Структурно-функциональная вариабельность антигенов Yersinia pestis и методология конструирования противочумных иммунопрофилактических препаратов Гремякова, Татьяна Андреевна

Введение к работе

АКТУАЛЬНОСТЬ

Чума является актуальной проблемой инфекционной патологии человека, реальность угрозы которой резко возросла в связи с возможностью использования возбудителя в качестве потенциального агента биотерроризма. После событий 11 сентября 2001 года в Нью-Йорке составлен список наиболее вероятных и опасных патогенов. В одном ряду с возбудителями оспы, сибирской язвы, вирусами Эбола и Марбурга отмечен чумной микроб. Именно поэтому вопросам защиты от биотеррроризма, в том числе разработке специфических и неспецифических средств защиты и профилактики особо опасных инфекций, уделяется столь пристальное внимание. За рубежом ведутся крупномасштабные разработки вакцинных препаратов нового поколения против чумы, сибирской язвы, сапа, мелиоидоза [Anderson etal., 1996; Forsberg et at, 1998].

Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее патогенных для человека микроорганизмов. Значительная вспышка бубонной чумы, охватившая, по данным ВОЗ (WHO Medical Bulletin, 1994), жителей 15 деревень индийского штата Махарашта, зарегистрирована в августе-сентябре 1994 года. В средствах массовой информации сообщается о вспышке чумы на Мадагаскаре в марте-апреле 1998 года. Спорадические случаи болезни регистрируются ежегодно во многих странах мира.

Применяемые в настоящее время противочумные вакцины были разработаны в 30-40-е годы прошлого столетия. В Англии, США и других западных странах используют преимущественно убитые вакцины из высоковирулентного штамма Y. pestis 195Р [Butler, 1983]. В России для вакцинопрофилактики чумы в течение многих десятилетий применяется живая вакцина на основе аттенуированного штаммаY.pestis EV НИИЭГ [Коробкова, 1956].

Важным аспектом, требующим серьезной концептуальной проработки при определении стратегии конструирования чумных вакцинных препаратов нового поколения, является определение целевого вакцинируемого контингента, так как подходы и препараты для плановой вакцинации населения по эпидемиологическим показателям, очевидно, разнятся от тех, которые понадобятся при применении Y. pestis в качестве биологического оружия.

Получить структурно-функциональные характеристики белковых (FI, рН6) и липоолиго-сахаридных компонентов Y. pestis, а также выявить особенности формирования протективного иммунитета, создаваемого антигенами при различных способах их доставки и презентации.

1. Создать коллекции R специфических фагов, авирулентных и природных штаммов Y. pestis, R вариантов энтеробактерий, R и S штаммов Y. pseudotuberculosis, разработать методические приемы фагового и электрофоретического скрининга и на их основе предложить систему для изучения липоолигосахаридов (ЛОС) возбудителя чумы.

2. Установить химическую структуру кора и липидаА липоолигосахаридов Y. pestis, определить молекулярную природу их изменчивости.

3.Разработать новые и усовершенствовать имеющиеся методы иммунохимического анализа липоолигосахаридов, приемов их химической модификации и презентации, способов истощения и конкурентного торможения с целью изучения антигенной специфичности препаратов, синтезируемых клетками возбудителя чумы при различной температуре.

ГОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ I БИБЛИОТЕКА і С. Петербург///''" I

_^$№6

4.Изучить иммунохимические и иммунобиологические свойства липоолигосахаридов У. pestis, синтезированных в определенных условиях культивирования штаммами, которые выделены из различных природных очагов.

5. Создать рекомбинантные штаммы-продуценты капсульного антигена, в том числе и штаммы аттенуированных сальмонелл, стабильно экспрессирующих FT антиген in vitro и in vivo. Сконструировать молекулярные и рекомбинантные вакцинные препараты, обладающие способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации.

б.Изучить иммуногенность и протективность FI и рНб антигенов при использовании различных систем доставки и презентации иммунокомпетентным клеткам.

7.Выбрать антигены чумного микроба, перспективные для последующего конструирования иммунопрофилактических препаратов, и определить формы их презентации.

Впервые выявлена взаимосвязь между чувствительностью клеток У. pestis с разной под-видовой и географической принадлежностью к липополисахарид (ЛПС)-специфическому фагу FP1.

