Ультраструктурная пластичность цианобактерий Баулина Ольга Ивановна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Объекты и методы исследований ; 15

1.1. Объекты 15

1.2. Методы. 21

Список условных обозначении на рисунках (собственных схемах). 32

ГЛАВА 2: Ультраструктурная пластичность цианобактерии в условиях темноты и яркого света. 33

2.1 . Научные предпосылки. Структурно-функциональные особенности-цианобактерий как прокариотных фототрофов с оксигенным: фотосинтезом ; 33

2.2. Действие темноты и яркого света на ультраструктуруцианобактерий: 37

2.2.1. Ультраструктура Anabaena variabilis САШ 458 в темноте, и при перенесении на свет 37

2.2.2..Ультраструктура Anabaena variabilis CALU 458; Synechococcw sp. PCC 6301 и Chlorogloeopsis fritschii при выращивании на ярком свету. 48

2.2.3. Фотодеструкция цианобактерий in vitro 56

2.2.4. Ультраструктура Chlorogloeopsis fritschii при выращивании в темноте..66

ГЛАВА 3. Ультраструктурная пластичность цианобактерий при ферментативной индукции l-трансформации : 73

3.1. Научные предпосылки. Бактериал ьная L-трансформация; 73

3.2. Ультраструктура цианобактерий при воздействии лизоцимом . 76

3.3^ Ультраструктура клеточных форм в L-иодобных колониях" цианобактерий; 80?

ГЛАВА 4: Ультраструктурная пластичность цианобактерий в модельных ассоциациях с растительными партнёрами . 86

4.1. Научные предпосылки. О модельных ассоциациях цианобактерий с растительными партнёрами. 86

4,2, Ультраструктура цианобактерии в модельных ассоциациях; 88

4.2Л'. Synechocvccus sp. PCC 6301 в ассоциациях с клетками табака и диоскореи. 89

4.2.2. Anabaena variabilis CALU 458 в ассоциациях, полученных с:использованием протопластов табака . 95

4.2.3. ЛпаЬаепа variabilis АТСС 29413 в ассоциациях к каллусными тканями и растениями-регенерантами табака и люцерны 104

4.2.4. Nostoc muscorum ВКМ 16 в ассоциациях с каллусом и укоренёнными черенками люцерны 111

4.2.5. Chlorogloeopsis fritschii в ассоциациях с клетками женьшеня 115

ГЛАВА 5. Проницаемость слизистых поверхностных структур цианобактерии для макромолекул 122

5.1. Слизистые поверхностные структуры цианобактерий и методология исследования их проницаемости для макромолекул. Обзор литературы 122

5.1,1, Методы для исследования свободной диффузии молекул органических веществ через клеточные стенки растений и поверхностные структуры микроорганизмов 128

5.2. Определение проницаемости слизистых поверхностных структур интактных клеток цианобактерий 133

ГЛАВА 6. Ультраструктурная пластичность цианобактерий в природных симбиозах с растениями 144

6.1. Состояние вопроса 144

6.2. Ультраструктура цианобактерий в симбиозе с мхом-печёночником Blasia pusilla 146

6.3. Ультраструктура вегетативных клеток цианобактерий в симбиозе с саговниками 150

6.4. Ультраструктура гетероцист цианобактерий в симбиозе с саговниками 165

Общее заключение 173

Выводы 183

Список Цитированной Литературы 185

• Научные предпосылки. Структурно-функциональные особенности-цианобактерий как прокариотных фототрофов с оксигенным: фотосинтезом
• Ультраструктура цианобактерий при воздействии лизоцимом
• Anabaena variabilis CALU 458 в ассоциациях, полученных с:использованием протопластов табака
• Определение проницаемости слизистых поверхностных структур интактных клеток цианобактерий

Введение к работе

Изучение ультраструктуры клеток является адекватным способом харакгеристики.микроорганизмов, что важно для понимания их функционирования; и'определения;объектов разных таксономических рангов. Вопросы;о структурно-функциональной: организации прокариотных, преимущественно одноклеточных организмов- разных, видов, являются* предметом и спецификой цитологии микроорганизмов г- одной: из основных научных и учебных дисциплин общей микробиологии.. В - настоящее время- является; очевидным, что при работе в; этой области необходимо учитывать эволюплонно сложившиеся особенности жизнедеятельности бактерий, способствующие- увеличению разнообразия, морфо-физиолошческих форм:в рамках,вида, . к/наиболее экстраординарным ^из которых можно отнести ультрамикроформы или; наннобактерии:(Мишустина идр,, 1987; Вайшптейн, Кудряшова, 2000), формы в «некультивируемом состоянии» (Colwell et а!:, 1985; McDougald; et al., 1998; Головлёв, 1998^; а), мумифицированные клетки; (Сузина и др., 2001), необычные гигантские формы цианобактерий' (Горелова, Корженевская, 2002). Разнообразие: клеточных форм может усложнять идентификацию видов ш situ,.например, сапрофитных (Palinska, Krumbein, 1994) и симбиотических (Paulsrudi Lindblad,_1998) цианобактерий.

Особенностями прокариотных: клеток, в отличие от, большинства тукариотных. является менее совершенная система гомеостазам и= способность быстро пересіраиваться (метаболически: и структурно) в изменившихся, условиях местообитания; К концу- 80-х годов: были, накоплены: многочисленные экспериментачьные данные об изменениях макромолекулярнойі и ультраструкіурной организации клеточной оболочки и других поверхностных структур патогенных бактерий, способствующих их выживаемости В: процессе инфицирования животных и растений. Согласно представлениям,. сформировавшимся на основе анализа этих данных, подобные перестройки⁵ происходят благодаря присущей¹ прокариотным клеткам фенотипической: пластичности, представляющей; собой совокупность гибких систем быстрого адаптивного реагирования, важное место среди которых занимает регулируемая; экспрессия генов (Brown, Williams, 1985;: Costerton, 1988). В последние годы

широко исследуются молскулярпо-генетические механизмы ответа бактерий на воздействие самых разнообразных физических и химических факторов (сигналов) (Abstrs. Confs. "Bacterial neural networks ", 2002, 2004). Параллельно с этим, большое внимание уделяется эволюционным и экологическим аспектам биоразпообразия прокариот (Schloter et al. 2000; Заварзин, 2002). Установлено, что для бактерий характерна обратимая рекомбиногенная изменчивость генома, возникающая, как правило, спонтанно и не синхронно в разных клетках популяции с высокой частотой, и имеющая адаптационное значение наряду с регуляцией на эпигенетическом уровне {Прозоров, 2001). Следствием такой изменчивости является возникновение клеток с различными фенотипнческими признаками, набор которых, в основном, аналогичен выявленному ранее при изучении фепотипической пластичности поверхностных структур патогенных бактерий (например, антигенные вариации, продукция экстрацеллюлярньгх полисахаридов, пилей и др.). Исходя из этого, можно сделать вывод, что в современной интерпретации фенотипическая пластичность бактерий отражает работу различных регуляторных процессов как на уровне адаптивных внутригеномньтх перестроек, так и на эпигенетическом уровне. Сочетание этих процессов было обнаружено, например, при изучении реіуляции экспрессии поверхностных белковых S-слоёв бактериальных клеток (Fernandez, Berenguer. 2000).

