Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы 19
2.1 Трансформация стероидных соединений актинобактериями 21
2.1.1 Гидроксилирование 21
2.1.2 Дегидрирование 26
2.1.3 Гидрирование 29
2.1.4 Эпоксидирование 30
2.1.5 Окисление спиртов в кетоны или альдегиды 30
2.1.6 Гидролиз стероидных эфиров 32
2.1.7 Окисление кетонов в эфиры и лактоны (реакция Байера-Виллигера) 32
2.1.8 Восстановление карбонильных соединений 33
2.1.9 Деградация 35
2.2 Трансформация стеринов 37
2.2.1 Стерины и источники их получения 37
2.2.2 Микробиологическая трансформация стеринов 42
2.2.2.1 Деградация боковой цепи 42
2.2.2.2 Окисление стероидного ядра 46
2.2.2.3 Методы предотвращения деструкции стероидного ядра 48
2.3 Ферменты модификации стероидного ядра у актинобактерий
2.3.1 Холестеролоксидаза 54
2.3.2 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназа (3-КСД) и получение штаммов с 55 блокированной активностью 3-КСД
2.3.2.1 Индуцибельность 3-КСД -. 56
2.3.2.2 Свойства 3-КСД 57
2.3.2.3 Сходство строения и механизма действия 3-КСД и других дегидрогеназ 58
2.3.2.4 Субстратная специфичность 3-КСД 59
2.3.2.5 Локализация 3-КСД 60
2.3.2.6 Связь 3-КСД с другими ферментными системами клетки 60
2.3.3 Свойства 9а-гидроксилазы 62
2.3.4 Свойства 17-гидроксистероидцегидрогеназ (17-ОН-СДГ) 63
2.3.4.1 Физиологическая роль 17-ОН-СДГ ; 65
2.3.4.2 Субстратная специфичность 17-ОН-СДГ 67
2.3.4.3 Индукция бактериальных 17-ОН-СДГ 67
2.3.4.4 Локализация 17-ОН-СДГ у микроорганизмов 69
2.3.4 Дезацетилирование и свойства стероидных эстераз 69
2.4 Взаимодействие клеток актинобактерий с гидрофобными стероидными субстратами
2.4.1 Строение клеточной стенки микобактерий и ее проницаемость
2.4.2 Взаимодействие актинобактерий со стеринами 73
2.4.3 Модификация структуры КС и трансформация стеринов 75
2.5 Трансформация стероидных соединений в присутствии циклодекстринов (ЦД)
2.5.1 ЦД и их применение 76
2.5.2 Производные ЦД 79
2.5.3 Константа стабильности комплексов ЦД с органическими соединениями
2.5.4 Применение ЦД в биотехнологии 82
2.5.5 Применение ЦД в биотрансформации стероидов 83
Экспериментальная часть
3 Материалы и методы 87
3.1 Материалы 87,
3.1.1 Перечень материалов, использованных в работе 87 3.1.2 СКАМ и получение препаратов на его основе 88Ї
3.2 Микроорганизмы и их культивирование 89
3.2.1 Культивирование актинобактерий 90
3.3 Определение чувствительности микобактерий к антибактериальным агентам 91.
3.4 Селекция и мутагенез микобактерий 91
3.4.1 Индукция мутаций 91
3.4.2 Получение мутантных штаммов микобактерий, продуцирующих 9-ОН-АД . 92
3.5 Трансформация стероидных соединений 93
3.5.1 Трансформация стеринов и ДГЭА в колбах 93
3.5.2 Трансформация СКАМаи его препаратов 93
3.5.3 Трансформация стероидов андростанового и прегнанового ряда 94
3.6 Очистка стероидтрансформирующих ферментов микобактерий 95
3.6.1 Очистка Зр-гидроксистероидоксидазы 97
3.6.2 Очистка 3-кетостероид-1(2)-дегидрогеназы (3-КСД) 97
3.6.3 Очистка 17-гидроксистероиддегидрогеназ (17-ОН-СДГ) 98
3.7 Характеристики ферментов 99
3.8 Определение локализации 17-ОН-СДГ 99
3.8.1 Получение сферопластов Mycobacterium sp. Etl 99
3.8.2 Определение локализации 17-ОН-СДГ фракционированием клеток 100
3.8.3 Определение локализации 17-ОН-СДГ цитохимической реакцией 101
3.9 Фракционирование клеток Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033Д 101
3.10 Изучение влияния модифицированных циклодекстринов (МЦД) на Mycobacterium spp 102
3.10.1 Влияние МЦД на рости агрегацию микобактерий 102
3.10.2 Определение миколовых кислот 103
3.10.3 Определение свободных липидов 103
3.10.4 Определение состава жирных кислот 103
3.10.5 Определение углеводного состава полисахаридов клеточных стенок 104
3.11 Электронная микроскопия 104
3.11.1 Просвечивающая электронная микроскопия 104
3.11.2 Метод замораживания - скалывания 105
3.12 Физико-химические методы 105
3.12.1 Построение фазовых диаграмм растворимости стероидов в растворах ЦД... 105
3.12.2 Определение константы стабильности комплексов ЦД со стероидами 105
3.13 Аналитические методы 106
3.13.1 Выделение и очистка стероидов 106
3.13.2 Анализ стероидов 106
4 Результаты и обсуждение 108
4.1 Трансформация стероидных соединений актинобактериями 108
4.1.1 Идентификация 7-гидроксилированных стероидов 117
