Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ТРАДИЦИОННЫЙ ПОДХОД В СИСТЕМАТИКЕ АКТИНОМИЦЕТОВ; МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ 8
Глава 2. ОСНОВНЫЕ ТЕНДЕНЦИИ СОВРЕМЕННОЙ СИСТЕМАТИКИ АКТИНОМИ ЦЕТОВ 13
Глава 3. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА АКТИНОМИЦЕТОВ, ЕЕ ВЛИЯНИЕ - НА ОЦЕНКУ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ 34
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
МАТЕРИАЛЫ 41
МЕТОДЫ 46
ЭКСПЕРИШНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 56
Глава I. ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ АКТИНОМИЦЕТОВ. ГРУППИРОВКА ШТАММОВ 56
Глава 2. ИЗУЧЕНИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА streptomyces 61
2.1. Видовой состав представителей рода Streptomyces .... 62
2.2. Определение штамма 7LS -..- 65
2.3. Таксономическая оценка адафференпированныз вариантов стрептомицетов 69
Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУР С ЗУ ТИПОМ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ, НЕ СО-
ДЕРЕАЩИХ МИКОЛОВЫХ КИСЛОТ 83
3.1. Определение таксономической принадлежности 83
3.2. Микроморфология и тонкое строение "Wtwsardia" autotroph с а ЗЬ8 87
Глава 4. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУР РОДА Nocardia sensu etricto I02
Глава 5. ИЗУЧЕНИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ ДРУГИХ РОДОВ 114
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 120
ВЫВОДЫ 127
ЛИТЕРАТУРА 129
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 155
- ТРАДИЦИОННЫЙ ПОДХОД В СИСТЕМАТИКЕ АКТИНОМИЦЕТОВ; МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ
- ОСНОВНЫЕ ТЕНДЕНЦИИ СОВРЕМЕННОЙ СИСТЕМАТИКИ АКТИНОМИ ЦЕТОВ
- ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА АКТИНОМИЦЕТОВ, ЕЕ ВЛИЯНИЕ - НА ОЦЕНКУ ТАКСОНОМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ
- ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КОЛЛЕКЦИИ АКТИНОМИЦЕТОВ. ГРУППИРОВКА ШТАММОВ
- Видовой состав представителей рода Streptomyces
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы активно изучаются ак-тиномипеты-симбионты ольхи и других небобовых растений, принадлежащие роду ffranfcLa. Интенсификация исследований этих организмов обусловлена интересом к многогранной проблеме взаимоотношений ак-тиномицета и растения, к взаимному влиянию партнеров, образующих азртфиксирующий корневой клубенек.
Исследования актшомицетов-эндоеимбионтов - часть глобальной проблемы баланса азота на планете. Эти исследования уже нашли выход в практику: активные культуры франкий применяются для обработки корней небобовых растений, которые используются для освоения песков, пустошей, бросовых и загрязненных отходами промышленных предприятий земель.
Известно, что франкий - не единственные актиномицеты, населяющие азотфиксирующие клубеньки, в ранних работах показано присутствие в них актиномицетов иных таксонов. Известно также, что не-ф^анкиальные актиномицеты оказывают существенное влияние на ход инфекционного процесса, являясь помощниками франкий. Тем не менее в настоящее время все внимание исследователей сосредотачивается главным образом на франкиях. Сопутствующая микрофлора изучается значительно меньшим числом исследователей, основные работы ведутся в Отделе Всесоюзная коллекция микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР,
Изучение нефранкиалышх актиномицетов клубеньков актиноризаль-ных растений может дать результаты, важные для решения творе тичес* ких и практических проблем, стоящих в области симбиоза.
Помимо сказанного, актуальность изучения актиномицетного населения такой своеобразной экологической ниши, какой является ак-тинориза, обусловлена еще и тем, что в ней могут быть обнаружены новые и редкие формы актиномицетов.
Необходимым звеном в изучении нефранкиалышх актиномицетов клубеньков и ризосферы актиноризальных растений является таксономические исследования, определение места этих актиномицетов в системе.