Понятие «фенотипическая пластичность» формировалось при широком использовании различных методов электронной микроскопии, что является одной из причин преемственности нами этого термина. Данные литературы свидетельствуют о том, что фенотипическая пластичность проявляется на разных уровнях клеточной организации: метаболическом (включая химическую модификацию или альтернативный синтез макромолекул), ультраструктурном и морфологическом, что отражает специфику действующих на каждом уровне комплексов адаптационных процессов. В соответствии с этим, метаболическую, ультраструктурную и морфологическую пластичность бактериальной клетки, изучаемые разрозненно, правомерно и целесообразно рассматривать как взаимосвязанные составляющие части фенотип ической пластичности. Общеизвестно о значении метаболической пластичности в жизнедеятельности микроорганизмов. Классическим примером, в данном случае, является адаптация

Escherichia coli к лактозе, как к новому пищевому субстрату, относимая к разряду адаптивных модификации (Инге-Вечтомов, 1989). В последние годы много внимания уделяется внутривидовой морфологической пластичности клеток, так как она может существенно затруднять идентификацию бактерий in situ. Ультраструктурная пластичность, являющаяся, с одной стороны, проявлением метаболической пластичности, а, с другой стороны, обуславливающая изменение морфологии клетки, исследована крайне мало. Вместе с тем, выделение этого понятия на фоне множества употребляющихся в настоящее время терминов необходимо и актуально для более четкого обоснования задач, связанных с изучением структурных аспектов физиологии бактерий на базе современных знаний о молекулярно-генетических основах адаптации этих организмов. Мы считаем, что рассмотрение ультраструїпурпой пластичности в качестве индіїкагора действия механизмов фенотипической пластичности, степень расшифровки которых будет соответствовать уровню знаний на период исследований, является новой стратегией для выявления и изучения адаптационных возможностей и внутривидового структурного разнообразия прокариот.

Решение этих вопросов невозможно без учета такой важной особенности микроорганизмов как гетерогенность развивающихся популяций по ряду морфологических и физиолого-биохимических свойств клеток. Биологическое значение клеточной гетерогенности заключается в повышении устойчивости, гибкости и приспособленности бактериальной популяции при измеугении условий (Печуркин и др., 1990). Известно, что пластичность популяции микроорганизмов, ее способность адаптироваться к новым экологическим ситуациям, всегда выше, чем индивидуальная пластичность особей (Иванов, Угадчиков, 1984) именно вследствие клеточной гетерогенности. По Головле'ву (Головлёв, 1998 б) динамическая гетерогенность популяций обеспечивается «метастабильностыо фенотипа», которая генерировалась бактериями, не только патогенными, но и сапрофитными, в ходе тшолюции как способ адаптации и стабилизации вида в нестабильной среде, и проявляется на популяционном уровне в таких процессах, как. например, фазовые и антигенные вариации.

Все вышеизложенное позволяет- заключить, что изучение ультраструктурной пластичности клеток в составе гетерогенных бактериальных популяций, как

индикатора причин и возможных механизмов морфологических и функциональных перестроек клеток и популяций, адекватных изменившимся условиям обитания, можно выделить в качестве самостоятельной проблемы. Её актуальность обусловлена необходимостью расширение наших знаний, об адаптационных, возможностях видов, составляющих: сообщества микроорганизмов; деятельность которых определяет общее состояние микробной биосферы.

Среди прокариот большой интерес для исследований⁵ в плане решения этой проблемы< представляют собой цианобактерии — одна из наиболее древних: групп фототрофных микроорганизмов с уникальной физиологией; и пластичным метабол из мом, морфологическое разнообразие которых сопоставимо с таковым всех остальных, вместе взятых бактерий. Вместе; с тем, по сложности морфологической организации многие цианобактерии не.имеют конкурентов среди грамотринательных бактерий (Громов; 1986)..

Представители разных таксономических; групп цианобактерии существенно различаются по особенностям, метаболизма, способности к клеточной дифференциации и другим физиологическим свойствам; что, очевидно, является следствием их высокого приспособительного потенциала в разнообразных условиях внешней- среды на. ранних этапах эволюции.. Новые биологические: свойства..которые возникали у древних цианобактерии:(эволюционные «пробы»), сыграли; очевидно, важную роль в эволюционных процессах. Так, возникновение у этих прокариот оксигенного фотосинтеза= соответствует переломному моменту В: истории' эволюции* - переходу от бескислородных условий^ к. атмосфере: с. кислородом^ (Гусев, 1966, 1968; Гусев, Никитина," 1979). Высокое содержание кислорода в составе современной¹ атмосферы обусловлено деятельностью- именно: этой * группы; микроорганизмов; в; протерозое. Вместе с. тем, цианобактерии играют определяющую роль в становлении; и развитии: биосферы в качестве первичных продуцентов органических веществ в сообществах микроорганизмов (Заварзин, 2004).

Понимание, эволюции биосферы: связано с непосредственным изучением; палеонтологических образцов, таких как ископаемые: микробные сообщества; -микрофоссилии. в том; числе, и методом ультраструктурного анализа (Gorlenko et al., 2000; Герасименко, Ушатинская, 2002 а). В данном случае существенное

значение для идентификации в них остатков определённых групп древних микроорганизмов имеют характерные особенности строения^- цианобактерий, сохранившиеся у современных видов. В то же время, в исследованиях такого рода, очевидно, следует также учитывать присущее цианобактериям структурное разнообразие и пластичность.

Местами, обитания современных цианобактерий: являются вода, почва, каменистые породы. Они заселяют пустыни, льды, термальные источники. Эти микроорганизмы входят в состав автономных структурированных циано-бактериальных сообществ - биоплёнок или матов, развивающихся в разнообразных, часто экстремальных условиях, например, в гиперсолёных водоёмах и термальных источниках (Звягинцева; и др, 1995; Герасименко, Ушатинская, 2002 б; Заварзин, 2004). Многие цианобактерий участвуют в формировании симбиозов с эукариотами в природе (Schenk, 1992) и модельных ассоциаций с растительными партнёрами в экспериментальных условиях (Gusev et al., 2002). Очевидно, способность заселять столь разнообразные экологические ниши является следствием эффективной адаптации цианобактерий в широком диапазоне физико-химических параметров среды (Базанова, Пиневич, 2000).

Особое значение для оценки глобальной роли адаптационных возможностей цианобактерий имеет общепринятое в настоящее время представление о том, что они являются эволюционными предшественниками хлоропластов (Giovartnoni et al., 1988; Расе, 1997).

Широкое распространение цианобактерий в природе и их высокая устойчивость к. воздействию неблагопрятных факторов среды обитания давно привлекали внимание исследователей. Изучение ультраструктурной организации клеток этих организмов в различных условиях роста развивается с 60-х годов, но к началу нашей работы (1970 г.) имелось лишь небольшое число публикаций. Проводимые в 80-90-х годах исследования других авторов, важные с позиции выделенной нами проблемы, касались физиологических аспектов адаптации цианобактерий на уровне популяций (Гапочка. 1981), морфологической неоднородности последних (Кондратьева. 1989) и морфофункциональноЙ лабильности мембранного аппарата этих микроорганизмов (Пиневич, 1991). Нами проведено сравнительное изучение ультраструктурной пластичности

субклеточного, клеточного и поиуляционного уровней существенно различающихся по метаболическим и морфологическим свойствам видов цианобактерий в разных условиях роста и экспериментального воздействия.