4.1.2 Сопоставительный анализ 3-КСД активности штаммов рода Nocardioides... 121
4.1.3 Сопоставительный анализ 17-ОН-СДГ активности штаммов Mycobacterium и Rhodococcus 122
4.1.4 Продукты трансформации ситостерина штаммами Mycobacterium spp 123
4.1.5 Трансформация различных стеринов микобактериями 124
4.1.6 Трансформация стеринсодержащего отхода производства соевого масла... 125
4.1.6.1 Трансформация скама 126
4.1.6.2 Биоконверсия препарата М 128
4.1.6.3 Биоконверсия образцов скама, предобработанных химическими способами 130
4.2 Получение мутантных штаммов Mycobacterium spp 132
4.2.1 Определение чувствительности Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815 Д к антибактериальным препаратам 132
4.2.2 Получение мутантных штаммов из Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1815Д, определение их способности к росту на 3,17-дикетостероидах и деградации боковой цепи Р-ситостерина 134
4.2.3 Трансформация 3,17-дикетостероидов мутантными штаммами 137
4.2.4 Мутагенез и селекция штаммов, продуцирующих 9-ОН-АД 139
4.2.4.1 Получение мутантного штамма Mycobacterium sp. 2-4М 139
4.2.4.2 Трансформация ситостерина мутантным штаммом Mycobacterium sp. 2-4М 141
4.2.4.3 Трансформация 3,17-дикетостероидов мутантом Mycobacterium sp. 2-4М... 143
4.3 Ферменты модификации стероидного ядра стеринтрансформирующих микобактерии: выделение, функции и свойства 146
4.3.1 ЗР-гидроксистероидоксидаза (3-СО) 146
4.3.1.1 Очистка внеклеточной 3-СО 147
4.3.1.2 Трансформация стероидов ферментными препаратами 3-СО 149
4.3.1.3 17-ОН-СДГ активность препаратов внеклеточных ферментов 151
4.3.2 17Р-Гидроксистероиддегидрогеназа 153
4.3.2.1 Выделение, очистка и изучение свойств внутриклеточных 17-ОН-СДГ 153
4.3.2.2 Свойства внутриклеточных 17-ОН-СДГ 156
4.3.3 Локализация 17-ОН-СДГ Mycobacterium sp. Etl 158
4.3.3.1 Изучение локализации 17-ОН-СДГ методом фракционирования 158
4.3.3.2 Изучение локализации 17-ОН-СДГ цитохимическим методом 160
4.3.4 3-Кетостероид-1(2)-дегидрогеназаМксо6ас/еп шя sp. ВКМ Ас-1817Д 163
4.3.4.1 1(2)-Дегидрирование 9-ОН-АД и АД 163
4.3.4.2 Индукция 3-КСД 164
4.3.4.3 Очистка 3-КСД 165
4.4 Трансформация стеринов микобактериямн в присутствии МЦД 168
4.4.1 Биотрансформация стеринов в присутствии различных МЦД 168
4.4.2 Константы стабильности комплексов стероидов с МЦД 175
4.4.3 Выяснение связи между основными показателями биотрансформации и физико-химическими характеристиками растворов МЦД. Гипотеза "ЦД емкости среды" 176
4.4.4 Влияние МЦД на деструкцию 9-ОН-АД Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д 179
4.4.4.1 Доказательство образования комплекса включения 9-ОН-АД с МЦД 180
4.4.4.2 Кинетические характеристики процесса дегидрирования 9-ОН-АД 182
4.4.4.3 Изучение доступности комплекса [МЦД - 9-ОН-АД] для 3-КСД 185
4.4.5 Влияние МЦД на рост микобактерии, состав и проницаемость их клеточной стенки 185
4.4.5.1 Влияние МЦД на рост Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1816Д 185
4.4.5.2 Влияние МЦД на адгезивные свойства клеток 187
4.4.5.3 Влияние модификаций КС на стеринтрансформирующую активность 187
4.4.5.4 Взаимодействие клеток с субстратом в присутствии МЦД 188
4.4.5.5 Ультраструктура клеток и клеточной стенки 189
4.4.5.6 Влияние МЦД на химический состав КС 192
4.5 Биоконверсия стероидов прегнанового ряда культурой Nocardioides simplex ВКМ Ас-2033 197
4.5.1 Биоконверсия прегна-4,9(11)-диен-17а,21 -диол-3,20-диона 197
4.5.2 Конверсия 21 -ацетата прегна-4,9(11)-диен-17сс,21-диол-3,20-диона 199 4.5.3 Биоконверсия 17а,21-диацетата прегна-4,9(11)-диен-17а,21-диол-3,20 диона 204
4.5.3.1 Изучение возможности неферментативной ацильнрй миграции ацетильной группы 209
4.5.3.2 Влияние рН на биоконверсию диацетата 211
4.5.3.3 Влияние строения прегна-4,9(11)-диеновых стероидов на их конвертируемость 213
4.5.3.2 Биоконверсия 17ос,21 -диацетата прегна-4,9(11)-диен-3,20-дион-17а,21 диола в оптимальных условиях 217
4.5.4 Конверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона 217
4.5.4.1 Влияние индукции 222
4.5.4.2 Влияние биомассы 225
4.5.4.3 Локализация стероид-эстераз 226
4.5.4.4 Селективная биоконверсия 21-ацетокси-прегна-4,9(11),16(17)-триен-3,20-диона в 21-ацетокси-прегна-1(2),4,9(11),16(17)-тетраен-3,20-дион 228
4.6 Биотехнологические методы получения стероидов андростанового и прегнанового ряда 231
