Введение к работе
Актуальность проблемы. Чума является тяжелым инфекциошшм
заболеванием человека, для которого характерна высокая
контагиозность и летальность. Существование множественных
природных очагов и эпидемическая опасность этой инфекции
обусловливают неослабевающий интерес исследователей к изучению
возбудителя чумы (Yersinia pestis). В настоящее время
охарактеризованы многие факторы вирулентности Y. pestis, выявлены
их генетические детерминанты, обнаружена важная роль
инсерционных последовательностей (IS-элементов) в их инактивации, приводящей к снижению или потере возбудителем чумы патогенных свойств.
IS-элементы представляют собой небольшие по размеру фрагменты
ДНК, способные к самостоятельной репликации и перемещению
(транспозиции) в геноме несущих их клеток. Большинство известных в
настоящее время бактериальных IS-последовательностей имеет широ
кий круг хозяев в микробном мире, однако у целого ряда патогенных
бактерий обнаружены специфические элементы, участвующие в регу
ляции экспрессии факторов патогенности. Одним из таких мобильных
элементов является IS100, обнаруженный у Y. pestis^ а также у
близкородственных бактерий возбудителя псевдотуберкулеза
(Y.pseudotuberculosis). Известно, что у возбудителя чумы транспозиции IS100 является причиной высокочастотных инсерционных и делецион-ных мутаций по признакам, коррелирующим с вирулентностью бактерий: зависимость роста при 37С от наличия в среде ионов кальция (Portnoy& Falkow, 1981; Filippov et al., 1995, 1998) и способность сорбировать экзогенные пигменты при 26С (Fetherston et al., 1992,1994; Buchrieser et al., 1998). Однако механизмы активации транспозиции этого элемента в настоящее время неизвестны. Для раскрытия этих механизмов необходимы - данные о структурной и функциональной организации IS100, которые могут дать в руки исследователям ключ к пониманию процессов, лежащих в основе регуляции вирулентности одного из наиболее патогенных видов бактерий - возбудителя чумы.
Анализ последовательности нуклеотндов IS 100 (Podladchikova et al., 1994; Filippov et al., 1995; Hare et al., 1996) выявил одну его структурную особенность: IS100 не имеет промотора для экспрессии содержащихся в нем двух открытых рамок считывания (огП и orf2). Такая молекулярная организация предполагает, что транспозиция элемент1 должна зависеть от наличия внешнего промотора, расположенного в последовательностях ДНК, окружающих этот элемент. Экспериментальные данные, подтверждающие это предположение, в
литературе отсутствовали. Вместе с тем решение этого вопроса является необходимым для понимания того, какие регуляторные факторы заставляют IS100 перемещаться в геноме Y.pestis и инактивировать важные для вирулентности гены. В геноме Y.pestis IS!00 имеет большое число копий (более 20) в хромосоме и по крайней мере по одной копии - в каждой из трех плазмид чумного микроба. Хотя теоретически любая из копий может служить донором при транспозиции IS100, имеющиеся в литературе данные (см. обзоры Хесин, 1985; Galas & Chandler, 1989) свидетельствуют о том, что мелкие плазмиды являются предпочтительными донорами при транспозиции lS-элементов. Эти данные позволяли предположить, что наиболее вероятным донором IS 100 при его транспозиции в геноме Y.pestis может быть 9,5 kb-плазмида pYP, кодирующая бакгериоцин пестицин и активатор плазминогена. Поэтому в качестве объекта экспериментального исследования роли внешних промоторов в функционировании IS 100 мы выбрали именно плазмиду pYP.
