Введение к работе
Актуальность исследований,, направленных на решение вопросов идентификации и дифференциации риккетсий, определяется необходимостью совершенствования-методов контроля за риккетсиозами.
Инфекции, вызываемые риккетсиями, продолжают сохранять свое значение в инфекционной патологии человека. Среди них в силу потенциальной эпидемической опасности и зависимости от социальных условий цэнтралыюе полог:ение занимает эпидемический сыпной тиф. Вместе с этим начиная с 70-х годов, наблюдается активизация проявлений эндемических риккетсиозов, причины которой остаются невы-ясненныш. Практически одновременно увеличилась заболеваемость эндемическими риккетсиозами группы клещевой пятнистой лихорадки -пятнистой лихорадкой Скалистых гор в США, Средиземноморской лихорадкой - в Италии, Франции, Испании, Португалии.- При этом, чаще отмечается атипичное, более тяжелое течение Средиземноморской лихорадки (Grcss et al., 1982; Mansueto et al., 1986; Otero et al., 1982; Wlsseman, 1983). Обнаружены очаги клещевых риккетсиозов з неизвестных для них ранеа регионах, таких, как Япония, Израиль (Gross et al., 1982; Dchida et al., 1989). В начале.80-Х годов выявлен новый природный очаг клещевого рихкетсиоза на территории России в Астраханской области (Балаева и Игнатович, 1939; Макарова и Тарасевич, 1989). Возбудитель этого риккетсио-за, как установлено, серологически и генетически близок комплексу видов, родственных R.conorll (Drancourt et al., 1992). Наблюдается повышение заболеваемости и изменение локализации очаго» заболевания лихорадки цуцутамуши в Японии, а также смена штаммов циркулирующей популяции (Tainura, 1987).
Активизация проявлений эндемических риккетсиозов вновь вызвала интерес к их изучению. В связи с этим были начаты работы по выделению риккетсий в очагах клещевых ркккетснозов. В результате выделен ряд штаммов, отличающихся по своим биологическим и серологическим свойствам от типовых. Таким образом проблема идентификации и дифференциации' риккетсий приобрела новое значение. Достижения современной молекулярной биологии способствовали развитию новой методологии типироваїшп риккетсий, основанной на изучении структуры генома. Этот подход, базирующийся на анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментоз (АПДРФ) ДНК, включает такие методы, как рэстряхциснный анализ хромосомной и плаз-икдной ДНК, ДНК-зондирование и рестрикционный анализ продуктов амплификации с праймараил определенной специфичности в ПНР. Эти методы идентификации, как показали первые полученные данные, об-
ладают наиболее высокой чувствительностью по сравнению с известными на сегодняшний день в риккетсиологии биологическими и серологическими методами (Henirix et al., 1991; Regnery, 1990; Reg-nery et al., 1985; 1987; 1991; Tringali et al., 1987).
Имевшиеся к нзчалу настах исследований единичные сообщения, выполненные на небольшом количества штаммов, свидетельствовали о наличии структурных особенностей ДНК у иекоторах представителей риккетсий, но были недостаточны для их использования в целях ти-пирования (Regnery et al., 1984; 1985; 1987).
Разработанные нами приемы исследования хромосомной ДЕК рик-кетсий методом рестрикционного анализа п ДНК-зондарования предусматривали возможность изучения полиморфизма генома этих микроорганизмов и использования этого маркера для генотипичесхой идентификации риккетсий.
Исходя из - этого целью исследования являлось определение критериев идентификации риккетсий на основании анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК и типироза-ние риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки с использованием этих критериев.
Основные задачи исследования включали;
-
Изучение характера расщепления хромосомной ДНК риккетсий зндонуклеззани рестрикции к отбор зндонуклеаз рестрикции для проведения анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДЕК.
-
Сравнительное изучение полиморфизма длин рестрикционных Фрагментов ДЕК риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки с использованием набора штакмоз, различающихся по про-исховдетага и Отологический свойствам.
3. Изучение дифференциально-диагностической специфичности
набора ДНК-зондов, представляющих собой фрагменты ДЖ, несущие
как определенные геїш, так и случайные фрагменты ДНК
R.prowa2ekii.
1. Изучение генотипа неидентифицированного риккетсиального изолята, серологически относящегося к группа клещевой пятнистой лихорадки, с использованием предлокенных критериев типирования.
Исследование проведено с использованием коллекции Национального музея риккетсиозных культур, функционирующего на базе лаборатории молекулярной биологии и генетики рикккетоиа НИИЗМ им. Н.Ф.Гамалеи.