4.6.1 Разработка биотехнологического способа получения тестостерона из ситостерина 231
4.6.2 Биотехнологии получения АД, АДД, 9-ОН-АД 234
4.6.3 Биотехнологические методы получения 1 (2)-дегидроаналогов стероидов прегнанового и андростанового ряда 236
Заключение 239
Выводы 244
Список цитированной литературы
- Дегидрирование
- Взаимодействие клеток актинобактерий с гидрофобными стероидными субстратами
- Получение мутантных штаммов микобактерий, продуцирующих 9-ОН-АД
- Сопоставительный анализ 17-ОН-СДГ активности штаммов Mycobacterium и Rhodococcus
Дегидрирование
Для обеспечения высокой скорости гидроксилирования ситостерина при С27 необходимо значительное количество растворенной двуокиси углерода, которая легче, чем бикарбонат-ион, транспортируется через бактериальную мембрану. В связи с этим, большое значение при погруженном культивировании имеют аэрация и вентилляция, обеспечивающие оптимальный уровень двуокиси углерода и адекватное снабжение кислородом в течение процесса ферментации (Szentirmai, 1990).
За карбоксилированием следует отщепление обоих пропионил-SCoA с образованием соответствующих холенил-SCoA производных. Первый пропионил-SCoA удаляется ретроальдольной реакцией, образование второго пропионил-SCoA катализируется ацил-БСоА-тиофоразой и Р-кетотиолазой. Следующий ацетил-SCoA образуется по механизму Р-окисления. Конечная реакция расщепления боковой цепи, которая может удалить последний пропионил-SCoA, не отличается от первой реакции расщепления боковой цепи. В обоих случаях а-атом пропионовой кислоты ковалентно связан со вторичным углеродным атомом насыщенной углеводородной цепи. Однако, структурные позиции двух вторичных атомов углерода значительно различаются. В случае последней реакции этот вторичный атом является частью пятичленного цикла, который связан с насыщенной фенантреновой структурой, а в случае первой реакции расщепления ретроальдольной реакции способствует бикарбонатная структура.
Активность ферментов р-окисления зависит от химической структуры субстрата, -активность ацил-БСоА-дегидрогеназы и еноил-гидратазы значительно ниже возле стероидного ядра, чем на терминальном конце боковой цепи стерина.
Эффективность отщепления боковой цепи уменьшается при увеличении длины боковой цепи или разветвлении при С-24. Разница в 1-2 атома в "разветвлении" незначительно влияет на эффективность отщепления. При сравнении деградации алифатических боковых цепей ситостерина и стигмастерина, а также кампестерина и эргостерина был установлен депрессирующий эффект А 2( - связи (Nagasawa et al., 1970 а, б).
Продукты неполного окисления боковой цепи, в основном, С24- или Сгг-стероиды частично экскрецируются из клетки в виде свободных биснорхоленовых кислот или их восстановленных производных. Считается, что SCoA-эфиры этих соединений гидролизуются в клетках тиолэстеразой, когда внутриклеточный метаболизм нуждается в CoA-SH для важных катаболических реакций, а образование восстановленных соединений - это наиболее легкий путь окисления НАДН до НАД+ при недостаточной активности дыхательной цепи. Деэтерификацияя осуществляется в цитоплазме, а тиофораза, катализирующая секрецию свободных спиртов или кислот, у Mycobacterium связана с мембраной.
Экскрецированные из клетки свободные биснорхоленовые кислоты или их восстановленные производные далее не конвертируются. Эти соединения являются побочными продуктами при получении андростенов. В то же время химическая структура многих из них обеспечивает их практическое применение. Описаны мутантные штаммы, способные продуцировать биснорхоленовые соединения из стеринов в качестве основного продукта трансформации, например, 20-карбоксипрегнен, 20-гидроксиметилпрегнен, 20-карбокси-17(20)-дегидропрегнен и др., запатентован метод получения прогестерона из 20-гидроксиметилпрегнена (Weber et al., 1992).
В общей сложности, в деградации боковой цепи ситостерина участвуют, по меньшей мере, 9 катаболических ферментов, осуществляющих 14 ферментативных реакций. Суммарно при окислении одной молекулы ситостерина образуются 3 молекулы пропионил-SCoA, З ФАДН2, З НАДН и одна молекула уксусной кислоты. Метаболизм пропионатов и ацетата дает еще 18 молекул НАДН и 7 - ФАДЩ С учетом транспорта электронов и общего метаболизма при окислении ситостерина образуются более 80 молекул АТФ.