Цель и задачи исследований.

Целью работы явилось, изучение ультраструктурной пластичности представителей разных таксономических групп цианобактерий, отличающихся особенностями метаболизма, способностью к клеточной дифференциации и рядом других физиологических свойств, как индикатора действия^ вероятных адаптационных механизмов на субклеточном, клеточном и иопуляциошшм уровнях.

Основные задачи:

1. Изучение ультраструктурной пластичности представителей: различных
таксономических групп цианобактерий в динамике развития популяций і при и х
культивировании в условиях:

а) темноты и яркого света;

б) ферментативной индукции L-трансформации;

в) ассоциированного роста с растительными клетками, тканями; растениями-
регенерантами и целыми растениями in vitro.

2. Изучение ультраструктурной пластичности симбиотических цианобактерий. при постинфекционном развитии внутритканевых популяций в составе природных растительных симбиозов.

3. Изучение пористости слизистых, поверхностных структур цианобактерий; методом определения границ проницаемости для нейтральных гидрофильных: макромолекул с помощью фракционирования полидисперсных декстранов.

4. Выяснение возможности индикации действия вероятных адаптационных механизмов цианобактерий на субклеточном, клеточном и популяционном уровнях в изменившихся условиях местообитания путём анализа форм проявления ультраструктурной пластичности.

Научная новизна работы. Разработано новое направление цитологии микроорганизмов - изучение ультраструктурной пластичности цианобактерий как

комплексное исследование на субклеточном, клеточном и популяционном уровнях. Ультраструктурная -пластичность ирокариотной клетки рассматривается в качестве составляющей фенотипической пластичности как совокупности реакций адаптационной перестройки клетки, адекватной изменению внешних условий. С этих позиций характеристика ультраструктурной пластичности является новой стратегией для выявления и исследования адаптационных возможностей и внутривидовой морфологической изменчивости прокариот.

В результате изучения представителей разных таксономических групп цианобактерии в экспериментальных и природных условиях, вызывающих изменения способа существования этих организмов, впервые выявлены разнообразные формы проявления ультраструктурной пластичности субклеточных структур и клеток, указывающие на действие различных адаптационных механизмов в конкретных условиях. Обнаружен феномен обратимого набухания тплакоидов, вызванного длительным пребыванием в темноте облигатно фототрофной цианобактерии и способствующего сохранению жизнеспособности клеток в этих условиях. В экспериментах по изучению обратимости набухания тплакоидов при перенесении культуры из темноты на свет оптимальной для данного вида интенсивности, впервые описано ультраструктурное проявление фотоокислительной деструкции тилакоидных мембран, что приводит к образованию не лизирующихся в течение всего периода наблюдения (4 мес.) бесцветных клеток, В популяциях, преимущественно состоящих из таких форм, обнаружены жизнеспособные цианобактерии.

Впервые высказано положение о способности цианобактерии к L-трансформации. Для некоторых видов установлена возможность существоватгая в форме сферопластов и протопластов, то есть действия механизма L-трансформации при развитии популяций в различных условиях обитания, как в виде чистых культур, так и при взаимодействии с растительными партнёрами в модельных ассоциациях и природных симбиозах, а также после изолирования цианобактерии из последних.

Во внутритканевых популяциях цианобионтов саговников впервые выявлены формы с редуцированной клеточной стенкой вегетативных клеток (ФРКС) и гетероїшст (ГРКС), специализирующиеся на гиперпродукции слизистых

полисахаридов межклеточного матрикса, предположительно имеющего протекторную функцию в условиях повышенного синтеза бактерицидных фенол ьн мх соединений растительными клетками. Получены данные, свидетельствующие о том, что в этих клеточных формах, возможно, происходит внуїри клеточный синтез кислых полисахаридов, что не было обнаружено ранее у бактерий. Эти результаты указывают на существование принципиально иных, но сравнению с уже известными, механизмов синтеза кислых полисахаридов в прокариотной клетке. Изучение ультраструктурной пластичности цианобионтов саговников позволило впервые высказать предположение о том, что в симбиотических популяциях цианобактерий может осуществляться кооперативное взаимодействие клеток, а формирование ФРКС и ГРКС является адаптационным механизмом, действие которого проявляется на попудяционном уровне.

Впервые проведено изучение пористости слизистых поверхностных структур цианобактерий 7 видов методом определения границ проницаемости с помощью фракционирования полидисперсных декстранов в связи с проблемой межклеточного транспорта макромолекул, в том числе, сигнальных в свободноживущих и симбиотических популяциях этих микроорганизмов. Показана возможность свободной диффузии нейтральных гидрофильных макромолекул разных размеров в чехлы и капсулы цианобактерий.

Установлено соответствие характера и разнообразия форм проявлен;;;:' ультраструктурной пластичности цианобактерий с физиологическими особенностями, в том числе, метаболическим потенциалом видов, со способностью к формированию устойчивых модельных ассоциаций с растительными партнёрами и, как правило, природных щіанобактериально-растительньїх симбиозов.

На основании полученных результатов и анализа данных литературы разработана концепция, заключающаяся в том, что ультраструктурную пластичность бактерий, отражающую метаболические перестройки клетки, следует рассматривать как индикатор действия вероятных адаптационных механизмов на субклеточном, клеточном и популяциошюм уровнях в ответ на изменения внешних условий, а также участия в этом процессе внутрипопуляционных межклеточных взаимодействий. Весь комплекс проведенных исследований позволяет сформулировать новое поняіие - «популяцио иная цитология прокариот»,

являющееся основой для формирования нового раздела цитологии микроорганизмов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Цианобактериям, как и другим, прокариотам, свойственна ультраструктурная' пластичность на субклеточном;, клеточном' и популяционном уровнях, выражающаяся; В: изменении структурных элементов- системы по размерам, конфигурации и другим параметрам архитектоники, а также в наличии, отсутствии или.разнообразии; конструктивных элементов в пределах сохранения структурно— функциональной целостности системы.

2. Ультраструктурная пластичность бактерий является составляющей частью феноти[шческой пластичности как комплекса реакций адаптационной перестройки клеток,, адекватной⁷ изменениям: внешних условий; Эта система; взглядов^ представляє! собой- новую- стратегию для выявления и: исследования? адаптационных, возможностей и внутривидовой морфологической' изменчивости прокариот.

3. Характер и разнообразие форм проявления: ультраструктурной пластичности цианобактерий в разных условиях существования соответствуют физиологическим особенностями; в том,числе, метаболической пластичности вида.

4. Ультраструктурную пластичность бактерий,, отражающую; метаболические:
перестройки: клетки, следует, рассматривать: как индикатор: действия вероятных
адаптационных механизмов^ на субклеточном, клеточном и популяционном;
уровнях в:ответ: на изменения внешних условий; а также участия в этом: процессе
внутрипопуляционных межклегочных взаимодействий:

Научно-практическая значимость работы..

