Введение к работе
Актуальность темы. Использование ферментных систем микроорганизмов в сфере химических, биотгхнологичесхих и фармацевтических производств нашло ухе давно свое промышленное применение, в частности при производстве стероидов и антябнотвхпв. .
Однако, в значительно меньшей степени иосявдовзнн процессы микробиологических превращений более простых органачесхнх соединений и, в частностигааотнстта гетсроцнклов. Это связано с тих. что маогле соединения этого класса' обладают зысохой тоасичностыо по отношению к михро-ергЕНиамям.
Меаду тем, Есследоззнне процессов мпхробвелогггкехюй трансформации азотистых гетероцшогов предсяазлпется чрезвнгсайвэ перспективным, поскольку, такие процессы протекают в мягких условиях, строго регио-мгецифичпо и стереоселсктввно.
Среди разнообразных химических превращенгй ергвнеткгаос соедзие-ггга одним Ез вгннеййЕХ халггтея процесс их окислення, в частноста,введе-ния в молекулу' гндрозіяльной грушгк.
ГидроЕгтиккрсаааиа азотосЕїггащах гек.роцихэкг» цредстакикт боль-rscu пргвггчесжй їізероедїосгяльку погволдег з одну стедвю залучить я2* нззестпыг, vnz и шгсьж, Я(ягечстзгннЕг лрепераяы.
Дельтп аясюцкггй гкботц жилось изучение глщюйгеюгаческой трансформаций серил коно- п Еолициклзчсянх вготсодертшдих гетероцикли-чесхях совдикензй, мало ксследозанкых до настоящего времгни, а такке noscE еозых штаммов иккрсорганЕзиот, стэгебных осуществлять такие реагцЕИ. Нараду с этим было .'гатересно аыоекгаь пепракжкпе прогекргня процесса в зааненмесгл от cracca соединения н пожат мнкреоргзппзма.
ііп-учвяя KQBEJFa. В результате прекдекасто скрининга иуэкйпых штаммов, я така» спзммов, выделенных автором пз природных источнкксв, еыезлово 15 грибов, обладающих гдзроггглвружяцгми етейсшама по отяо-
шеиию х 2-этзшшрндану. Из них шесть штаммов гядрохскпаровали метиленовую (-CHj-)-rpynny 2-этилпвридина. Пять штаммов из шести: Aspergillus awamori ВКМ F-758, Aspergillus niger ВКМ F-1119, Beauveria bassuma ВКМ F-ЗПІД, CurminghameUa vertkUlata ВКПМ F-430, PemcUlium simpti-cissimum KM-16 - это грибы, ранее не исследованные в данном направлении. Три последних из пяти перечисленных штаммов были выделены автором из природных нсточшпшв.
Наибольшей гидрокешгаругощей активностью по отношения к 2-этил-пврадияу обладал грнб Beauveria bassiana АТСС 7159, который превращал этот субстрат в оптически чистый (-)-2-(1-гидроксиэтад)гшридан с препаративным выходом 29,7%.
При трансформации 1-бензоилшшгридииа исследованными штаммами были получены 3- и 4- гидрокешпхшзводные (причем 4-гадроксн-производное было получено с препаративными выходами), которые являются исходными веществами в синтезе ценных лекарственных, и косметических средств.
При трансформации 1-бевзоилшрролидина грибом Cunninghamella verticiUata ВКПМ F-430 с выходом 38,2% был получен оптически »«тшшнй (-)-1-бензоил-3-1ИдроксЕширролндин, который является циклическим аналогом 7-аынно- р-гадродишясттой кислоты, н твезеб макет быть использован
ТТрэттичватя значимость. Выявлено пять активных штаммов грибов, способных эффективно рано- и стереосслекгивво гядрохеилировгхь насыщенные атомы углерода пяти и шестичленних азотесдерхащих гетероцихлов. Подобраны условна проведения процесса с целью получения продуктов трансформации в препаративных количествах.
Результаты исследования трансформации яніиінсиїтивпт препарата "Димебон", а также аналога лекарственного препарата "Такрин"- 9-амино-
5 1,2,3,4,5,6,7,8-оггагадроаЕридЕка могут представлять существенный интерес для фармакологов кис модели метаболизма дянтга» соединений в организме человека.
Публнкчиии, По моериалам диссертации опубликовано 11 работ.
Обіем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов, а таске результатов исследования, обсуждения результатов, выводов к списка цитируемой литературы, включающего 127 библиографических ссылок. Материалы диссертации изложены ва 12± страницах машинописного текста, содержат 10 таблиц и 15 рисунков.
Атробапия работы. Основные положения работы доиадывались на 20-й конференции молодых ученых биологического факультета МГУ (Москва, 1989), ва Втором республиканском совещании но асснмэтричесхЕМ реакциям (Телави, ГССР, 1989), на Бессоюзном семинаре по химии физиологически штатных соединений (Черноголовка, 1989), ва V Всесашзной конференции по химии еготсадеряащЕх гетероцпглнческнх соединений (Черноголозга, 1991), а таксе на яяггдгегпт гафгдры микробиокожи биологического факультета МГУ (1992).
Материалы и методы исследования
Сбьеггамя исследования слусил ряд музейных штаммов грибов, а такая несколько штаммов грибов выделенных автором из природных ксточ- ников.
