Введение к работе
Актуальность проблемы. Полилизогенность — состояние множественного носительства клеткой умеренных фагов — явление еще крайне малоизученное в бактериофагии. Тем не менее оно представляется исключительно интересным и важным в научно-теоретическом плане и, безусловно, имеет существенное практическое значение в определении внешних феноптических свойств как отдельной бактериальной клетки, так и популяции бактерий — штамма в целом. Тезис теоретической значимости носительства умеренных фагов убедительно продемонстрирован на хорошо изученных мо-нолизогенных системах энтеробактернй, содержащих профагн К, Ми, Р22, Р1 и др., для которых показан весь широкий диапазон тех преобразований свойств клетки, которые может вносить в природную генетическую информацию бактерии геном умеренного фага. В широком охвате это звенья единой цепи, имеющие различные проявления: от спонтанной индукции профага, ведущей к лизису отдельной клетки, но к фагоустойчнвости по иммунитету популяции в целом, до трансдукции и транспозиции хромосомных генов как формы генетического обмена в пределах вида и в более широких межвидового обмена рамках. Изучение взаимодействия фагового и бактериального геномов содействовало пониманию рекомбина-цнонных механизмов, определяющих конечный результат феноти-пического выражения свойств отдельной клетки, и возможные преобразования свойств их популяций. Но, если даже на основе моно-лизогении может строиться такое многообразие схематических форм взаимоотношений геномов, то, естественно, в полилизогенных бактериальных системах они многозначно усложняются и конечный результат становится еще более трудно прогнозируемым. Очевидно, он должен строиться на основе исчерпывающего определения количественной специфики полилизогенизирующих фагов, качественной индивидуальной характеристики каждого из них, и, наконец, максимально возможной оценки их интегральной функции во всем многообразии между собой и с геномом клетки в целом.
Все сказанное выше определяет в общих чертах теоретическую значимость проблемы полилнзогении, но за этим скрывается еще емкое практическое содержание явления. Здесь представляется целесообразным остановиться лишь на двух практических аспектах проблемы. Первый — это фаговая конверсия, определяемая геномом (и) умеренных фагов, начиная от детерминирования профага-ми токсинообразовання, как у возбудителя ботулизма, и охватывая специфику антигенной структуры, как у сальмонелл. Едва ли есть необходимость обосновывать практическую значимость этих и других проявлений фаговой конверсии, но совершенно очевидна зависимость выражения этих свойств на таком сложном генетическом фоне как полилизогения.
Второй актуальный практический аспект — это излечивание по-лилизогенной системы от профагов. Его приложимость особенно остра для бактериальных продуцентов биологически активных веществ, культивирование которых в производственных условиях чревато потенциальной возможностью спонтанного фаголизиса. Практическая реализация этой задачи на основе применения ин-
теркалирующих соединений и воздействий, апробированных на мо-нолнзогенных системах, едва ли окажется эффективным приемом для полилизогенных систем, ввиду очевидной необходимости многократных обработок продуцента,.в результате которых, вероятно, можно утратить саму продуцирующую способность бактерий. Можно предположить, что транспозонный мутагенез, инактивнрующнй функциональную активность профагов, явится более приемлемым способом разрешения проблемы.
Объектом исследования настоящей работы выбрана полилизо-генная система Erwinia carotovora. Как условно патогенный возбудитель заболеваний человека он представляет интерес для медицинской микробиологии, обладает выраженными фитопатогенпымп свойствами, а штамм 268 этого вида, в частности его селекционированный производный 268 R используется в микробиологическом производстве фермента L — аспарагиназы — лечебного антиленке-мнческого препарата. Сочетание этих свойств с полилизогенностью открывает возможность моделирования в разработке актуальных вопросов полилизогеннн на практически значимом объекте.
Целью представляемой работы явилась разработка нового системного подхода к выявлению и пониманию взаимодействия и функциональной экспрессии бактериофагов в гомо-и гетерологичных бактериальных хозяевах.
В соответствии с этим при выполнении работы поставлены следующие задачи:
идентификация умеренных фагов модельной полилизогенной культуры Е. carotovora — продуцента L-аспарагиназы, а также выяснение межфаговых взаимоотношений в полилизогеннон системе с расширенным дифференцированным изучением биологических и физико-химических свойств резидентных фагов 59 и Е105 и их геномов. Использование фага-транспозона Ми для воспроизведения Ми — зависимого мутагенеза в полилизогенной системе эрвиний с функциональной инактивацией ее резидентных профагов, как приема делнзогенизации системы;
изучить поведение фага-транспозона в прнродно-резистеит-ных и генетически отдаленных от естественного хозяина видах бактерий-бацилл, а также изучить возможность наследования и переноса его среди разных видов бацилл в составе гибридного комплекса с плазмндой RP4.