Полученные экспериментальные данные и развитая^ автором концепция: расширяют представления о структурных основах адаптации: цианобактерий; к изменяющимся условиям внешней среды и в целом; - о биологии^; прокариотной: клетки. Результаты работы^: способствуют' пониманию роли фенотипической пластичности прокариот, проявляющейся на уровне популяции в виде различных, в: некоторых, случаях необычных, клеточных «морфотипов», что имеет важное экологическое значение с. точки зрения проблемы, выживаемости вида; в

изменившихся условиях, в том числе, при постоянно возрастающем антропогенном воздействии.

Практическая ценность работы определяется, прежде всего, выбором в качестве объектов изучения цианобактерий. Интерес к этим.микроорганизмам как к продуцентам разнообразных биополимеров и биологически активных веществ, в; том числе, сильно действующих токсинов, существенно возрос в последние годы. Результаты; проведенных нами исследований валены: 1) для поиска новых путей повышения продуктивности цианобактерий, секретируюших белки, с учётом, возможности использования культур стабильных L-форм; 2) для тестирования изменения физиологического состояния популяции в условиях масштабного промышленного культивирования; 3) для выявления причин, массового развития цианобактерий в водоёмах с неблагоприятными экологическими последствиями. Наряду с этим, как теоретическое, так и практическое значение изучения ультраструктурной: пластичности цианобактерий; связано с развитием приоритетного направления исследований, проводимых на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ, по получению модельных ассоциаций экономически, ценных несимбиотрофных видов- растений с азотфиксиругошими цианобактериями,

Экспериментальные результаты и теоретические выводы используются в лекционных курсах по цитологии микроорганизмов (кафедры физиологии микроорганизмов и микробиологии) и клеточной физиологии (кафедра физиологии микроорганизмов), на практикуме по цитологии микроорганизмов (кафедра физиологии микроорганизмов) на Биологическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова, а также в лекциях но экологии почвенных водорослей на кафедре биологии почв факультета Почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова и по структурно-функциональной адаптации микроорганизмов в Пущинском госуниверситете. Материалы диссертации включены в учебник «Биология почв» (Звягинцев Д.Г., Вабьева И.П., Зенова Г.М., Изд-во МГУ, 2004, Серия: классический университетский учебник).

Научные предпосылки. Структурно-функциональные особенности-цианобактерий как прокариотных фототрофов с оксигенным: фотосинтезом

Главным и объединяющим свойством всех представителей цианобактерий является их способность осуществлять оксигенный фотосинтез. Согласно современным представлениям, фила Cyanobacteri а обособилась около 3,5 млрд. лет назад и является одной из наиболее архаичных ветвей эволюционного древа Bacteria (Schopf et al., 2002; Пиневич, Аверина, 2002). Само становление молекулярного механизма фотосинтеза, возможно, происходило ещё на стадии «прогенота», а наличие фотосинтетического аппарата является одной из важнейших фенотипических черт архаичных бактерий (Пиневич, Аверина, 2002). В процессе столь д:штельной эволюции параллельно с развитием структурно-функциональных особенностей фотосинтетического аппарата, происходило, очевидно, и формирование целого ряда приспособлений, способствующих адаптации к изменению условий освещения и действующих на. молекул яр но-генетическом уровне (Golden. 1995). Современные цианобактерий, большинство из которых является облигатньгми фотоірофами, приспособлены к росту как в условиях затемнения (сумеречные пещеры, почва), так: и на ярком свету (пустыни, льды). Среди цианобактерий имеются облигатпые и факультативные фотоавтотрофы, а также немногие виды, способные полностью переключаться на хемогетеротрофньгїі способ существования (Гусев, Никитина, 1979). Хорошо изученными в этом: плане являются традиционно используемые нами и другими исследователями облигатно фототрофные Synechococcus sp. РСС 6301 и A. variabilis CALU 458, а также факультативно фототрофные A. variabilis АТСС 29413 и С. fritschiL У облигатно фототрофпых цианобактерий отіфьіта способность к выживанию в темноте от нескольких недель до более чем одного месяца (Holm-Hansen, 1968; Корженевская, Гусев, 1973; Гусев, Никитина, 1974). Переживать периоды затемнения цианобактериям позволяет способность к дыханию. Энергетические процессы цианобактсрий - фотосинтез и дыхание, попеременно осуществляемые на свету и в темноте, дифференцированно связаны с мембранной системой, включающей.- цитоилазматическую мембрану (ЦПМ) и тилакоиды. Многочисленные сведения о структурно-функциональных особенностях мембранной системы цианобактерий обобщены в фундамента!ьных теоретических обзорных статьях и монографиях {Golecki, Drews, 1982; Stevens, Nierzwicki-Bauer, 1990; Gantt, 1994). Важное место среди них занимают работы научно-исследовательской- школы- Санкт-Петербургского государственного университета (Громов, 1976; Пиневич, 1979; 1986; 1991;: 1992; Pinevich, 1997; Пнневич, Аверина, 2002), в которых особое внимание уделено вопросам динамичности и адаптации мембранной системы.

По современным представлениям; фотосинтетический. аппарат цианобактерий, за исключением Gloeobacter violaceus, у которого фотосистемы инкорпорированы в ЦПМ, связан с тилакоидами. Последние представляют собой ламеллы (атастины), сформированные сдвоенными мембранами; Противоположно лежащие участки мембраны одного тил акоида, которые на ультратонких, срезах выглядят как. две параллельные мембраны, могут соприкасаться своими внутренними; поверхностями (внутренняя адгезия), или отстоять, друг от друга на более или менее значительном/ расстоянии с образованием: внугритилакоидного пространства. Между собой отдельные тилакоиды. как правило, не соприкасаются. Это обусловлено,.во-первых, тем, что они не содержат, как гранальные тилакоиды хл оропл астов эу кариот, фактора внешней адгезии - хлорофилл а/о-связы вающего белка светособирающего комплекса II. Во-вторых, - нагих внешней поверхности расположены фикобилисомы - основные светособирающие антенны, цианобактерий, содержащие фикобилиновые пигменты и передающие световую энергию возбуждения5 (hv2) преимущественно на фотосистему II (ФС1І) (рис. 2). Фикобилисомы, у большинства цианобактерий ультраструктурно:представляющие собой частицы полусферической формы, располагаются на поверхности тилакоидов упорядоченными тесными рядами. Принципиальных видовых отличий в организации внутрицитоплазматической мембранной; системы у цианобакгерий: пока: не обнаружено. Пространственная организация; тилакоидов, которые, как указывают элекгронно-микроскопические данные, связаны \ между собой, у одноклеточных цианобактерий более консервативна (периферические параллельные ламеллы) по сравнению с таковой у нитчатых и имеющих сложные жизненные циклы видов (преимущественно неупорядоченные расположенные ламеллы). Вопрос о наличии и организации структурно-пространствен ной связи функционально родственных ЦПМ и мембран, формирующих тилакоиды у цианобактерий, является дискуссионным (Пиневич, Топчиева, 1991).