Лимитирующим фактором процесса считают скорость регенерации кофакторов. Однако некоторые физиологические проблемы могут быть связаны с образованием пропионата. Это токсичное соединение выделяется при карбоксилировании образующегося пропионил-SCoA до метилмалонил-SCoA, который далее конвертируется до сукцинил-SCoA за счет последовательного действия эпимеразы и мутазы. Метаболический путь может быть индуцирован пропионатом, но, в гораздо большей степени, - пропионил-SCoA. Образование метилмалонил-SCoA увеличивалось в присутствии двуокиси углерода (до 1%) (Szentirmai, 1990).
Показано, что окисление боковой цепи ингибируется АДД, который в значительной степени также репрессирует дыхание бактериальных клеток. Его удаление из реакционной среды, например, за счет связывания с полимерными носителями типа XAD, Amberlite ЕР60 и др. способствовало увеличению производительности процесса (Horhold et al., 1987; Szentirmai, 1990; Reiche et al., 1992; Lee, Liu, 1992; Smith et al, 1993). Штамм Mycobacterium sp. NRRL B-3683 инактивировался при добавлении в среду даже небольших количеств экзогенного АДД, а при добавлении 1 г/л оставалось лишь 3.6% жизнеспособных клеток (Perez et al., 2003). Хотя данных об ингибиторном действии АД на актинобактерии в литературе не найдено, такой эффект можно предположить на основе данных, известных для других организмов. АД подавлял дыхание, потребление глюкозы и рост Saccharomyces cerevisiae (Ахрем, Титов, 1970). Экзогенный АД ингибировал рост Schizosaccharomyces pombe, влиял на деление клеток и стимулировал образование аберрантно раздутых клеток (Dlugonski, Wilmanska, 1998).
Легко окисляемые соединения, такие как А4 и А14 - прогестерон, блокировали биоконверсию ситостерина неиндуцированными клетками. Очевидно, причиной являлась конкуренция за центр связывания С27-гидроксилазы, ответственной за начальный этап деградации боковой цепи. При этом фенобарбитал (индуктор микросомальной оксигеназы) не оказывал влияния на процесс (Nagasawa et al., 1970 а, б).
Окисление стеринов актинобактериями может происходить одновременно с двух различных частей молекулы стерина. С одной стороны может происходить деградация боковой цепи при Си независимо от модификаций кольца А, с другой стороны - 3(3-ол-5-ен-структура стероидного ядра может быть трансформирована в З-кето-4-ен систему, и образующийся З-кето-4-ен-стероид (стеной) подвергается дальнейшей ферментативной атаке (Рис. 7). Модификация З -ол-5-ен- в 3-кето 4-ен-стууктуру
Анализ литературных данных позволяет заключить, что первичная микробная атака на стерины у большинства описанных стеринокисляющих бактерий сфокусирована на 3-гидроксиле. Окисление 3-ОН-группы, как правило, сопровождается Д5-»Д4 изомеризацией. В зависимости от структуры боковой цепи используемого субстрата, -холестерина, ситостерина, стигмастерина, в качестве интермедиатов образуются 4-холестен-3-он, 4-ситостен-З-он или 4-стигмастен-З-он, соответственно, а также соотвтствующие З-кето-4-ен-стероиды с частично или полностью окисленной боковой цепью. Образующийся З-кето-4-ен-стероид предположительно участвует в связывании с клетками и ферментной системой деструкции стероидного ядра и боковой цепи. Химическая защита 3-го положения стеринов позволяла в ряде случаев предотвратить деструкцию стероидов. Деструкция стероидного ядра
Взаимодействие клеток актинобактерий с гидрофобными стероидными субстратами
Однако, увеличение растворимости стероидов или стеринов с использованием перечисленных методов не всегда коррелировало со скоростью потребления субстрата. Установление этого факта дало толчок к более пристальному изучению механизма взаимодействия стеринового субстрата с клетками актинобактерий.
Представления о взаимодействии гидрофобного субстрата с клетками биокатализатора сводятся к двум основным идеям: 1) потребление субстрата происходит через солюбилизацию (молекулярное диспергирование) или через псевдосолюбилизацию (мицеллообразование) независимо от причины солюбилизации или псевдосолюбилизации; 2) потребление субстрата происходит путем прямого контакта между клеткой биокатализатора и поверхностью микрокристалла субстрата (Goswami et al., 1994; Hosel, 1981; Cameotra et al., 1983). Механизм взаимодействия стероидов с клеточной поверхностью актинобактерий наиболее подробно изучен для микобактерий.