Научная новизна и практическая значимость. Оригинальными результатами работы являются следующие:
в полилизогенной системе Е. carotovora 268 идентифицированы 4 умеренных фага (59, 49, 69, Е105), которые характеризуются неравномерностью количественной продукции. Все фаги обладают способностью вызывать состояние конверсии клетки, выражающееся в утрате способности адсорбировать гомологичный фаг;
установлены основные биологические параметры взаимодействия фагов с клетками индикаторных культур, выяснены процессы их репродукции и внутриклеточного морфогенеза, установлена кинетика их термоинактнвацин;
впервые построены модели молекулярно-структурной организации белковых капсидов вирионов 59 и Е 105;
впервые показано, что ДНК фага 59 представлена линейными пермутированными молекулами с м.м. 31 МД с концевой избыточностью и транспозоподобным элементом. ДНК фага Е 105 — линейная непермутированная молекула с м.м. 29 МД, содержащая канонические односпиральные нити;
впервые построены физические линейная и кольцевая карты генома фага 59, а также линейная карта генома фага Е 105;
получены трансконьюганты эрвиний в скрещивании с кишечной палочкой с частотой 1,5—5Х Ю-7, лизогенизированные Mucts 62, которые обеспечивают полноценное развитие фага Ми;
трансконьюганты эрвиний в условиях термоиндукцин сегрегируют плазмиду RP4::Mucts 62 и способны к транспозиции фага Ми, сопровождающейся ауксотрофными мутациями и инактивацией профага 59 и частичной и полной делецией профага Е 105. Использованный прием выступает в виде альтернативы общепринятым способам элиминации профагов;
осуществлен коньюгативноподобный перенос плазмиды RP4:: Mucts 62 в бациллы, трансцнппенты которых как гетерологичные хозяева фага Ми не продуцируют полноценные фаговые частицы, но экспрессируют детерминируемые геномом фага функции. Транс-ципненты бацилл менее жизнеспособны, претерпевают ускоренный аутолитический распад, характеризуются замедленной скоростью роста и размножения, нарушением клеточной стенкн;
в условиях селективного давлення возможен отбор стабильных трансципнентов, с протяженными делениями плазмиды RP4:: Mucts 62 и показана возможность ее интеграции а хромосому бацилл;
система клетка-вирус (эрвиния и ее фаги) использована для апробации новых препаратов группы имндазола. Установлены антивирусная и антибактериальная активность препаратов этой группы, а также иммуностимулирующее действие. С использованием препаратов этой группы предложены питательные среды для выращивания грамотрицательных бактерий и для изучения гемолитических свойств микроорганизмов.
Полилизогения — сложная интегратнвная система взаимодействия составляющих ее профагов между собой и с генетическим аппаратом бактериальной клетки, с многообразными формами фе-нотипнческого выражения этого взаимодействия.
Полилизогенная система может продуцировать одновременно и близкородственные и существенно различающиеся фаги по биологическим свойствам, морфологии вирионов, полипептидному составу капсидов и физической структуре их ДНК.
При условии полноценной реализации в полилизогенной системе транспозирующейся способности гетерогенного фага транспозонныи
мутагенез может служить эффективным путем функциональной н структурной делизогеиизации резидентных профагов.
Обоснована концепция шнрокодиапазонной активности гетерогенного фага — транспозона по кругу хозяев, включая генетически отдаленные от естественного хозяина виды при отсутствии в них репродукции фага.
Полнлизогенная система явилась основой для апробации новых препаратов группы имидазола с антимикробной и иммуностимулирующей активностью.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на I и ІІ Всесоюзных конференциях по вирусам микроорганизмов (Пущи-но, 1981 г., Ташкент, 1986 г.); на X и XII конференциях ГДР по электронной микроскопии (Лейпциг, 1981 г., 1988 г.); на Международном симпозиуме «Биофизика нуклеиновых кислот и иуклео-протеинов». (Таллин, 1981 г.); на XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Сумы, 1982 г.); на VI и VII съездах Украинского микробиологического общества (Донецк, 1984 г., Черновцы, 1989 г.); на II Всесоюзном совещании «Современные вопросы биотехнологии» (Днепропетровск, 1989 г.); на Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989 г.); на Всесоюзных конференциях «Фитонциды. Бактериальные болезни растений» (Ужгород 1985 г., Львов, 1990 г.); , на конференциях Львовского медицинского института и Львовского института эпидемиологии и гигиены (Львов, 1990 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликованы 32 работы, получено 2 авторских свидетельства, 3 положительных решения Государственной научно-технической экспертизы на авторскую заявку.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение и главу обзора литературы. 6 глав содержат результаты собственных исследований. Последняя глава посвящена общему заключению. В отдельной главе представлено описание использованных методов. Диссертацию заключают выводы и список цитируемой литературы. Работа изложена на 265 страницах машинописного текста и иллюстрирована 71 рисунком и 19 таблицами. Список литературы содержит 390 наименований.