Грибы: AspersUha niger ВКМ F-IH9, Asper&iUus amamori (ВКМ F-
' 746, ВКМ F-437, ВКМ F-758), AspergiUus tsrreus BKMF-I025, Fasarium
salad BKM F-102I, Paecilomyces .variotii BKM F-378, Scopzlariopsis brevi-
caulis BKM F-4Q6, Chaetcmian gleboswn BKM F-IQ9, Beazveria kasssuma
BKM F-2533 (АТСС 7159), Beauveria bassitaa (BKM F-72, BKM F-73, BKM F-75) были получены вз Всесоюзной коллекция микроорганизмов ИВФМ АН СССР, грибьс Aspergillus атгтогі (ВКПМ F-203 и ВКПМ ВУД Т-2) были получены нз ВКПМ ВНИИ Генетики, культура Beauveria bassiana 1 аз коллекции ВНИХФИ ям. СОрдконикидэе. Культура гриба AspergiUus nigsr NRRL 322S была получена нз коллекции Северных региональных лабораторий США.
Ряд грибов, представителей родов Aspergillus, Beauveria, РепкШшт, Rhizopus и Cun/iinghamella были выделены автором из окружающей среды в определены как: Aspergillus sp. (1 - 10), Aspergillus nigsr КВ-30, Beauveria bassiana BKM F-ЗПІД, Cwminghamella vertkulata ВКПМ F-430, Rhizopus sp. 11, PenicUlucn simplicissimiau KM-16*.
Микроорганизмы поддергивали на твердых средах следующего состава:
Среда N1 для поддерхання культуры В. bassiana BKM F-2533 (АТСС 7Ї59) и С vertidUata ВКПМ F-430 (г/л): глюкоза - 20,0; пептон - 10,0; агар-агар - 20,0; вода водопроводная; рН 5,0
Среда N2 для поддериання культуры . bassiana BKM F-ЗПІД (г/л): глюкоза - 10,0; кукурузный экстракт - 20,0; агар-агар - 15,0; иода водопроводная; рН 5,0.
Все остальные культуры мнкрескогшческнх грибов поддергивались на 3-4 баллинговом агариэоганвом сусле.
Для проведення реакции трансформации использовали жидкие среды следующего состава: -
* Выражаю сердечную благодарность сотруднику кафедры шншии растений биологического факультета МГУ Т.П.Сизовой за оказанную помощь в определении грибов.
Среда N3 (г/л): ппзгоза - 10,0; кукурузный экстракт - 20,0; вода водопроводная; рН 5,0.
Среда N4 (г/л): глюкоза - 20,0; кукурузный экстракт - 10,0; пептон -5,0; КН2ГО4 - 5,0; вода водопроводная; рН 5,0.
Среда N5: среда Чапека-Докса, с добавлением 5,0 г/л пептона, рН 5,0.
В качестве субстратов для трансформации использовали соединения, синтезированные на химическом факультете МГУ, такие как: 2-'этялгшридин (Dt 1-бензоилгшперидин СО. 1-бензоилпнрролидин О, 1-бензоилпир-ролядон-2 (4), 3,6^даіяяїіл-9-[2-(2-кстилпнридил-5)зтил]-1,2,3,4-тетраіидро-у-карболин дигидрохлорид СДпмебон") (5J.
В качестве субстрата использовали также синтезированный во Всероссийском научно-исследовательском центре безопасности биологически активных веществ (ВНЦ ЕАВ) аналог лекарственного препарата Такрин" - улучшающего память - 9-амино-1ДЗ,л,5,б,7,8-оЕтагядроакрндЕН .
Кулмуры грибов инкубировали на твердой среде в течение 10-14 суток (до обильного шорзнопжЕвя) при 28*С Затем проводила смыв спор с пс-верхностн среды 5 мл стерильной водопроводной воды я иЕскуяят переносили в колбу объгмси 753 мл, содержащую 100 мл питательной среды.
Микроорганизма вырящзвзли в течение 24-48 «еесоз га круговой качалке (200-220 оборотов в минуту) при 2РС и полученную биомассу использовали в качестве посевного материала, который вносили з среду в количестве 5 % (объемных). Даніє микроорганизмы выращивали такие на круговой качалке в колбах на 750 мл со ІС9 мл среды и затем проводили реакцию трансформации в растущей культуре или э суспензии неразмножающихся
ЮІЄТОК.
Субстраггы для трансформации добавляли в концентрации 50-300 мг/л.
Продукт трансформации извлекали ва чпауВятщонвой смеси методом
t. экстракцви горячим хлороформом в экстрнЕгоре яеяя тяхелых жидкостей в
течение 30 часов.
Выделение иядиді^щддитат продукта трвясфоркаїщи осуществляли с помощью флэш - хроматографии на колонке с еижикагелем (Sfficagel 40/100, Chemapol,4CCP) в громатографвгаесхих *^д" д»" """ ""й полярности.
Полученные соединения идентифицировала ва основании физико-химических и спектральних свойств: текнерваупы плавления, хроматогра-фической подвижности (Rj), гаэо-жидагхянай хроматографии (ГЖХ), высокоэффективной эоадкостной хроматографии (ВЭЖХ), ультрафиолетовых (УФ), инфракрасных (ИК) спектров и спектров щютонного магнитного резонанса (ПМР), ядерного магнитного резонанса ЇЯМР), а также анализа масс-спектральвого распада,