Как известно, микобактерий отличаются от других бактериальных организмов необычным строением клеточной стенки (КС) (Draper, 1984; Bendinger et al., 1993). Основной скелет состоит из пептидогликана IV типа, который ковалентно связан с миколиларабиногалактаном и липоарабиноманнаном (Brennan, Nikaido, 1995). Он покрыт асимметричным липидным бислоем, который не связан ковалентно с арабиногалактаном/пептидогликаном (Minnikhin, 1982; Nikaido, Jarlier, 1991; Chatterjee, 1997). Внутренний слой этого бислоя состоит из плотно упакованных миколовых кислот, направленных перпендикулярно к арабиногалактану/пептидогликаиу. Он обладает очень низкой текучестью и связан с арабиногалактаном. Миколовые кислоты этого слоя
ПредСТаВЛЯЮТ Собой преимущественно разветвленные КИСЛОТЫ С ДЛИННОЙ (С40"Сбо) и короткой цепью (С22-С24), содержащие относительно мало двойных связей или циклопропановых группировок. Внешний слой бислоя представлен экстрагируемыми липидами — фосфолипидами, гликолипидами, пептидолипидами и микозидами. КС содержит до 60% липидов, что определяет ее высокую гидрофобность, низкую проницаемость для многих соединений, множественную устойчивость к лекарственным препаратам, в том числе, антибиотикам, и обеспечивает относительно медленный рост микобактерий вследствие низкой скорости поступления питательных веществ, высокую степень адгезивности клеток, образование клеточных агломератов (Jarlier, Nikaido, 1994; Borrego, et al., 2000).
Кроме того, как было показано для некоторых патогенных микобактерий и роственных организмов, клеточные агрегаты или одиночные клетки могут быть окружены капсуло-подобной структурой, состоящей из полисахаридов, белков и липидов и образующей так называемый "core-factor". Например, капсулы М. tuberculosis содержат олигосахариды (30-55%), белки (55-40%о) и липиды (5-8%). В лабораторных условиях микобактерий обычно культивируют при быстром перемешивании и в присутствии детергентов, что приводит к разрушению капсулы. Капсулоподобные структуры обычно представлены электронопрозрачными зонами, окружающими КС, и их идентификация обычными методами электронной микроскопии проблематична. Данных о наличии и структуре капсулоподобных структур сапрофитных непатогенных микобактерий в литературе не найдено. Имеются лишь упоминания о том, что возможны различия в их строении у медленно и быстрорастущих микобактерий (Jarlier, Nikaido, 1994).
Строение, липидный состав и свойства КС актин о бактерий зависят от физиологического состояния культуры и условий культивирования (температуры, источника углерода, азота, и т.д.) (Ratledge, 1982; Lacave et al., 1990; Reddy et al., 1992). Например, клетки, растущие на глицерине или фруктозе, были более гидрофобны в сравнении с растущими на глюкозе (Borrego et al., 2000).
Описаны три возможных пути поступления органических молекул в микобактериальную клетку. Водорастворимые питательные компоненты и небольшие гидрофильные соединения проникают через заполненные водой каналы (поры), состоящие из порообразующих белков, как это было описано на примере М. chelonae и M.smegmatis (Trias et al., 1992). Второй, так называемый "липидный" путь используется в основном для гидрофильных соединений, а третий, - "self promoted uptake" обычно обеспечивает поступление поликатионов и аминогликозидов (Trias, Benz, 1994).
Стероиды могут проникать через КС с помощью "липидного" пути. Предполагают, что они растворяются в липидном домене и перерастворяются в водной фазе вне клетки (Nikaido, Jarlier, 1991). При этом липидный бислой, как и другие составляющие КС, могут представлять значительный барьер для проницаемости этих незаряженных соединений. 2.4.2. Взаимодействие актинобактерий со стеринами
Атрат с соавт. изучали механизм потребления стеринового субстрата с использованием в качестве модельного объекта культуры М. fortuitum, трансформирующей ситостерин в 9-ОН-АД (Atrat et al., 1991). Было показано, что клетки агрегируют с поверхностью частиц субстрата, образуя стабильные агломераты, т.е. происходит так называемая "иммобилизация клеток на частицах субстрата". Потребление субстрата и образование продукта изучались в работе в зависимости от размеров частиц стерина. Максимальная скорость потребления была отмечена для частиц субстрата размера, сопоставимого с размером клетки (менее 5 мкм), обеспечивающего максимальную поверхность контакта с микобактериальной клеткой. После механического соизмельчения субстрата с клетками наблюдалось значительное увеличение образования продукта. Изучение клеточно-субстратных агломератов методом электронной микроскопии (замораживание-скалывание) показало, что клетки врастают в микрокристаллы субстрата. Потребление субстрата идет через прямой контакт между клетками и частицами субстрата. На основании полученных результатов была предложена модель взаимодействия стерина с клетками микобактерий, согласно которой, в зоне контакта частицы стеринового субстрата с клеточной поверхностью микобактерий имеется многокомпонентная подвижная мезофаза - FMCM (рис. 8). Ее функция состоит в постепенном растворении стерина, запуске механизма его потребления и транспорта в клетку. Движущей силой при этом является градиент концентрации стерина через мезофазу и клеточную оболочку (Atrat et al., 1991). Предположительно, мезофаза может состоять из гликолипидов, экстраклеточных биолипидов, синтетических детергентов, стерина и воды.