Цели и задачи исследования» Целью настоящей работы было определение таксономического положения нефранкиалышх актиномицетов, населяющих своеобразную экологическую нишу; азотфиксирующие клубеньки и ризосферу актиноризальных растений. Отдельные штаммы этих актиномицетов, как было показано ранее (Парийская с соавт., 1982; Suetin et al., 1982), могут способствовать образованию клубеньков на корнях ольхи. Кроме того, в ходе работы предполагалось решить некоторые самостоятельные таксономические задачи.
В конкретные задачи работы входило:
Определение родовой принадлежности актиномицетов на основании изучения их морфологических и хемотаксономических признаков (тип клеточной стенки, тип пептидогликана, наличие нойардомиколо-вых кислот, состав жирных кислот лшшдов мицелия, состав менахино-нов).
Определение видовой принадлежности актиномицетов.
Таксономическая оценка адифференцированных вариантов ряда штаммов рода Streptorayces.
Детальное изучение морфологии и тонкого строения слабо изученного вида Nocardia autotrophic».
Научная новизна работы. В результате работы впервые установлено, что в корневых клубеньках различных видов растений Ainus, Elaeagrras и Мугіса наиболее широко распространенным видом актиномицетов является Nocardia vaccinii - мало изученный и редко встречающийся в почве вид нокардий. В клубеньках присутствует также большое количество различных видов рода Streptomyces. Nocardia autotrophics (представитель самостоятельного рода - "нокардии, не содержащие миколовых кислот") выделяется из клубеньков и ризосферы одного из видов изученных растений - Alnus incana.
Впервые детально изучена морфология и тонкое строение Nocar-dia autotrophica; показано, что характерным морфологическим признаком вида является деление мицелия в разных и/или взаимно перпендикулярных направлениях.
Методами нумерической таксономии определена таксономическая дистанция между адифференцированными спонтанными вариантами и исходными штаммами четырех видов стрептомицетов. Показана необходимость поисков новых критериев для дифференциации видов рода.
Показано, что среди представителей рода StreptonycesHMeioTCfl штаммы, сходные по морфологии с культурами рода . Намечены пути родовой идентификации таких культур.
Работа является необходимым этапом в изучении нефранкиальных актиномицетов, населяющих клубеньки небобовых растений, возможных помощников эндофитов рода їгапкіа. Она подготавливает подходы к управлению процессами инфицирования актиномицетами корневой системы растений и образования азотфиксируящих клубеньков. — О —
Традиционный подход в систематике актиномицетов; морфологические признаки
В систематике актиномицетов традиционно придавали большое значение морфологическим признакам. Эта традиция сложилась на основании того, что долгое время внимание специалистов привлекали группы актиномицетов с хорошо развитым мицелием и репродуктивными структурами. Значительное влияние на формирование таксономических представлений в области актиномицетологии оказали ранее сложившиеся воззрения микологов. Наиболее полное выражение "морфологической" традиции в систематике актиномицетов мы находим в книге Н.А, Красильникова "Лучистые грибки. Высшие формы" (1970). Для разграничения и характеристики родов актиномицетов автором книги использованы следующие 16 признаков: подвижность клеток, способ деления мицелия, фрагментация мицелия, наличие воздушного и/или субстратного мицелия, наличие сшр, наличие склероций, наличие пик-нид, способ ветвления спороносцев, способ образования спор, число спор (одиночные, пары, цепи), длина цепочек спор, форма цепочек спор, наличие спорангиев, способ образования спорангиев, форма спорангиев, подвижность спорангиоспор.
Сложившиеся представления начали меняться уже к концу 60-х годов, ценность морфологических признаков стала подвергаться сомнению в силу ряда причин.
Одна из них состоит в том, что в течение данного периода времени было описано большое количество новых форм актиномицетов, характер морфологии которых оказался переходным между резко различными морфологическими типами, составляющими ранее четко обособленные роды. Так, например, между актиномицетами, образующими одиночные споры (Micromonospora, Oerskov, 1923) и актиномицетами, обра-зующими споры в цепочках (Streptomyces , Waksman, Henrici , 1943), появился ряд форм, у которых образуются помимо одиночных спор пары и цепочки спор (например, Microbispora, Lecbevalier(M.),Ieche valier (н.), 1957; Saccliaromonospora, Nonomura, Ohara, 1971; Microetraspora, Thieman et.al», 1968; Micropolyspora, Lechevalier et. al.f 1961). Кроме того, оказалось, что число спор у моноспоровых и других актиномицетов детерминировано вообще не четко.