Функционально тилакоиды цианобактерий прежде всего представляет собой энергетические органеллы, способные альтернативно осуществлять как фотосинтетический, так и дыхательный транспорт электронов. Напротив, ЦПМ не содержит хлорофилла а (Хл) и, с большой долей вероятности, участвует только в процессе дыхания. На схеме (рис. 2) показана локализация фотосинтетического аппарата и основных компонентов электронно-транспортной цепи в гилакоиде и ЦПМ. В контексте нашей работы на схеме важно отметить следующее. 1. В мембране тилакоида между макромолекулярными комплексами двух фотосистем -ФСІ и ФСІІ располагается цитохром b/f-котлттекс, который является универсальным общим звеном цепи, попеременно выполняющим фотосинтетический (светоуправлиемый, где донором электронов является ФСП) и дыхательный (управляемый восстановителем НАДФ Н - донором электронов для дыхательной цепи) перенос протонов во внутритилакоидное пространство (люмен). 2. Образование восстановителя может происходить не только в процессе светоуправляемого переноса электронов, но и во время дыхательного катаболизма резервных полигликозидов (гликогена). Иммобилизация запасных полигликозидов1 осуществляется исключительно через окислительный нентозофосфатный; путь, продуктом которого и является НАДФ Н. В темноте аэробная.дыхательная; цепь завершает окисление запасных полигликозндов, свободная энергия которых конвертируется в протондвижупгуто силу. 3. На наружной поверхности тилакоидной: мембраны, обращенной к цитоплазматическому матриксу, непосредственно над ФСП, расположена фикобилисома;

К началу наших исследований ультраструктуры цианобактерий; (1970-76 гг.) уже имелись, небольшое число работ, с. первыми- результатами о влиянии различных условий освещения, в том числе темноты и яркого света, на конфигурацию и пространственную организацию тилакоидов. Исследования проводили на видах, различающихся по морфологии и метаболическим:свойствам . в том числе, облигатно фототрофных и способных: к хемогетеротрофному росту: Symptoca muscorum (Bowen, Pankratz, 1963); N. muscorum (Wildon, Mercer, 1963. Ginsburg, Uazaroff. 1973); Osciilatoria chalybia (Giesy, 1964); O- redekei(Whitton, Peat, 1969); С friischiv (Peat, Whitton, 1967; Findley et al., 1970);. A., nidulans; называемый, теперь: Synechococcus sp. PCG 6301 (Allen; 1968 ); Mostoc sp., выделенный из корней Macrozamia lucia (Иоаге et ah, 1971); Anabaena flos-aque (Smith et al., 1969); Л. variabilis (Никитина и др., 1974); JV. calcicola (Громов и др., 1974); Agmenellum quadraplicatwn(Ka\ley et al., 1977). Было установлено, что при выращивании: на свепу высокой интенсивности происходит увеличение внутритилакоидного. пространства: (расхождение мембран), и: везикуляция тилакоидов (Bowen,. Pankratz. 1963; Whitton. Peat, 1969; Findley. et al., 1970).. В единственной работе было показано, у пожелтевших на= ярком свету клеток везикуляция тилакоидов являлась обратимой. В- остальных работах описаны различные варианты реорганизации расположения тилакоидов в цитоплазме.

Ультраструктура цианобактерий при воздействии лизоцимом

Проведённые нами электронно-микроскопические исследования с использованием адекватных методов фиксации препаратов, содержащих, по предварительной оценке с помощью световой микроскопии, до 70% ФДКС, свидетельствуют о сохранении структурной целостности цитоплазмы основной массы содержащихся в суспензиях еферопластов трёх штаммов цианобактерий (Минеева и др. 1980; Гусев и др., 1982 а; Агафодорова и др., 1982 б; Наулина и др., 1984 б).

Svnechocnccits sp- РСС 6301 быстро реагирует на воздействие лизоцимом, образуя сферопласты различной морфологии (рис. 3.1 - 3.4). Отличительной особенностью Synechococcus sp. PCC 6301 по сравнению с двумя другими исследованными- штаммами являегся образование наряду со сферическими, сфероштстов бобовидной формы (рис. 3.4), что подтверждается светоогпическим контролем препаратов. На ультратонких срезах сферопластов бобовидной и неправильной формьь обнаруживаются обширные участки поверхности, сохраняющие относительное расположение слоев клеточной стенки: не полностью разрушенного нептидоглнканового слоя: и наружной мембраны (рис. 3.2). На других участках, где. пептидогликановый слой: разрушен,, по-видимому, практически полностью, наружная = мембрана теряет жесткость, растягивается далеко отходит от поверхности протопласта, во многих местах теряя чёткие контуры. Описанное состояние наружной мембраны наблюдали вне зависимости от предусмотренного методикой; (Семёнова и др., 1982) введения в инкубационную-среду ЭДТА и катионов Mg, обладающих, соответственно, дестабилизирующим или стабилизирующим действием на эту структуру. На изученных препаратах, её разрывов; не было обнаружено. В; цитоплазме происходит изменение взаиморасположения зоны нуклеоида и тилакоидов вследствие инвагинаций последних с периферии в центральную часть цитоплазмы (рис. ЗЛ; 3.3). Тилакоиды во многих сферопластах выглядят интакными (рис. 3.1 - 3.4),. однако, в, присутствии ЭДТА в препаратах чаще обнаруживлись формы, где произошло набухание тилакоидов (рис. 3.5). Важным наблюдением является то, что в таких сферопластах периплазматичекое пространство соединяется с внутритил акоидным, и при этом видна; связью ЦПМ! с мембраной: тилакоида. Этот факт для того же штамма отмечен также в работе Коснера и Трокслера (Cosner, Troxler, 1978). Кроме того, используя меченый лейцин, эти авторы показали, что сферопласты метаболически активны и способны к синтезу белка;

Вопрос о связи» мембраны тилакоида; с Ц1ТМ- и образовании, единой мембранной системы у цианобактерий неоднократно обсуждался исследователями, с приведением различных экспериментальных данных (Пиневич,1 Топчиева, 1991). Тем не менее, этот вопрос является дискуссионным до настоящего времени. Наши результаты свидетельствуют о непрерывности ЦПМ и тилакоидной мембраны, по крайней мере, у Synechococcussp. PCG 6301. A: variabilis CAM J 458, выращиваемая на минеральной среде или в присутствии сахарозы,.образует сферопласты, в принципе, аналогичные таковым Synechococctts sp. PCC 6301 (рис. 3.6). Просіранеї венная организация тилакоидов и остальных внутриклегочных компонентов в разных вариантах подобна:таковой в интакгных клетках.. При выборе в качестве, осмотического стабилизатора маннита или сахарозы набухающие тилакоиды; в исследуемых препаратах отсутствовали; Интересно- отметить, что в препаратах сферопластов встречались единичные клетки с. пороподобными «канальцами», пронизывающими перегородку {рис. 3.7), которые подобны, описанным: у клеток этого же штамма, подвергшихся, фотоокислителыюй деструкции (см. гл. 2). В клетках исходной культуры, как было сказано выше, аналогичные образования также: встречались,- но очень: редко, например; в случае автолиза одной из соседних клеток в нити (рис. 3;8).