Для Rhodococcus sp. было показано, что процессы транспорта усиливаются каналами, состоящими из стероидсвязывающих или стероидтрансформирующих белков, соединяющих цитоплазму с клеточной поверхностью (Wagner et al., 1992; Atrat et al., 1991). Определенную роль в стимуляции транспорта могут играть внеклеточные ферменты, такие как ХО, которая у Rhodococcus sp. связана на поверхности с гликолипидными структурами.
Эти результаты соответствуют данным, описанными для A. simplex (Rajkhowa et al., 2000). При росте в присутствии ситостерина наблюдалось образование белка (19 кДа), псевдосолюбилизирующего стерин. Ранее сообщалось о выделении стеринсвязывающих факторов из дрожжей (Thompson, et al., 1973), а также углеводород-солюбилизирующих факторов из бактерий (Goswami, et al., 1994). Скорость псевдосолюбилизации стерина белком из A. simplex была в 14 раз ниже скорости потребления стерина при нормальном
Получение мутантных штаммов микобактерий, продуцирующих 9-ОН-АД
Анализ проводили на газовом хроматографе (Phillips, Pyl—4400М1) с пламенно-ионизационным детектором в режиме температурного программирования. Температура инжектора составляла 340С, детектора - 350С, колонки - от 80 до 320С. Использовали капиллярную колонку 30мх0.22 мм, неполярная фаза - OV-101 (фирма Витохром-М, Москва). 10 мг лиофильно высушенных образцов клеток и бесклеточной культуральной жидкости гидролизовали в 3 М трифторуксусной кислоты при 105С в течение 3.5 ч в стеклянных предварительно продутых азотом и запаянных ампулах. Кислоту отгоняли при пониженном давлении.
Боратные комплексы углеводов (Schimz et al., 1985) анализировали на колонке ДА-Х8-11 на углеводном анализаторе LC 2000 (фирма LKB, Швеция). Для детекции использовали натриевую соль 4,4-2,2-бискарбоксибихинолина. Измерение адсорбции проводили при 570 нм. Содержание отдельных Сахаров рассчитывали по методу абсолютной калибровки.
Для определения концентрации общего белка в культуральной жидкости
образцы супернатантов S и SM концентрировали до 1.2 мл с использованием картриджей Centricon Plus-20. Белок определяли по Брадфорду (Bradford, 1976) с БСА в качестве стандарта. Активность внеклеточной 3-СО определяли как описано выше (п. 3.6.1).
Образцы, содержащие бактериальные клетки, отмывали трижды Na-фосфатным буфером (рН 7.2) и фиксировали 1.5%-ным раствором глутарового альдегида в 0.05 М какодилатном буфере (рН 7.2). В отдельных экспериментах раствор содержал дополнительно 0.075% (вес/объем) рутения красного. Затем образцы промывали троекратно тем же буфером (в отдельных экспериментах - с рутением красным той же концентрации) и фиксировали 1% -ным раствором OsC в 0.05 М Na-какодилатном буфере (с рутением красным). После фиксации образцы обезвоживали в серии этанольных растворов возрастающей концентрации и заключали в смолу Ероп 812 или Spurr. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-2128, дополнительно контрастировали уранилацетатом (2%-ный раствор в 70%-ном этаноле) или уранилацетатом с последующим дополнительным окрашиванием цитратом свинца по
Клеточно-субстратные комплексы осаждали мягкой седиментацией (без центрифугирования). Отбирали каплю образца, помещали между тонких медных держателей и замораживали в жидком пропане. Замороженные образцы скалывали при -70 С в вакууме ( 10"7 атм"1). Сколотые образцы травили при -100С в течение 3 мин при 1.3x10 атм", затем реплицировали платиной-углеродом и покрывали углеродной пленкой ( 20 нм). Реплики отмывали в течение ночи хромпиком, промывали дистиллированной водой и просматривали в электронном микроскопе JEM-100В (JEOL, Япония).
Насыщение растворов ЦД стероидами проводили при 30 С. Избыток стероида вносили в виде тонко дисперсного порошка в 1.5 мл раствора ЦД (0.7 - 15 мМ) в пробирки Eppendorf (Германия) объемом 2 мл, термостатировали при энергичном встряхивании в течение 5 сут. Растворы фильтровали в термостатированном режиме в патронах для фильтрации (0.45 мкм, Durapore (фирма Millipore, США). Фильтрат разбавляли смесью ацетонитрила в воде (50/50 (об/об) в соотношениях от 1:5 до 1:400. Стероиды анализировали методом ВЭЖХ, как описано ниже (п. 3.13.2).
В работе использовали растворы МЦД с концентрациями: 0, 5, 10, 15, 20, 25 мМ. Для получения насыщенных растворов избыток стероида (2 г) вносили в плоскодонные колбы объемом 500 мл, содержащие 100 мл раствора МЦД. Полученные суспензии выдерживали при 30 С на качалке в течение нескольких суток. После этого суспензии фильтровали при 30 С, пробы разбавляли этиловым спиртом в объемном соотношении 1:1. Оптическую плотность растворов определяли после 200-кратного разведения на спектрофотометре "Specord М 40" при 242 нм.