Общее представление о трудностях, связанных с применением морфологических критериев у актиномицетов, дает рассмотрение таблицы I, где представлено разделение актиномицетов на группы по основным морфологическим признакам. Как видно из таблицы, эти признаки не позволяют дифференцировать роды актиномицетов, входящих, например, в 1-ую, 8-ую, 11-ую группы. їїривлеіение дополнительных морфологических признаков в большинстве случаев не облегчает задачи, так как их изучение трудоемко, требует опыта, а оценки субъективны и не могут быть выражены в количественных терминах. 2ти трудности являются одной из причин того, что морфологические признаки начали игнорироваться в таксономических работах. Прекрасным примером такой работы является статья Курупа (Kurup, 1981), где ревизия родо-вой принадлежности ряда видов рода Micropolyspora производится на основании изучения их биохимических, физиологических и серологических свойств, а морфологические особенности, благодаря которым эти виды были выделены и включены в упомянутый род, вообще не рассматриваются.
Основные тенденции современной систематики актиномицетов
В современной систематике мюжно отметить, по крайней мере, три основных направления, которые определяют состояние классификации и идентификации актиномицетов: развивающиеся хемотаксономичес-кие исследования, геносистематика и нумерическая (численная) таксо-номия.
В 60-е годы прогресс биохимии привел к тому, что биохимические методы стали доступными широкому кругу исследователей, в том числе систематиков. Эти методы стали применяться для исследования самых разнообразных свойств широкого круга микроорганизмов. Очень скоро у тысяч культур микроорганизмов были определены такие, например, показатели, как нуклеотидный состав ДНК и/или состав аминокислот и Сахаров клеточной стенки. Эти и другие характеристики вошли в число признаков, которые стали использоваться все более и более широко для классификации микроорганизмов вообще и актиномицетов в частности (Агре, Калакуцкий, 1972),
В настоящее время данное направление известно под названием хемотаксономии. Оно объединяет исследования, в которых с таксономическими целями характеризуется состав и структура отдельных компонентов клетки и, прежде всего, ее генофора, клеточной стенки, мембран,
Хемотаксономия актиномицетов начала бурно развиваться после того, как было установлено, что большинству родов этих организмов свойственен определенный состав (тип) клеточной стенки (Becfcer et, al., 1965; tamaguchi, 1965; bechevalier et.al.. 1966). Понятие о типе клеточной стенки сформировано на основании анализа аминокислот, содержащихся в пептидной части муреина, и Сахаров, содержащихся в клеточной стенке или полисахариде, ассоциированном с ней, Ами - 14 нокислоты и сахара, имеющие таксономическое значение, приведены в таблицах 2 и 3.
Признак стал быстро входить в практику после 1965 года, когда в работах Лёшевалье с соавторами было показано, что "тип клеточной стенки" - признак постоянный, не зависит от условий выращивания актиномицетов, и общий, то есть характеризует всех представителей различных родов актиномицетов (Suput et.al., 1967)« Других критериев испытания ценности признака в те времена не существовало (см. главу 3). Может возникнуть вопрос, в особенности у специалистов, далеких от систематики, какой биологический смысл имеет включение в пептидную часть пептидогликана той или иной диаминокислоты, например: лизина, мезо-ДАП или Lb-ДАЇЇ. Ведь эти аминокислоты являются звеньями одного биосинтетического пути. На этот вопрос пока нет ответа. Систематика, как впрочем и другие области знания, нередко использует в своих целях свойства организмов, в основе которых лежат неизвестные механизмы.
Филогенетическая система актиномицетов, ее влияние - на оценку таксономических признаков
В настоящее время в систематике прокариот осуществляется радикальная перестройка, без упоминания о которой невозможно объективно охарактеризовать положение в систематике отдельных групп этих организмов и, в частности, актиномицетов. Основой для упомянутой перестройки послужило создание метода анализа I6S рРНК, приемлемое для применения в таксономических целях. Сведения, полученные с помощью этого метода, позволили создать схему филогенетических отношений прокариот, которая представляет больший интерес для их классификации, чем все предшествовавшие схемы (Fox et.al., ;I980; Kandler, 1981; Woese, 1981). Уже в настоящее время системы классификации отдельных групп бактерий претерпевают изменения в соответствии с реконструкцией их филогенеза по данным секвениро-вания 16 S рРНК.