С. fritschiu как известно из литературы и отмечено нами в предыдущей главе, обладает свойством в различных условиях роста формировать популяции, , в значительной степени гегерогенные по морфологии и ультраструктуре клеток. Прежде: всего, это, очевидно, связано с относительно сложным циклом развития этой пианобактерии. Разные клетки в популяции, находящейся на стадии интенсивного роста, не одинаково реагируют на воздействие лизошша. Определённая их часть. вообще не претерпевает каких-либо ультраструктурных изменений, также, как и: у двух вышеописанных штаммов.. Важно отметить, что; разрушение: клеточной; стенки лизоцимом: не обязательно влечёт за собой распад аїрегатов на:одиночные клетки,благодаря скрепляющему их чехлу, которыйтакже может претерпевать деструктивные изменения (рис. 3.9). Размер и форма ФДКС, а; также плотность цитоплазмы клеток:в агрегатах: можег быть разнообразна, что, возможно, связано с неодинаковой проницаемостью изменённых: поверхностных структур для осмотически активных веществ.

На начальных этапах разрушения пептидогликана периплазматическое пространство: неравномерно и довольно значительно увеличивается в объёме. При этом пептодогликан всегда? прилегает к, наружной мембране даже при фрагментации клеточной стенки вследствие - разрывов, что наиболее выражено в присутствии: ЭДТА в инкубационной: среде, при отсутствии, катионов, Mg (рис. 3.30). Расстояние между наружной мембраной, имеющей-типичный: трёхслойный:. профиль, и слоем иеитидоглпкана сохраняется равномерным, порядка 15 нм, как и в интактных клетках. Наружная: мембрана вместе, с остатками пептидогликана может «слущинаться» с поверхности клетки, следствием чего является образование протопластов (рис. 3.11; 3.12). Это является отличительной особенностью С fritschii при сравнении с Synechococciis sp. РСС 6301 и A. variabilis CALU 458: Другой отличительной чертой является; то,, что у многих клегок при практически -полной деструкции.пептидогликана наружная мембрана не растягивается и следует параллельно ЦГТМ;: на расстоянии; соответствующем толщине интактного ригидного слоя клеточной стенки (рис. 3.13)..Чехлы, вследствие деструкции, могут утрачиваться, но, в основном, в присутствии катионов Mg формирование ФРКС -сферопластов и7 протопластов происходит внутри этих структур (рис. 3.14). Для обоих типов ФРКС характерно образование везикул, с участием, соответственно, наружной? мембраны или ЦПМ (рис. 3:14). Дополнительное воздействие ультразвуком; (22 кгц. в течение 30-сек) приводит к существенному увеличениюв препаратах числа структурно целостных протопластов с удалёнными чехлами (рис, 3.15).

Таким- образом,.ультраструктурные изменения клеточной стенки С. fritschii при воздействии лизоцимом существенно отличаются от таковых Synechococciis sp: РСС 6301 и A. variabilis CAh\J 458. Принципиально иной характер; повреждения наружной мембраны С. fritschii обуславливает возможность получения: из клеток этого? вида= ультраструктурно; целостных протопластов:. В; работе: Пиневича показано, что обработка лизоцимом; при добавление 5мМ ЭДТА в присутствии; трис-буфера приводит к. образованию «истинных» протопластов: A., variabilis. Однако при этом возникало нарушение их внутренней структуры (Пиневич, .1977). Очевидно, полная; деградация; и у грата; наружной; мембраны в условиях экспериментального- воздействия- лизоцимом: с целью получения не только сферопластов. но; И: протопластов, может приводить к глубоким деструктивным изменениям последних, у этого; вида. Такую картину мы наблюдали: в: ранний: период нашей работы по исследованию возможности получения сферопластов у А: variabilis: С ALU 458 (Баул ина и др., 1975) По данным других авторов удалось получить более:чем 75% жизнеспособных сферопластов Л. variabilis АТСС 29413 (Berliner et al., 1987). По ультраструктуре они были аналогичны описанным нами в настоящей главе. Наружная мембрана сохранялась и при обработке лизоцимом Synechococcus sp. РСС 6301 (Lindsey ctal., 1971; Gabriel, 1977).

Охарактерзованные нами ультраструктурно целостные ФРКС всех трёх видов, по-видимому, являлись метаболически активными. Активность фотосинтеза и поглощения кислорода в темноте (показатели энергетических процессов), а также включения органических 14С-соединений (показатель биосинтетических процессов) клеточных форм Synechococcus sp. РСС 6301 и A. variabilis CALU 458 в препаратах, содержащих высокий процент сферопластов, сохраняется: на: уровне, присущем иптакгным клеткам (Семенова и др., 1982; Семёнова, 1983). По крайней мере, часть из полученных ФРКС всех трёх видов при удалении лизоцима и перенесении в питательную среду способна к реверсии в целые клетки и прорастанию (Семёнова, 1983). В то же время, сфероштасты Synechococcus sp. РСС 6301 на последующих этапах индукции L-трансформации полностью лизировались, а. обработанные лизоцимом клеточные суспензии двух других видов оказались пригодными для последующего получения L-подобных колоний на агаризованной среде в присутствии лизоцима (Русев и др., 1981).

Anabaena variabilis CALU 458 в ассоциациях, полученных с:использованием протопластов табака

A: variabilis САШ 458 в модельных ассоциациях, полученных с использованием протопластов табака (Агафодорова и др., 1982 а, б; Баулина, Агафодорова, 1983; Гусев и др., 1983 б; Баулина и др., 1984 а; 1988 б). Этапами формирования таких ассоциаций являлись:

1) инкубация клеточных суспензий цианобактерий (в некоторых опытах -суспензий, обработанных лизоцимом и содержащих сферопласты) с протопластами табака в условиях, способствующих адсорбции и поглощению протопластами цианобактерий;.

2) культивирование суспензий и получение смешанных агрегатов клеток;

3) индукция каллусогенеза и последующее пассирование смешанного каллуса;

4) индукция органогенеза и получение растений-регенерантов из смешанного каллуса.

На первом этапе, в специально подобранных условиях, (введение в инкубационную среду ПЭГ или катионов кальция при высоких значениях рН) была получена эффективная адгезия клеток A. variabilis С ALU 458 на поверхности растительных протопластов {рис. 4.7 а, б). В суспензиях, обработанных ПЭГ, удалось обнаружить протопласты табака, содержащие ультраструктурно целостные клетки A. variabilis CALU 458 во внутриклеточных вакуолях (рис. 4.8 а, б). По всей вероятности, формирование растительными клетками: вакуолей, содержащих цианобактерии, являлось результатом поглощения последних путём эндоцитоза. В некоторых протопластах цианобактерии обнаруживались в центральных вакуолях. Однако ПЭГ оказывал неблагоприятное воздействие на протопласты табака (Горелова и др., 1981), что во многих случаях выражалось в развитии: деструктивных процессов в цитоплазме (рис. 4.8 б). Смешанные суспензии, обработанные ПЭГ, при последующем культивировании оказались не жизнеспособными.

