Введение к работе
Актуальность темы. Одной из актуальных проблем микробиологии является изучение поверхностных структур бактерий, участвующих в разнообразных биохимических процессах, протекающих на гравии: клетки и окружающей среды. Они включают ионный обмен, бактериальную адгезию, рсисшшю бактериофагов, связывание антибиотиков и тл. Значительную рель в этих процессах играют полимеры - пептидогликан, нейтральные и кислые полисахариды, липополисахарияы у гргмотрнцатслькых и тейхоевые, липотейхоевые и тейхуроновые кислоты у грагаоложитсльных микроорганизмов.
Исследования последних лет показали, что тейхоевы; кислоты ряда бактерий являются иммужшодуляторами, а иногда обладают противоопухолевой активностью. Липотейхоевые кислоты играют важную роль в первичных процессах взаимодействия патогенных микроорганизчов с организ-мом хозяина. Состав, а иногда и структура тейхоевых и липотеихоевых кислот может являться стабильным хсмотаксоиомичсским признаком некоторых бактерий и в настоящее время все чаше используется в систематике. Кроме этого, -исследование этих полимеров имеет теоретическое значение для биохимии микроорганизмов, расширяя наши знания о строенвл природных соединений.
Тейхоевые и липотейхоевые кислоты известны у многих групп грамположитсльных бактерий [Наумова, 1979; Fischer. 1990]. но у актиномицетов они исследованы пока недостаточно, а липотейхоевая кислота изучена только у одного штамма стрептомицетов [Потехина и др,1983].
Для рода Agromyces, представители которого распространены в различных типах почв и характеризуются наличием диаминомаслхной кислоты в клеточной стенке, сведения об этих полимерах отсутствовали. Первый вид рода, Xramosus, был описан в 1969 г. [Gledhill and Casida, 19691. а недавно к агромішетам были отнесены еше 14 штаммов, образующих два новых вида [Zgurskaya et al., 1992]. Изучение тейхоевых и липотеихоевых кислот агромицегов должно было добавить недостающую для полного описания рода информацию, а таске могло послужить уточнению хемотакссаомического статуса новых штаммов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение распространения тейхоевых кислот у штаммов рода Agromyces и более детальное исследование структур полимеров у типовых штаммов Acerinus и A.fucosiu. В связи с этим предстояло решить следующие задачи:
-
Изучить распространение полимеров у 12 выбранных штаммов рода.
-
Выделить и исследовать липотейхоевые кислоты типовых штаммов следующих подвидов рода Agromyces: A. cerinus ssp. cerinus, A. cerinus ssp. nitratus. A. fucosus ssp. fitcosus и A. facosus ssp. hippuranis.
-
Выделить и изучить структуры тейхоевых кислот типовых штаммов тех же подвидов агромшіетов.
Научная "ояичкз. Впервые показано присутствие тейхоевых и/или липотеихоевых кислот у 12 штаммов агромипетов. Установлена структура
липотсйхосвых кислот 4 типовых штаммов А. септа ssp. annus, A cerinus
ssp. nitratus. A. fitcosus ssp. fiicosus и A fiicosus ssp. hippuratus; в их составе
впервые найдены О-апстильные заместители. Изучено строение тейхоевых
кислот типовых штаммов A cerinus ssp. nitratus, A fiicosus ssp. fiicosus и Л.
fiicosus ssp. hippuratus. Структуры тейхоевых кислот штаммов ВКМ Ас-1351* и
ВКМ Ас-1352 * являются уникальными и ранее у прокариот'не обнаружены.
Показано также, что два штамма подвила A. fiicosus ssp. hippuratus имеют
одинаковые тейхоевые кислоты. ' ч .
Практическая чначимпеп.. Результаты работы, которая является первым исследованием тейхоевых и липотсйхосвых кислот агромипстов, имеют теоретическое значение для изучения ахтиномицетнон клетки. Кроме этого, полученная информация входит в описание рода Agromyces и может иметь практическое значение как дополнительный критерий при определении таксономического статуса штаммов рода. Данные спектроскопии ЯМР впервые найденных структур - поли(ркбофуранозилрибитфосфата), замешенного остатками галактозы, и поли(рибитфосфата) с боковыми тстрасахаридными заместителями - могут быть полезными при анализе углеводсодержащих -полимеров близкого строения. Результаты работы также можно использовать в лекционных курсах по биохимии микроорганизмов.
АпроГапия рпйоты и nyfimreamm. Диссертационная работа была апробировала на заседании кафедры микробиологии МТУ (1994г.), результаты исследований были представлены на .УТЛ Международном симпозиуме по биологии актшюмицетов (США, Машсон, 1991). По теме диссертации опубликованы 3 и находятся в печати 2 работы.
Структура и ойъем работы. Диссертация изложена на 117 страницах и состоит id введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов, собственного экспериментального материала (3 главы), общего обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (201 источник). Экспериментальный материал иллюстрирован 12 таблицами и 26 рисунками.
Материалы и методы исследования.
Материалом для исследования служили 12 штаммов рода Agromyces, полученных из Всесоюзной коллекции микроорганизмов (ВКМ). Строение тейхоевых и липотсйхосвых кислот изучали у 4 типовых штаммов рода: Acerinus ssp. cerinus ВКМ Ас-1340т, A.cerinus ssp. nitratus ВКМ Ac-1351 , Afiicosus ssp. fiicosus BKM Ac-1345T, Afiicosus ssp. hippuratus BKM Ac-I352T. Для получения биомассы культуры выращивали на качалке при 28 С в течение 16-18 часов на пептонно-дрожжевой среде [Евтушенко и др.,1991].
Препараты клеточной стенки получали из разрушенного ультразвуком мицелия с помощью дифференциального центрифугирования. Тейхоевые кислоты выделяли из мицелия или из клеточной стенки обработкой 10% ТХУ, 1н NaOH или глициновым буфером, очищали ионообменной хроматографией на DEAE-Toyopeari 6S0M. Лшютейхосвые кислоты получали из мицелия экстракцией 80% водным фенолом, очншалк нуклеазами и гелъ-хромато-
графией на Сефарозе 6В. Изучали первичную структуру' полимеров: строение мономерных единиц, тип фосфодиэфирной связи между ними, наличие и природу заместителей, а у липотейхоевых кислот также состав пярофобной части. Определение первичной структуры.. полимеров проводилось как химическими методами, основанными на расщеплении их молекул я изучении полученных фрагментов, так и различными видами спектроскопия ЯМР. Для деградации цепей полимеров применяли . кислотный, щепочкой и ферментативный гидролиз. В работе использовали различные виды хроматографии, высоковольтный электрофорез на бумаге, а также пелый ряд количественных и аналитических методов.
Результаты исследования и их обсуждение.