Результатом таких процессов в развитии науки явилось создание упомянутой схемы филогении прокариот, Почему она была создана на основе анализа I6S рРНК?
В последние 10-15 лет осуществлялось, с одной стороны, актив? нов внедрение молекулярно-биологических методов в область систематики организмов, а с другой, росло "признание молекулярными биологами важности филогении организмов для понимания эволюции макромолекул" (Шйр, 1971). Результатом этих процессов явилось создание новой науки - изучения информационных молекул с позиций теории эволюции (Айяла, 1980). Макромолекулы ДНК, РНК и белков начали пы-таться использовать как документы эволюционной истории. Преимущества молекулярно-биологического подхода для систематики совершенно ясны, хошя бы уже потому, что он дает возможность сравнивать организмы, резко отличающиеся друг от друга, и количественно оценивать информацию, получаемую при сравнении.
Современный методический уровень позволяет секвенировать (с большим или меньшим успехом) любые молекулы. Какие преимущества имеет I&S рРНК? Приводятся (Fox et al.f 1977, 1980) следующие ар-гументы в пользу этого подхода: рибосомы очень древней природы, рибосомалыше РНК распространены у всех живых организмов; они име-ют постоянные функции. Первичная структура 16 s рРНК достаточно вы- рождена и изменяет последовательности очень слабо, слабев, чем большинство белков. I6S рРНК имеет области как экстремально консервативные, так и вариабельные, что дает возможность на основании их анализа установить как далекие, так и близкие родственные отношения. Молекулы I6S рРНК легко изолируются, они достаточно велики (1540 нуклеотидов), что делает их анализ статистически более достоверным, чем анализ меньших молекул, например, молекул 5s рРНК (120 нуклеотидов).
Анализ I6S рРНК (дается частичная характеристика последова-тельностей нуклеотидов в олигомерах) основных представителей прокариот позволил сформулировать гипотезу, основные положения которой сводятся к следующему. Более трех миллиардов лет тому назад от общего предка начали эволюционировать предковые формы трех будущих царств: предок эукариот (клетки прокариотной организации) и предки двух резко отличающихся царств прокариот: эубактерий и ар-хабактерий. Первыми обитателями планеты могли и не быть анаэробные гетеротрофы, в числе древнейших обитателей Земли были анаэробные фотосинтетики. Аэробный тип обмена многократно возникал в ходе эволюции разных групп бактерий (Fox et.al., 1980),
Предварительное таксономическое изучение коллекции актиномицетов. группировка штаммов
Как известно, работа по определению разнородной коллекции культур актиношщетов обычно начинается с их группировки по основным морфологическим и биохимическим признакам. Такая предварительная работа приводит к тому, что выделяют группы штаммов, принадлежащие к одному роду или чаще к группе близких по морфологии или типу клеточной стенки родов.
Работа по предварительной идентификации может начинаться с той группы признаков, с которой исследователь лучше знаком. Из морфологических свойств обычно изучаются способность к образованию субстратного и воздушного мицелия, наличие фрагментации и особенности этого процесса, наличие спорообразования и основные особенности строения спороносцев или спорангиев. Из биохимических свойств обычно изучают дифференцирзгющие аминокислоты и сахара клеточной стенки, определяют тип клеточной стенки (Iechevalier (М.), Ieche-valier (Н.), 1970). Иногда привлекают и другие биохимические приз-наки, например, наличие и состав миколовых кислот. Мы начали изучение культур с рассмотрения их общих морфологических признаков.
Изучение морфологических свойств (фрагментация мицелия, образование воздушного мицелия, спорообразование;) актиномицетов дозволило их разделить на 4 группы.
К первой относились 27 штаммов, образовывавшие хорошо развитый воздушный мицелий с прямыми и спиральными спороносцами и не фрагментирующийся субстратный мицелий. Культуры хорошо росли и спо-рулировали на всех использовавшихся питательных средах.