В ходе исследования была обнаружена еще одна особенность IS100: помимо генов, необходимых для транспозиции, он несет информацию, экспрессия которой влияет на поверхностные свойства хозяйских клеток. Подобное явление не было описано ни для одного IS-элемента. Более того, общепризнанным считается мнение, что IS-элементы, в отличие от транспозонов, содержат только генетическую информацию, необходимую для их перемещения в геноме, и влияют на хозяйскую клетку исключительно за счет последствий транспозиции, приводящих к реорганизации генома. Поэтому доказательство того факта, что IS 100 действительно содержит гены, экспрессия которых влияет на фенотип хозяйской клетки, представляло интерес не только в плане выяснения роли IS 100 в физиологии возбудителя чумы, но и в плане расширения представлений о биологических функциях мобильных генетических элементов.
Цель работы. Целью исследования явилось выявление структурно-функциональных особенностей инсерционного элемента IS 100 и на его основе разработка теста для внутриродовой дифференциации иер-сииий.
Задачи исследования. Для достижения цели в работе были поставлены следующие задачи:
1. Определить влияние внешних промоторов на экспрессию генов IS 100 с помощью метода молекулярного клонирования в клетках кишечной палочки.
-
Осуществить поиск регуляторных элементов транскрипции, способных обеспечивать экспрессию генов IS100, на участке плазмиды pYP, предшествующем двум большим открытым рамкам считывания этого элемента.«
-
Оценить возможность использования праймеров, комплементарных IS100, для детекции возбудителей чумы и псевдотуберкулеза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Научная новизна. В работе впервые проведено экспериментальное исследование структурно-функциональных особенностей IS 100: выявлено влияние внешних промоторов на транспозиционную активность и способность IS100 вызывать делеции ДНК, в том числе и своих собственных последовательностей; при секвенировании участка ДНК плазмиды pYP, предшествующего IS 100, выявлены последовательности, позволяющие предположить наличие оригинального механизма регуляции экспрессии генов IS 100 в этой плазмиде. При изучении IS 100 получено экспериментальное свидетельство в пользу гипотезы о том, что функции IS-элементов не ограничены их транспозиционной активностью,' а могут' быть связаны и с наличием в них генетической информации, влияющей на фенотипические свойства хозяйских клеток. Практическая значимость. В результате проведенных исследований получен набор рекомбинантных плазмид, содержащих гены IS 100 под контролем регулируемых промоторов. Рекомбинантные плазмиды могут быть использованы для изучения роли IS 100 в физиологии возбудителей чумы и псевдотуберкулеза. В работе предложен тест для детекции и идентификации Y.pestis и Y.pseudotuberculosis І серовари-анта с помощью ПЦР с праймерамн, комплементарными IS100. Тест может быть применен для совершенствования схемы диагностики возбудителей чумы и псевдотуберкулеза и их дифференциации от других иерсиний. Основные положения, выносимые на зашиту:
-
С помощью метода молекулярного клонирования получен набор рекомбинантных плазмид, различающихся наличием и расположением внешнего промотора по отношению к IS100.
-
Для проявления транспозиционной активности IS 100 необходим внешний промотор, направляющий транскрипцию двух крупных открытых рамок считывания элемента.
-
Транспозиционная активность IS 100 г. .оставе рекомбинантных плазмид приводит к образованию делеций как в векторной ДНК, так и в ДНК самого элемента.
-
В плазмиде pYP Y.pestis перед IS100 имеются последовательности, потенциально способные регулировать транскрипцию генов IS100.
-
IS100 содержит генетическую информацию, экспрессия которой определяет изменение фенотипических свойств рекомбинантных штаммов Е.соН.
-
Олигонуклеотиды, полненные на основе последовательностей IS 100, можно использовать для детекции Y.pestis и Y.pseudotuberculosis І серотипа методом ПЦР.
Апробация работы. Материалы работы неоднократно докладывались на научных конференциях и конкурсах молодых ученых и специалистов Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института, представлялись на Конгрессе микробиологических обществ в г. Иерусалиме, Израиль (1996г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, список которых приводится в конце автореферата. Структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописи, состоит из введения, заключения, выводов и трех глав, включающих: обзор литературы, описание материалов, методов и результатов собственных исследований. Текст иллюстрирован 6 таблицами и 16 рисунками. Список литературы включает 189 печатных работ.