. Решению основных задач предшествовали работы но их методическому обеспечению, которые включали:
определение условий проведения электрофореза в агарознои геле для обеспечения оптимального распределения фрагментов рик-кетсиальной ДНК, расщепленной эндонуклеазами рестрикции;
отработку способа получения биомассы риккетсий из ограниченного количества биоматериала для целей изучения хромосомной ДНК риккетсий методом ДНК-зондирования.
Основным положением, выносимым на защиту, является возможность проведения типировакия риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки с применением рестрикционного анализа хромосомной ДНК и ДНК-зондирования по Саузерну с ДНК-зондами, несущими различную генетическую информацию.
Научная новизна работы.
Впервые определен характер расщепления хромосомной ДНК риккетсий с широким набором эндонуклеаз рестрикции, обладающих различными сайтами узнавания, и установлены злектрофоретическиа профили рестрикциокных фрагментов ДНК для риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R.typhi, R.Canada) и клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirlcai R.conorii), имеющие видовые и, в случае R.prowazekii, R.typhi, R.conorii, штаммовые особенности.
Охарактеризованы новые" по дифференциально-диагностическим особенностям ДНК-зонды (РВН11, РЕН13, Ш218), представляющие собой различные по структуре фрагменты ДНК R.prowazekii; ДНК-зонды обладают специфичностью в отношении ДНК риккетсий группы сыпного тифа и клещевой пятнистой лихорадки и способное! »ю к дифференциации видов рикетсий внутри этих групп.
На основании полученных впервые данных анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДКК и результатов ДНК-зондирования предложены новые критерии генотипической идентификации риккетсий группы сыпного тифа я клещевой пятнистых лихорадок, позволяющие:
- определить вид риккетсий и дифференцировать штаммы R.pro
wazekii, R.typhi, R.cortcrii.
- впервые объединять в группы патогенные для человека штаммы
R.prowasekii; получить первые на генетическом уровне доказатель
ства изогенности иалопатогенкого штамма Е R.prowazekii и его вы
соковирулентного ревертанта штамма ЕВир;
- впервые установить генетическую гетерогенность ытаммов
R.typhi;
.- подтвердить генетическую гетерогенность штаммов R.conorii и установить, что отечественный штамм М-1 R.conorii отличается по генотипу от протстипных индийского и африканского штаммов R.conorii - Indian tick typhus и Kenya tick typhus;
установить подобие генотипа вирулентных штаммов R.sibirica, изолированных в разное время, в различных регионах нозоареала клещевого тифа Северной Азии, из разных источников;
- выявить новый для территории СНГ генотип риккетсий группы
клещевой пятнистой лихорадки для изолята, выделенного в Крыму;
Практическая ценность работы
Впервые охарактеризованы генотипы штаммов патогенных риккетсий с известной видовой принадлежностью, выделенных на территории СНГ и депонированных в коллекции Национального музея риккетсиоз-ных культур.
ГенотЕПические характеристики введены в паспортные данные изученных штаммов риккетсий группы сыпного тифа (R.prowazekii, R.typhi, R.Canada) и группы клещевой пятнистой лихорадки (R.sibirica, R.conorii, R.akari).
Предложенные критерии использованы для геноткппческой характеристики риккетсиальных пзолятов с неустановленной видовой при-над?екностью, депонированных в коллекции Национального музея рик-кетсиозны.х культур.
Апробация диссертации состоялась на научной конференции, отдела медицинской микробиологии КйИЗМ кн. К.Ф. Гамалеи РАМН 9 декабря 1992 года. Основные положения работы доложены на ззседакии Всесоюзного центра по риккетсиозаи (1987 г.), на Всесоюзной конференции по риккетсиоззм (1983 г.), представлены на конкурсе молодых ученых НЖЭМ им. Н.Ф.Гамалеи в 1987 г., включены руководителем диссертации д.к,е. Бадаевой Н.М. в доклад на международной конференции ршскєтсиологов (Италия, 1987 г.),. на 4-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии (Франция, 1989 г.), на IV международном симпозиуме "Rickettsiae and Rickettsial Diseases (Чехсслозакия, 1991 г.); включены в доклад академика АМН СССР А.Г.Скавронскоіі и члена-корреспондента АМН СССР А.А.Воробьева
-5-робьева "Генетическая инженерия в микробиологии и иммунологии" на LXII сессии общего собрания АМН СССР (19-23 марта 19Э1 г.). ' По теме диссертации опубликовано Э работ. Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 194 страницах, иллюстрированы 28 рисунками и 10 таблицами. Диссертация состоят из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, главы обсуждения результатов выводов ц/ списка литературы, включающего 30 советских и 177 зарубежных'источников.