Ко второй группе относились 28 штаммов с умеренно развитым воздушным мицелием, прямые гифы которого распадались на споропо-добные фрагменты. Субстратные гифы фрагментировались на участии различной длины и формы. 27 штаммов этой группы после выделения из клубеньков медленно (видимые простым глазом колонии появлялись через 10-12 суток инкубации) и скудно росли на питательных средах, в том числе на богатых комплексных (ЦЦА, ПКА); адаптация культур к лабораторным средам происходила после многократных пересевов в течение 1-1,5 лет культивирования. В отличие от этих штаммов, штамм 7LS хорошо рос на всех питательных средах, мицелий этой культуры был несколько толще, чем у вышеописанных культур.
В третью группу были включены II штаммов с фрагментирующимся воздушным и субстратным мицелием. В отличие от культур 2-ой группы воздушные гифы были короткими с частым ветвлением. Для субстратных гиф был характерен полиморфизм: наличие участков,различавшихся по диаметру, спороподобных клеток, участков, делящихся в разных направлениях.
4-ю группу составили 4 штамма (ЗОР, ЗІР, 32Bi, 62І&) без воздушного мицелия и спор, с не фрагментирующимся субстратным мицелием.
Вторым этапом работы было определение типа клеточной стенки актиномицетов (табл. 10). Уже изучение морфологии позволило ориен-тировочно отнести штаммы 1-ой группы к роду streptomyces, что было подтверждено определением типа клеточной стенки. Все культуры содержали ЬЬ-диаминопимелиновую кислоту (ДАЛ) и не имели дифференцирующих Сахаров - I тип клеточной стенки.
Видовой состав представителей рода Streptomyces
Видовой состав стрептомицетов определяли в три этапа. Первый состоял в определении культур по известным в литературе ключам для определения, а именно по ключам Сабо (Szabo et al., 1975), Кюс-тера (Kflster, 1972), Нономура (Nonomura, 1974) и Дайд (Barres et al., 1980).
Для проведения этого этапа работы у культур были изучены могн фологические признаки; строение спороносцев на средах Чапека, Гаузе I, глюкозо-аспарагиновой и овсяном агаре; форма спор и структура их поверхности.
ЗДультуральные свойства - цвет воздушного и субстратного мицелия - изучали на средах, предложенных при проведении международного проекта по изучению стрептомицетов (ISP), состав см. в главе "Материалы и методы". Усвоение арабинозы, ксилозы, инозита, ман-нита, фруктозы, рамнозы, сахарозы и раффинозы изучали на среде Придгейма и Готлиба (Schirling, Gottlieb, 1966).
Результаты этого этапа определения были в отдельных случаях противоречивы, один и тот же штамм при использовании разных ключей приходилось относить к различным видам. Так, например, штамм Л 23Р мог быть определен как s.collins , з chibaensis, s corcho-rusii и s. thermovulgaris. Проверка правильности определения по описаниям видов, содержащимся в соответствующих статьях, давала отрицательные результаты.
Причина описанных затруднений состоит в том, что упомянутые ключи основаны на небольшом количестве признаков. Например, ключ, предложенный Кюстером, учитывает следующие признаки: цвет воздушного мицелия и обратной стороны колонии и среды (изменения окраски в зависимости от состава сред при этом игнорируется), наличие меланоидного пигмента, форма спороносцев и спор, усвоение некоторых Сахаров.
В результате первого этапа работы мы пришли к выводу, что упомянутые выше ключи не достаточны для видовой идентификации стрептомицетов.
Следующий этап работы состоял в определении наших культур по определителю Гаузе с соавторами (1983), который в период вы-полнения работы подготавливался к печати, В этом руководстве определение основано на знании основных морфологических свойств и подробном описании культуральных свойств на 9-ти питательных средах (Гаузе I, Гаузе П, СрІ с глюкозой, СрІ с глицерином, Чапека, Трес-нера, глюкозо-аспарагиновой, овсяной, Линденбайна)
В результате мы пришли к достаточно! определенным выводам о видовой принадлежности изучаемых штаммов: они были отнесены к 15 видам, перечисленным в таблице II.
Заключительным, третьим, этапом нашей работы было сравнение культуральных свойств определенных культур со свойствами эталонных штаммов соответствующих видов, которые любезно предоставлены нам сотрудниками Всесоюзного научно-исследовательского института новых антибиотиков АМН СССР Т.П. Преображенской, М.А. Свешниковой и Л.П. Тереховой (авторы упомянутого выше определителя).