Использование 0,05 М CaCU при рН 7.5 способствовало интенсивной адгезии цианобактерии на поверхности протопластов (в среднем, до 60% протопластов адсорбировало цианобактерии) и пе влияло на жизнеспособность компонентов суспензии. Последующее культивирование и индукция каллусогенеза (2 и 3 этапы формирования ассоциаций) оказались успешными и привели к образованию смешанного каллуса (рис. 9). Ассоциацию каллуса табака и А. variabilis CALU 458 культивировали на протяжении 2, 5 лет с пересадками каждые І - 1,5 месяца (табл. 1). Электронно-микроскопическое исследование каллусной ткани в первом пассаже показало, что цианобактерии локализуются как на поверхности, так и внутри каллуса, в толі числе, в центральных вакуолях растительных клеток (рис. 4.9). Это свидетельствует о поглощении цианобактерии протопластами табака на начальных стадиях формирования ассоциаций, поскольку при последующей регенерации клеточной стенки, попадание внутрь клетки было бы невозможным. Пристеночный слой цитоплазмы на тех участках, где не локализованы основные клеточные органеллы, включая ядро, очень тонок, что вообще присуще деднфференцированным клеткам табака на стадии роста растяжением. Однако микроколонии цианобактерий и центральных вакуолях мы, наблюдали редко. В то же время, как показали исследования трёх последующих пассажей, прослеживается тенденция, которая характерна для получаемых нами. и другими авторами? (Горелова,. 2000) модельных ассоциаций: внутритканевые микроколонии пионобактерий: локализуются; в полостях или «вместилищах», образованных каркасами из клеточных стенок мертвых растительных: клеток,, располагающихся в жизнеспособных тканях и органах ассоциативных систем.

Популяция цианобактерий, растущая в ассоциации с каллусом, является гетерогенной по морфологическим и ультраструктурнымпризнакамсоставляющих её клеток; Внутри каллуса это разнообразие настолько велико, что его можно было бы охарактеризовать, как «предельно возможное». При сканирующей электронной микроскопии клетки выглядят как овальные или сферические, часто неправильной формы, одиночные или в цепочках, размером: от 0,5-и до 4-х мкм в диаметре, с гладкой: или разрыхлённой поверхностью (рис.. 4.10; 4.11). Деление может происходить одновременно в нескольких плоскостях. Мелкие клеточные формы, диаметром; около 0,5-и мкм: могут отделяться от более крупных путем неравновеликого деления (рис. 4.12 а),-, в том числе, возможно, и почкования (рис. 4.12 б). В последнем случае, также как это видно и на рис; 4.10 б. клетки имеют разрыхлённую поверхность, и, следовательно, возможно, являются ФДКС. На ультратонких: срезах удалось обнаружить следующие: типы; мелких клеточных: форм; 1) Мелкие клетки, диамегром около 1-1,5 мкм,. сохраняющие, клегочную стенку и ультраструктуру,, подобную таковой вегетативных клеток: обычных размеров, (около 2-х мкм в поперечнике). Мелкие формы, часто соединённые перегородкой с более крупными клетками: Л:. variabilis С ALU 458, то. есть, являющиеся продуктом неравновеликого деления (рис; 4.13), вообще характерны= для данного штамма (рис. 2.2;,. гл. 2). Вопрос об их жизнеспособности и полноценности; генома; остаётся: открытым; 2) Отдельно лежащие единичные, овальные клеточные-формы с:поперечным размером;0,7-1; мкм, с редуцированной: клеточной: стенкойі и не: имеющие тилакоидов.. но содержащие рибосомы и нуклеоид (рис. 4.14), Возникновение неправильной формьь клеток, близкой; к многограннику, очевидно связано с нарушением процесса деления (рис, 4.10 а; 4.11 а, б).. На-ультратонких срезах видно, что образование перегородки-происходит асимметрично, сразу в нескольких плоскостях, а также в ещё не-отделившихся дочерних клетках, форма и размеры которых изменены (рис. 4.15). Такой тип деления не является характерных для A. variabilis CALU 458 в чистой культуре. Описанная картина свидетельствует о нарушении строго координируемой регуляции расположения плоскости деления клетки, действующей в клеточном цикле прокариот (Margolin, 2000). Кроме этого, в местах формирования перегородки может происходить периферическое отложение пептидогликана, не соответствующее направлению её формирования (рис. 4.16). Все эти данные свидетельствуют о том, что описанная внутритканевая- популяции A. variabilis CALU 458 находилась в фазе насбалансированного роста. Аналогичное явление формирования гетероморфных клеточных форм или ФНР; в том числе, аномально делящихся, а также появление клегок с нарушением синтеза, септального пептидогликана, описано и в других модельных системах, в частности, у N mitscomm CALU 304 в ассоциации с каллусом раувольфии и паслёна (Горелова и др., 1999; Gordova et al., 2000; Горелова, 2000, 2001)

Наряду с аномально делящимися клетками, которые являются-типичными ФНР. во внутритканевых микроколониях цианобактерий обнаружены ФРКС. К их числу относятся не только вышеупомянутые мелкие формы, но и редко обнаруживаемые гигантские протопласты (рис. 4.17). Особого внимания заслуживают истинные протопласты, размер которых сопоставим с таковым вегетативных клеток, образующие компактно упакованные группы вместе с клетками с интактной клеточной стенкой и аморфными массами из остатков; разрушившихся клеток, во «вместилищах»,, ограниченных растительными клеточными стенками (рис 4.18 - 4.21). Такие группы (микроколонии) клеток имеют явно выраженную тканеподобнуто организацию. Однако в данном случае не выявляется такой важный компонент «псевдоткани», как фибриллярный межклеточной матрикс, наличие которого является характерным для бактериальных колоний. Фибриллярный матрикс, подобный слизистому, вообще не был обнаружен в данной ассоциативной системе. В то же время, в тканеподобных микроколониях межклеточное пространство заполнено фрагментами структур и органелл разрушенных клегок, обозначенных нами как аморфные массы. Аморфные, или но терминологии Прозоровского с соавт. (1981) бесструктурные массы, являются комионетами L-колоний наряду с нитевидыми структурами и разнообразными но размерам ФРКС.

Характерной особенностью протопластов Л. variabilis CALU 458 в этих микроколониях: является: их амебоидная форма. Протопласты часто образуют выросты, наподобие псевдоподии и таким образом «протискиваются» между интактными клетками; (рис. 4.19; 4.20). На ультратонких срезах встречаются; амебоидные протопласты, которые выглядят делящимися; Некоторые из них образуют цепочки (рис. 4.21). С помощью сканирующего электронного микроскопа в редких случаях удалось обнаружить, по-видимому, почкующиеся. ФДКС (рис. 4.12 б). Возможность деления; и, следовательно, жизнеспособности протопластов, поддерживается тем, что эти, клеточные формы сохраняют ультраструктурную целостность. В них выявляются компактные зоны; нуклеоида с периферически расположенными рибосомами- (рис; 4.18), многочисленны- уиорядоченно расположенные тилакоиды; образованные тесно сближенными мембранами, типичный- трёхслойный профиль которых также выявляется (рис. 4;21).. Гиалоплазмаимеет равномерную электронную плотность без признаков автолиза, но в, ней; как правило, мало включений запасных, веществ. На поверхности протопластов образуются мембранные везикулы; отделяющиеся в межклеточное пространство. В; компактных внутритканевых микроколониях: цианобионтов-сложно с достоверностью, установить, факты равновеликого деления или: почкования протопластов, однако, полученные результаты указывают на возможность, действия1 механизма L-трансформации: в популяциях: A. variabilis CALU 458 с образованием L-форм протопластного типа; Трактовка функционального статуса мелких: протопластов, как элементарных тел затруднительна; в силу весьма редкого их обнаружения; на ультратонких срезах. В то же время, не исключена возможность: формирования в этих клеточных формах тилакоидов de novo на основе минимальных фрагментов мембран; и- молекул Хл (Schmetterer,1983).

