Введение к работе
Актуальность проблеми. Благодаря слояным и важный функциям микробных полисахаридов как индукторов биологических програми системы иммунитета использование кх оказалось весьма перспективный в практическом плане в качестве компонентов вакцин, адъювантов, противоопухолевых препаратов и неспецифических стимуляторов.
На фоне несомненно больиих досгизений в изучении химического строения и иммунобиологических свойств антигенных липополисахари-дов сальмонелл, иигелл и эшерихий (Simmons, 1966; Luderitz е.а., 1971, 1982; Kowalewska, Roraanovfska, 1977; Дмитриев, 1977, 1987; Захарова, 1980; Тимаков, Петровская, I980;Brade, Galanee, 1983; Книрель, 1985;и др.) каыи представления об углеводсодорнащих антигенах возбудителя чумы еце не достаточны. В то se зремя выделение и изучение соматических полисахаридсодерващих антигенов чумных бактерий представляют значительный теоретический и практический интерес в связи с несомненной ролью их з иммунитете против чумы (Куков-Бережников, ШО; Домарадский.и др., 1962; lawton, Sur-galla, 1963; Акимович и др., 1968; Дальвадянц, 1968, 1978; Barber, Eylan, 1971; Вейнблат и др., 1977; Адамов, 1978).
Проводившиеся во ВНИПЧИ "Микроб" о 1956 года систематические исследования специфических полисахаридсодеркащих фракций чумного микроба позволили сделать определенные выводы о характере структуры его О-антигена. Было показано, что бактерии чумы, существующие в-'в-форме и сохраняюиніе при этом вирулентность, характеризуются наличием разобщенной структуры липополисахарида; они синтезируют недостроенный центральный стеркень липополисахарида (глико-липид, или R -ЛПС)'и самостоятельно функционирующие з клетке 0-боковые цепи. Указанные фрагменты комплексного О-антигена, получившие соответственно названия липополисахарид (1ПС) и "основной"
- З -
соматический антиген (ОСА), раздельно извлекались из вакцинного штамма S7 чуйного кикроба (Бахрах, 1972, 1973; Бахрах, Вейнблат, 1972; Бахрах и др., 1972).
имеющиеся теоретические обобщения бьши сделаны ДЛЯ ОТДвЛЬНЫХ штампов к з основном относились к итамму EV . Представляло несом-неннкй интерес исследование особенностей структурной организации 0-анк:гека у бактерий чуш с разными биологическими свойствами и выделенных в разных природных очагах. Совершенно отсутствовали сведения о соматических антигенах возбудителя чуыы, изолированных из з-форы бактерий. Были недостаточно изучены особенности структуры соматического О-антигена у к-форм близкородственного возбудителя псевдотуберкулеза. Требовали существенной разработки методы получения и стандартизации очищенных антигенных препаратов ССА и ЛПС. Оставались открытыми практические вопросы, касающиеся усовершенствования иммунодиагностического аллергена пестина ІШ, содержащего в своем составе специфические углеводные компоненты ОСА и ЛПС. В этом плане были недостаточно обработаны вопросы биотехнологии и физико-химических параметров очищенного препарата, не были проведены испытания-на людях, отсутствовала лабораторная документация на изготовление и применение аллергена. Возник также вопрос о целесообразности использования пестина как иммунодиагностического препарата не только in vivo, но и in vitro.
Учитывая то обстоятельство, что углезодсодврзащие антигены чумного и псевдотуберкулёзного микробов (ОСА, ЛПС, пестин и псевдот туберкулин) находят все более иирокое применение в практике здравоохранения как компоненты диагностических и профилактических препаратов ( Филиппов и др., '1977; Дальвадянц и др.,1978; Самойлова и др., .1983;-Вывалов и др., 1984; Царев, 1984), новые данные, касающиеся их физико-химической природы в сопоставлении с иммунобиологическими свойствами,могут быть использованы для решения
_ 4 -
практических задач по выявлении атипичных штаммов и созданию вакцин против чумы и препаратов, выявляющих иммунитет.
Цель работы - комплексное исследование физико-химической природы и биологической активности углеводсодержащих антигенов и их специфических полисахаридов у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и оценка возможности использования полученных данных для конструирования профилактических и диагностических препаратов и идентификации атипичных штаммов чумного микроба.
Задачи исследования: I/ разработать оптимальную стандартную технологию выделения и очистки отдельных углов одсодераапдос соматических антигенных комплексов чумного и псевдотуберкулёзного микроба - ОСА, ЭД1С, аллергена пестина ІШ; 2/ изу-чить физико-химическую природу и моносахаридный состав препаратов ОСА и ЛПС, изолированных из штаммов чумного микроба с разными биологическими свойствами, включая гладкие варианты, и выделенных в рззличных природных очагах; 3/ определить структуру специфических полисахаридсодераещих анвигенов возбудителя псевдотуберкуле-аа, находящегося в шероховатой форме диссоциации; V исследовать физико-химические свойства и специфическую активность в эксперименте очинённого препарата пестина ШІ; 5/ изучить иммунобиологические и иццунохишческие свойства углеводсодеряацих антигенных препаратов ОСА и ЛПС для выявления их роли в формировании патогенеза и имыуноаллергической перестройки макроорганизма при чуме; б/ провести апробации безвредности и специфической активности нового аллергена пестина ШІ на людях в тестах in vivo и in vitro.
