ( мм2/г)
Десорбцию изучали перенесением носителя с сорбированными клетками микроорганизмов в 500 мл стерильного физиологического раствора, последующим встряхиванием и измерением оптической плотности образцов этой суспензии через определенные промежутки времени в течение 1 часа.
Степень десорбции микроорганизмов расчитывали по уравнению:
д = Сд х 100/ (Со - Ср ) (%), где Сд - количество (концентрация) десорбпрованных клеток.
Для оценки метаболической активности свободных и иммобилизованных клеток микроорганизмов определяли:
концентрацию редуцирующих веществ в кульгуральноіі среде - орто-золуиднновым методом (ЧССР, биотест, Брегмеїіер, 1970) и методом Бертрана (Филиппович и др., 1982).
концентрацию белков в культуральной среде - биуретовым методом, методом Лоури и модифицированным методом Фримана (Филиппович и др., I9S2; Хансон, Филипс, 1.9S4).
интенсивность дыхания - полярографнчески с помощью электрода Кларка (Виноградова и др., I9S9),
кислотность культуральной среды - по методу Тернера,
- концентрацию этанола в культуральной среде - методом Мартена
(Егоров, 1976) и газохроматографически (Смайберт, Криг, 1984),
- концентрацию молочной кислоты в культуральной среде -
колориметрически ( Атраментова и др., 1977) и
газохроматографически (Смайберт, Криг, 1984),
- выделение и частичную очистку молочной кислоты проводили по
методу Lockwood L.B. (1979).
Изучение ростстимулирующего действия препаратов проводили методом серийных разведений (Перший, 1971; Силин, 1985). Стимулирующий эффект оценивали нефелометрическим методом после культивирования дрожжей 48 часов при 28 - 30"С. Количество жизнеспособных клеток определяли методом высева на чашки Петри с агаризованной средой(Егоров, 1976).
Класс ПАВ определяли методом А.А. Абрамзона и др.(1988).
Для выявления действия стимулятора и ингибитора роста на микробные клетки определяли следующие параметры:
величину окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) среды регистрировали потенциометрическим методом с использованием измерительного платинового (ЭПВ-1) и вспомогательного хлорсеребряного (ЭВЛ-1МЗ) электродов. Милливольтметром служил рН-метр-340, на котором одновременно регистрировали величину рН с использованием стеклянного электрода (ЭСЛ-63).
восстановительную способность клеток оценивали по скорости восстановления феррицианнда калия - искусственного акцептора электронов, который не проникает в клетки, которую измеряли с помощью редокс-стата (Балмуханов и др., 1981).
электрофоретнческую подвижность клеток измеряли методом микроэлектрофореза в постоянном электрическом поле (Духин, Дерягин, 1976).
- Mg/АТФазную активность осадочной и надосадочной фракции,
полученной при центрифугировании гомогената, полученного при
озвучивании дрожжевой суспензии при помощи ультразвукового
дезинтегратора ИД-11, при 15000об/мин. в течение 20 минут оценивали
по количеству неорганического фосфора, образовавшегося в результате ферментативного гидролиза АТФ (Иващенко, 1978).
Полученные результаты подвергались статистической обработке (Урбах, 1975; Плохинский, I97S).