Растворимость стероида в воде (So) определяли прямым измерением концентрации стероида после насыщения водных растворов при 30 С. Константы стабильности комплексов стероидов с ЦД (Ks) определяли по методу Higushi (Higushi, Connors, 1965) с использованием уравнения Ks = tg (а) / So (1 - tg (а)), где а - угол наклона прямой фазовой диаграммы растворимости стероида в ЦД растворе.
Для определения Ks также использовали разработанный нами спектрофотометрический метод с применением красителя - метилового оранжевого. Метод основан на том, что краситель образует с МЦД растворимый комплекс включения, а введенный стероид вытесняет краситель из ЦД полости. Изменение концентрации свободного, вытесненного из МЦД полости, красителя фиксировали спектрофотометрически при 505 нм. Значение Ks определяли на основании нелинейного обсчета кривых зависимости адсорбции раствора красителя от концентрации МЦД в системе без стероида и при вытеснении красителя из комплекса стероидом и рассчитывали с использованием пакета компьютерных программ.
Стероиды экстрагировали этилацетатом, экстракт упаривали до 2-3 мл. Для выделения и очистки индивидуальных стероидных соединений использовали препаративную ТСХ и колоночную хроматографию с использованием препаративных ТСХ пластинок Merck Kieselgel 254 и колонки (16 х 450 мм) с силикагелем 60 Merck, 0.040-0.063 мм). Элюцию осуществляли с применением смеси гексан - этилацетат в различных соотношениях. Хроматографическую чистоту соединений контролировали методами ТСХ, ГЖХ и ВЭЖХ.
ТСХ: стероидные соединения экстрагировали этилацетатом, аликвоты наносили на пластины для ТСХ Silufol UV254 (Чехословакия), Kieselgel 60 F254 (Merck, Германия) или Sorbfil (Россия), хроматографию проводили в системе бензол:ацетон 3:1 (об/об) или бензол : этилацетат : ацетон (1:1:1, v/v/v). Визуализацию 3-гидроксистероидов (стеринов, ДГЭА и их производньк) осуществляли окрашиванием пластины 10%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты. 3-Гидроксистероиды проявлялись как окрашенные голубые или синие пятна.
Визуализацию 3-кетостероидов осуществляли на хемископе Desaga HP-UVIS (Германия) в УФ-свете при 254 нм. В качестве свидетелей использовали высокоочищенные стероидные соединения Для количественной оценки индивидуальные соединения элюировали с пластинки этиловым спиртом, количество стероида определяли на спектрофотометре Specord-M-40-UV VIS (Германия).
Сопоставительный анализ 17-ОН-СДГ активности штаммов Mycobacterium и Rhodococcus
Как указывалось выше, максимальный уровень 3-КСД активности был отмечен для представителей рода Nocardiodes. В качестве модельного субстрата при сравнительной оценке 3-КСД активности различных штаммов этого рода использовали гидрокортизон (5 г/л). Как видно из Табл. 9, только штамм Nocardioides sp. ВКМ Ас-806 и штаммы N. simplex были способны к 1(2)-дегидрированию гидрокортизона с образованием преднизолона, при этом максимальная активность, проявленная штаммами N. simplex ВКМ Ас-1118 и N. simplex ВКМ Ас-925, значительно (более чем вдвое) уступала активности штамма N. simplex ВКМ Ас-2033Д.
В доступной научной и патентной литературе отсутствовали упоминания о представителях рода Nocardioides в качестве биокатализаторов процессов биоконверсии стероидов. Возможно, данная ситуация является следствием того, что род Nocardioides выделен и описан сравнительно недавно (Prauser, 1976). С 80-х годов активно проводятся работы по ре-идентификации штаммов, ранее преимущественно отнесенных к роду Arthrobacter. Не исключено, что применение современных таксономических критериев позволит отнести некоторые организмы, известные высокой 3-КСД активностью, к роду Nocardioides, аналогично тому, как использованный в данной работе штамм, ранее отнесенный к роду Arthrobacter, был ре-идентифицирован нами как Nocardioides и задепонирован в коллекции культур ВКМ ИБФМ РАН как N. simplex ВКМ Ас-2033Д (Фокина с соавт., 2003).
Сравнение 17-ОН-СДГ активности штаммов проводили с использованием в качестве субстратов АД и АДД (1 г/л). Среди 10 тестируемых штаммов Rhodococciis культуры R. erythropolis ВКМ Ас-1164, R. coprophilus ВКМ Ас-571, R. fascians ВКМ Ас-1169, R. rhodochrous ВКМ Ас-1284, Rodococcus spp. ВКМ Ас-1153, SIMT-105 и ВКМ Ас-1151 были способны проводить восстановление 17-кетогруппы. Максимальная 17-ОН-СДГ активность была отмечена для Rhodococciis spp. SIMT-105 и Ас-1151: концентрации Т при трансформации АД и ДТ при биоконверсии АДД составили 0.02-0.04 мМ и 0.06-0.08 мМ, соответственно.
Все оцениваемые культуры Rhodococciis проводили 1(2)-дегидрирование АД, что говорило о наличии у них 3-КСД активности. Наличие 9а-гидроксилазпой активности было обнаружено для штаммов R. equi ВКМ Ас-953, R. rhodochrous ВКМ Ас-1284 и Rhodococciis sp. MTS-77.