Научная новизна. Впервые исследована структура О-антигена чумного микроба у штаммов с разными биологическими свойствами, включая ахромогенность, антибиотикоустойчивость, аук-сотрофность и вирулентность, выделенных в разных природных очагах, а также у штаммов в s -форме диссоциации. На значительном коли-
честве штаммов изучены особенности строения липополисахарида у R -вариантов возбудителя псевдотуберкулеза.
Показано, что в отличие от псевдотуберкулезных бактерий, находящихся в S -форме и синтезирующих полную структуру 0-соматиче-ского антигена, для исследованных культур чумного микроба, независимо от биологических свойств и фазы диссоциации, и для R-форм псевдотуберкулезных бактерий характерна разобщенность центрального стергня и О-специфических боковых цепей в липополисахариде. Для штаммов чумного микроба, находящихся в s-форме диссоциации, выявлены дефектные изменения ионосахаридного состава специфических полисахаридов. Впервые в О-специфических структурах ЛПС у вирулентных и иимуногенных культур возбудителя чумы обнаружены 3,6-дидезо-ксигексозп, являющиеся маркерами О-специфичности. Установлено принципиальное сходство по общему химическому и ыоносахаридному составу у препаратов ОСА, изолированных из к -форм чумных и псевдотуберкулезных бактерий, открывающее возможность использования последних как компонентов профилактических препаратов против чумы.
Предложен ускоренный способ выявления структурных особенностей липополисахарадов у бактерий чумы и псевдотуберкулеза по наличию альдогептозы непосредственно в экстрактах, минуя стадию выделения, очистки и анализа специфических полисахаридов. Научная новизна метода заключается в использовании при изучении атипичных и переходных штаммов и при отборе полноценных в антиген.Гом отношении культур, пригодных для получения типовых псевдотуберкулезных агглютинирующих сывороток. Разработаны научно-методические основы выделения очищенных углеводсодержацих препаратов ОСА и ЛЕС возбудителей чумы и псевдотуберкулеза с определенными физико-химическими параметрами. Стандартизованы методики проведения их физико-химического и иммуяохимического анализа.
Получены новые данные по выделению из пестина ІШ компонента, который более четко, чем исходный препарат, выявляет не только
аллергическую перестройку организма в результате вакцинации, но и резистентность его к чуме. Исследована физико-химическая к иммунобиологическая природа его в эксперименте. Новый очищенный пестин апробирован на людях. Впервые показана возмояность аллерго-диагностики при чуме с препаратами пестина in vitro з тесте ППН.
Полученные результаты явились теоретической основой для выхода материалов в практику.
Практическая ценность. Разработанные нами методы вопли в "Методическое пособие по биохимия, генетике и молекулярной биологии возбудителей чуш и псевдотуберкулзза", утверзї-денное ГУКИ МЗ СССР 12 декабря 1985 г., и в "Методические рекомендации по физико-химическому анализу ряда антигенных структур воз-будителя чумы", утверздеиныа директором ВШПЧИ "Микроб" 17 декабря 1977 г. Перечисленные методические документы и стандартные антигенные препараты ОСА и ЛПС используются в практике ЕШШЧИ "Микроб" и НИПЧИ Кавказа и Закавказья.
На аллерген пестин ПП усовершенствованный составлена и утверждена документация в виде технических условий (ТУ 42.КВС 111--77) и изменений к лабораторному регламенту (й 107, утверждены КВС 30 июня 1977 г.). Группой специалистов с участием автора успешно прове дена широкая апробация пестина ПП на иммунизированных против чумы добровольцах (408 чел.); подтверждены высокая специфичность, полная безвредность и биологическая активность препарата при внутри-кожном введении. Пестин испытан и получил полоаительную оценку в исследованиях Волгоградского ПЧИ при проверке иммуноаллергиче-ской перестройки у вакцинированных протиз чумы людей (550 добровольцев) .
В течение многих лет изготовляемый нами аллерген пестин ПП неизменно пользуется широким спросом исследователей противочумной системы, разрабатывающих различные аспекты иммуноаллергической
-. 7 -
переотройки при чуые in vivo и in vitro.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 3-й Всесоюзной биохимическом съезде (Рига, 1974), на 7-й Всесоюзном микробиологической съезде (Алиа-Ата, 1985), на Всесоюзных конференциях по химии и биохимии углеводов (Ростов-на-Дону, 1977; Тбилиси, 1987), на Всесоюзной конференции "Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры" (Саратов, 1980), на Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981), на Всесоюзной конференции "Профилактика природноочаговых инфекций" (Ставрополь, 1983), на ХУ Пермской областной научно-технической конференции по спектроскопии (Пермь, 1976), на рабочем совещании "Биохимия клеточной поверхности грамотрицательных микроорганизмов" (Саратов, 1984), на рабочем совещании специалистов биохимиков, генетиков и молекулярных биологов противочумных институтов (Саратов, 1985), на традиционных ежегодных научных конференциях института "Микроб", посвященных дню рокдения В.II.Ленина.
Материалы диссертации вошли в 8 научных отчетов (1975-1985 гг.) по законченным НИР, выполнявшимся'в соответствии с планами Министерства здравоохранения СССР. Диссертация обсуждена и одобрена на расширенной конференции института "Микроб". По теме диссертации опубликовано 52 научные работы в издательствах, соответствующих требованиям пункта 2.7 Положения.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, I главы обзора литературы, описания материалов и методов, 4 глав, отражающих результаты собственных исследований по теме, заключения и выводов, иллюстрирована 48 таблицами и 16 рисунками. Указатель литературы содержит 444 отечественных и 161 иностранный источников.