Введение к работе
Актуальность проблемы: Аналога гджродных Нуклеозидов пред-зта^ляют значительный интерес для химиотерапии вирусных и онкологических заболеваний (Преображенская, Мельник, 1934). Кроме того, эни являются инструментом биохимических и молекул ярко-биологических исследований. Однако, из-за серьезных трудностей, возникающих три химическом синтезе влцесгв этого класса, производство и, сле-цоват-льно, доступность их .уія заинтересованных исследователей :>гря:тичена. По этой причине актуальным на сегодняшний день явля-зтся изучение возможности использования для синтеза Апологически активных аналогов природных нуклесзидов различк^х фермея'-.в нуклеинового обмена, в том числе бактериальных нуклеозидфосфорилаз.
В литературе имеются данные . о. применении в ряде случаев в качеств; ферментных препаратов при синтезе нуклс-озидов покоящихся клеток бактерий (Morlsawa et al., 1980; Utagav.a et al., 1935). В ?гязи с тем, что применение нефракционировагошх бактериальных сеток может гадать суяеетвеьяыв технологические преимущества в сравнении с использованием ин-ивидуалыъх ферментов, представляти актуальным изучить отношение к тем или иным субстратам нук-яеозидфосфорилаз непосредственно в составе целых ш.еток бактерий. ' Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы сило экспериментальное обоснование возможности использования клеглс Escherichia coil для синтеза модифицированных аналогов природных гуринозых нуклеозидов путем ферментативного трансгликозшшрования хютветствуюзих гетероциклических оснований.
В соответствии с цель1.: работы в задачу.исследований входило:
-
Поиск и селекция.бактериальных штаммов с еысокой нуклео-зиАфосфорилазной актішностью целых клеток.
-
Подбор питательной'среда л отработка услоьлй культивиро-зания продуцентов нукл«озидфосфорилаз,
-
Изучение субстратной специфичности клето-^ых уридин- и гуржшуклеозидфо^орилаз и создание,на основе целых бактериаль-ых слеток ьасокоэффективного трансгликозилярукщего ферментного препарата, пригодного для шогократного использования.
-
Реализация биокоталитического процесса получения модифя-шрованшх нуклеозидов на примере препаративного синтеза противовирусных нуклео-::дов - 9-А-Е-арабшюфураігозштадеш!на (Ara-Ade) и М-В-арабинофуранозилгугнина (Ага-Gut»).
Научная новизно. В результате проведенных исслэдозшшй се-текг.гооваяы итгюлы бактерий Е. coll БМ-11 и БЇ.1-21.- целые клетки
которых проявляют урщинфосфорилэзнук, пурини, .слоозидфосфорилаз-ную и шітиділлбзаминг.гаую активности и спососяы осуществлять высокоэффективное трансгликозилироЕание пуринових гетероциклических основаній. Изучены динамика роста культуры и активности трансгяи-козилирующего комплекса ферментов Е. coll БМ-11 в условиях глубинного культивирования. Определена субстратная сг91Г"Дичность урщщнфосфорилазы и пуршшуклеозидфосфоршюзы в составе целых клеток бактерия. Полученк давше с влшккд изменений структури ?. углеводной части уридана к а-Э-рибофуренозо-1-фосфата на способность служить субстратами для у^идинфосфорилази v пурин-нуклеозидфосфорилазц, соответственно.
BnepEue установлена возможость использования І.^,9-диацетнл-гуанина в качество исходного субстрата реакции фермзьїчтизного грансглккозилкрования, что позеоляло применить его в методе микробиологического синтеза Ara-Gua.
Экспериментально обсснозано применение глутарового альдегида для повышения операционной стабильности уридиифосфорллазц, пурин-нуклбозидфосфорклаза и цитидиндезаминази в составе целых клеток Е. coli, используицихс»! в качества биокатализатора в реакции фор-ментагиг. чого тршігллкозилировзния.
Практическая ценность работы. - Получены данные, расширяющие представление о . возмозаюстях кспользования целых бактериальных клеток в качестве биокатализатсроз в реакциях ферментативного трансгликозялироЕания гетероциклических оснований.
На основе использования целых клеток бактерии Е. roll-RJ-S1 разработаны препаративные способи получения противовирусных нук-леозидов - Ara-Ade (А. с. 420702) и Ara-Gua (А. с. 1483953).
Предложен эффективный лолиферментный препарат, содержании уридянфссфорилазу, пуршшуклесзядфосфорклазу и цитадиндезакиназу и пригодный для многократного использования в реакциях гиктьза модифицированных нуклеозидов. ..,.-.'
Апробация работы. Материалы ди.серташхшои работ;; были представлены на VII Съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата, 1985); III Всесоюзной конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" ;Кобулети, 198t/; Конференции молодых ученых "Современные проблемы . биотехнологии микроорганизмов" (Рига, 1987) и на V Всесоюзной конференции по-методам получения и анализа биохимических реактивов;(Слайда, 1987).
Публикация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных р-ібот и получено 2 авторских свизе-
ельства на изобретение.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 стр. ашинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, етырех глав экспериментальной части, выводов и списка исполь-ованной литературы, включающего 192 наименований, из них 162 -а иностранных языках. Работа иллюстрирована 18 рисунками и б таблицами.