Штаммы R. equi ВКМ Ac-953, R. fascians ВКМ Ас-1169, Rhodococcus sp. ВКМ Ac-1186 полностью утилизировали АД за 120-130 ч, а при использовании R. rhodochrous ВКМ Ас-1284 и Rhodococcus sp. ВКМ Ас-1151 скорость конверсии АД была низкой.
Из тестируемых культур микобактерий способность осуществлять реакцию 170-восстановления была отмечена для Mycobacterium spp. ВКМ Ас-1815Д, 1816Д, 1817Д. Выход Т из АД и ДТ из АДД составил 0.05-0.2 мМ и 0.4-0.7 мМ, соответственно. Штамм Mycobacterium sp. ATCC-3683 проводил преимущественно дегидрирование АД по положению 1(2).
Анализ полученных данных свидетельствовал о максимальном уровне 17-ОН-СДГ активности у штаммов Mycobacterium spp. ВКМ Ас-1815Д и 1816Д.
Как отмечалось выше, максимальный уровень образования 3,17-дикетоандростенов при инкубации с ситостерином был отмечен для штаммов Mycobacterium spp. 1815Д, 1816Д и 1817Д. Наряду с АД, АДД и 9-ОН-АД, образующимися в качестве основных продуктов из ситостерина, в среде были обнаружены другие стероидные соединения. Их идентификацию проводили методами ТСХ/ВЭЖХ/МС (Табл. 10).
Как видно из Табл. 11, культуры Mycobacterium spp. 1815Д и 1816Д окисляли различные стерины, в том числе замещенные в положении 3, с образованием АД и АДД, соответственно, в качестве основных продуктов трансформации. Холестерин и ситостерин конвертировались практически полностью и с сопоставимой скоростью. Эргостерин являлся более трудно трансформируемым субстратом: к 140 ч инкубации его остаточная концентрация составляла от 10 до 25% (Табл. 11). Замещение стерина по 3-му положению не приводило к существенному изменению состава образующихся продуктов, но значительно замедляло реакцию при более низкой степени конверсии. При этом образования 3-эфиров 17-кето-5-ен-стероидов не отмечалось. Очевидно, что начальным этапом трансформации использованных стериновых производных являлась их деэтерификация.
Образец СКАМа представлял собой плотную темно-коричневую гидрофобную аморфную массу, коагулирующую в воде. Для обеспечения его дисперсии перед инокуляцией культуры образец эмульсифицировали со стеклянными шариками в присутствии Tween 80, однако, и в этом случае накопление 9-ОН-АД наблюдалось лишь после 300-350 ч инкубации. Его максимальный выход из 21.4 г/л СКАМа достигал 1 г/л, что соответствовало мольному выходу 45 % из 3 г/л стеринов (Табл. 13). Относительное содержание минорных стероидных продуктов соответствовало полученным при трансформации высококачественного коммерческого ситостерина (Табл. 14).
Увеличение содержания СКАМа свыше 21.4 г/л замедляло его биоконверсию. При этом поверхность среды была покрыта маслянистой пленкой, и наблюдалось образование крупных комков, представляющих собой агломераты СКАМа с клетками.
Для увеличения поверхности контакта клеток с субстратом и предотвращения агломерации СКАМа мы сорбировали его на макропористом полиуретановом носителе (препарат S, п.3.1.2). При его использовании следовые количества 9-ОН-АД были обнаружены уже после 72 ч инкубации с клетками Mycobacterium sp. ВКМ Ас-1817Д. После 336 ч инкубации мольный выход 9-ОН-АД составил 42.3 % (Рис. 18).
Помимо стеринов СКАМ содержал другие компоненты, вероятно, остаточные триглицериды, жирные кислоты или спирты. Мы предположили, что утилизация культурой этих нестериновых компонентов СКАМа конкурирует с целевым процессом окисления боковой цепи стеринов. Вероятно, в течение длительного лаг-периода (Табл. 12) липофильные компоненты скама постепенно потребляются микобактериями, и по мере их исчезновения начинается трансформация стеринов. Для проверки этого предположения мы попытались удалить эти неидентифицированные компоненты микробиологическим и химическими методами (Рис.16).
Получение препарата М из СКАМа было основано на применении метода накопительных культур (п. 3.1.2). Как показано на рис.18, лаг-период биоконверсии препарата М сократился почти вдвое в сравнении с использованием исходного (необработанного) образца СКАМа. Мольный выход 9-ОН-АД достиг 34.4 % уже через 300 ч инкубации культуры Mycobacterium sp.BKM Ас-1817Д с препаратом М и затем медленно увеличился до 41.3 % к 600 ч.
Полученные результаты подтвердили предположение о том, что процесс окисления боковой цепи стеринов тормозится нестероидными липофильными компонентами СКАМа. Вероятно, их утилизация дикими микроорганизмами в процессе микробиологической предобработки делала стерины более доступными для микобактерий. Эксперимент показал, что для обогащения стеринами фракций промышленных отходов могут быть применены микробиологические методы. Сведений о возможности использования микроорганизмов для этих целей в доступной литературе не найдено.