Определение проницаемости слизистых поверхностных структур интактных клеток цианобактерий

Почти все зависимости имеют линейный характер и различаются углом наклона. Для удобства представления и обсуждения результатов было измерено относительное изменение коэффициента Q (AQ), методика вычисления которого дается в главе "Объекты и методы исследований". В таблице 7 представлены полученные значения AQ для восьми изученных штаммов цианобактерий. Каждое значение AQ отражает данные одного конкретного эксперимента, однако, является типичным в серии, включающей не менее четырех повторностей.

Сравнивая величины AQ для разных видов, можно заключить, что наибольшие значения AQ соответствуют видам, имеющим наиболее развитый чехол (например, N. muscorum CALU 304), а наименьшие значения - видам с минимально развитыми СПС, состоящими, возможно, только из олигосахаридных цепей липополисахарида наружной мембраны (Synechococcus sp. PCC 6301). Результаты электронно-микроскопического исследования показали, что ультраструктура слизистых слоев у всех видов остается неизменённой после инкубации с декстранами, по сравнению с контролем (исходная культура, не инкубированная с декстранами). N muscorum CALU 304 и BKM 16, а также N. ellipsosporum имеют развитые чехлы, характерные для рода Nostoc. Структура чехлов, например, у клеток N. muscorum CALU 304 в используемых нами оптимальных условиях выращивания, фибриллярная, причем ориентированы фибриллы параллельно относительно поверхности клеток и в некоторых клетках они упакованы в виде двух слоев (рис. 5.3). У N muscorum СЛШ 304 и N. ellipsosporum толщина чехла примерно равна радиусу клетки. Чехлы N. muscorum ВКМ 16, значительно варьирует в объёме у разных клеток и более рыхлые. У-некоторых клеток они; скорее напоминают аморфную слизь (рис. 5.4). Клетки Л/. firma окруженьттонким (20-30 нм), рыхлымслоем средней электронной плотности; и относительно равной толщины на: всем: протяжении. Этот слой: может быть: обозначен как микрокапсула, поскольку в световом микроскопе он: не выявляется: Напротив, клетки С. fritschii имеют мощный чехол,, состоящий, как, правило; в оптимальных условиях выращивания из двух и более слоев, типичный для данного вида (см. гл. 2, 3, рис. 3.19). У большинства,клеток;этого вида в составе чехла присутствует электронно-плотный слой,, имеющий гомогенную- структуру, в отличие от фибриллярных слоев; прилегающих к нему. При электронно-микроскопическом! изучении S. ptatensis (рис; 5.5 а), мы обнаружили,.что у этой цианобактерии имеется относительно тонкий чехол с равномерной толщиной порядка 70 нм, чётко ограниченный по периферии: (рис. 5.5 б). Он состоит из перпендикулярно ориентированных к поверхности клетки фибрилл высокой электронной плотности. Слипание фибрилл, к- сожалению, очевидно, является артефактом фиксации. Подобный чехол был описан у других представителей:пор. Oscillatoriaceae - Phormidium ипсіпаїитт Lyngbya aeruginosa (Hoiczyk, Baumeister, 1995). Особенно хорошошродемонстрирована его ультраструктура у - Р: imcinatum после обработки препаратов методом замораживания-замещения (Hoiczyk, 1998). К сожалению; подробное описание: этого слоя, в. том числе, его биохимического-состава, для S. platensis в доступной нам литературе отсутствует, имеется лишь указание,.что при культивировании & platensis при 37С у нее образуется слизистая капсула (van: HykeJenburg. 1979). Кроме, того, этот, вид способен формировать, слизистые влагалища при развитии в природных условиях, тогда как в культуре эти образования встречаются достаточно редко; как, в= частности, было показано и нами. Что касается Л: variabilis: АТСС 29413, то в условиях наших экспериментов она не формировала стабильной купсулы,, а продуцировала аморфную слизь, которая могла легко отходить от клеток (рис. 2.31, гл.2). Отсутствие чехла, капсулы или микрокапсулы у Synechococcus sp. РСС 6301, как известно, является І одной из особенностей этого вида (Bergey s Manual of Syst. Bact., 1989). Однако внешний лепесток наружной- мембраны у этой цианобактерий обычно имеет высокую электронную плотность и выглядит шероховатым (рис. 5.6), что, очевидно, отражает присутствие слоя, подобного гликокаликсу, образованному олигосахаридными частями молекул липополисахаридов;

Необходимо отметить, что результаты электронной микроскопии для всех изученных видов показали, что остальные поверхностные структуры, помимо СПС, типичны для цианобактерий: и; представляют собой- наружную мембрану и пептидогликановый слой. Исключением является изученная: нами S. ptatensis. Обнаружено наличие гомогенного, средней электронной плотности слоя, расположенного над наружной мембраной и четко ограниченного по периферии тесно- соприкасающимся; с ним- чехлом: (рис. 5.5 б): Слой имеет одинаковую толщину, около 26 нм, на всем своем протяжении; Для S. platensis он ранее не был описан в литературе. Однако подобные слои были обнаружены и подробно1 описаны у других:цианобактерий пор; Oscillatonales, способных к, скользящему движению (Hoiczyk, Baumeister, 1995). В цитируемой работе эти дополнительные слои называют S-слоями; и их присутствие связывают со способностью к движению. Поскольку S. platensis также является:скользящей цианобактерией пор. Oscillatonales, не исключено, что описанный?нами слой:также можно отнести к этим структурам (S-слоям).

При сравнении приведенных в таблице 7 данных о величине AQ и толщине и организации; слизистого слоя для крайних вариантов: выявляется определённая: зависимость этих: двух характер истик. Для N. тшеогат СAL U 3 04 параметр AQ достаточно высокий по сравнению- с таковым Synechococcm, sp._ РСС 6301, что указывает на то, что разное количество дектранов может, поступать,в::объекты. Исходя, из представленногог выше обоснования, мы считаем, что у всех видов: (кроме Synechococcus sp. РСС 6301) декстраны= во время инкубации с клетками могут путем: свободной диффузии проникать в слизистый слой. Дальнейшее их продвижение в клетку ограничено наружной: мембраной; По-видимому, распределение в: полисахаридном матриксе чехлов, микрокапсуле М: firma или в лабильной поверхностной слизи A. variabilis АТСС 29413, может происходить как типичное распределение в геле. Для: обоснования этого предположения5 были проведены эксперименты с различными гелями Sephadex. Получена картина монотонного увеличения коэффициента Q в зависимости от rs поглощенных гелевым матриксом декстранов в области от 9 нм до 1,5 нм (рис. 18), сходная с таковой для живых клеток цианобактерий.