Приоритетно определение последовательности моносахаридов в коре ЛОС У. pestis, который по своей структуре относится к несальмонельному типу. Показано, что в коре имеется структурно-консервативный участок, общий для большинства изученных препаратов, и вариабельный участок, структура которого меняется от штамма к штамму и зависит от температуры культивирования бактерий. ЛОС (25 С)' является гетерогенным в отношении строения олиго-сахарида кора и представлен четырьмя основными гликоформами, которые отличаются присутствием различных терминальных моносахаридов. Установлены отличия в молекулярной организации кора ЛОС штамма У. pestis subsp. caucasica 1146 от штаммов основного подвида.

Впервые показано, что олигосахаридный участок ЛОС возбудителя чумы имеет отчетливо выраженную температуро- и штаммозависимую иммунохимическую вариабельность. Для препаратов ЛОС, синтезированных при температуре 37 С, показана более узкая штаммовая иммунохимическая специфичность.

Установлена температуроопосредованная вариабельность липидаА возбудителя чумы, результатом чего является изменение биологических свойств липоолигосахаридов. Выявлена связь между химической структурой липоолигосахаридов У. pestis subsp. pestis и subsp. caucasica и иммунобиологической активностью данных препаратов.

Сформулирована концепция противодействования возбудителя чумы запуску и функционированию механизмов ранней неспецифической резистентности млекопитающих путем модификации липоолигосахаридов, что позволяет патогену минимизировать развитие защитных реакций.

Впервые определена возможность конструирования молекулярных и рекомбинантных вакцинных препаратов, обладающих способностью индуцировать защиту от чумы в ранние сроки после иммунизации.

Создана коллекция аттенуированных штаммов сальмонелл, которые экспрессируют кап-сульный антиген чумного микроба. Установлено, что рекомбинантные клетки аттенуированных сальмонелл, синтезирующих нативный иммуногенный капсульный антиген, при парентеральной и оральной иммунизации способны индуцировать у мышей протективный иммунитет в отношении чумы различной степени напряженности. Получены штаммы, обеспечивающие

¹ ЛОС (25 С) и ЛОС (37 С) - препараты, синтезированные в условиях культивирования при температуре 25 С или 37 "С.

защиту от высоких заражающих доз с первого дня после иммунизации (Патент №2046145, приоритет от 29.07.1992).

Показано, что рНб антиген при выраженной антигенности (авторское свидетельство №1797351, МКИ G01N33/53 приоритет от 5.11.90) и важной роли в патогенезе, не обладает протективностью для лабораторных животных. Путем термической и химической модификаций антигена, сопровождавшихся изменением степени агрегации, антигенных и биологических свойств рНб антигена, получен ряд препаратов с различным спектром иммунобиологической активности. Высокомолекулярные агрегированные нативные формы рНб антигена не обладали протективностью, а при совместном введении с капсульным антигеном снижали протективные свойства последнего. Иммунизация деполимеризованными препаратами рНб антигена индуцировала у животных иммуносупрессию.

Основные теоретические итоги проделанной работы заключаются в расшифровке молекулярной организации липоолигосахаридов возбудителя чумы, идентификации молекулярных основ вариабельности их углеводного и жирнокислотного состава, определении роли выявленных особенностей организации липоолигосахаридов в патогенезе заболевания и адаптации возбудителя к существованию в различных условиях окружающей среды. Вскрыт первый пласт в изучении изменчивости липоолигосахаридов возбудителя чумы, как явления уникального, позволяющего по-иному взглянуть на процесс взаимодействия патогена и хозяина, меняющего общепринятую точку зрения на механизмы реализации вирулентности микроорганизмов.

Определена методология конструирования иммунопрофилактических противочумных препаратов, которая учитывает вариабельность основных протективных антигенов чумного микроба, обладающих способностью защиты от чумы в самые ранние сроки после вакцинации. Полученные результаты способствуют более глубокому пониманию тонких молекулярных механизмов, лежащих в основе взаимодействия возбудителя чумы с организмом хозяина, что, в свою очередь, открывает перспективы разработки новых стратегий противодействия патогену.

Создана коллекция препаратов ЛОС, выделенных из различных штаммов Y.pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, E. coli, S. minnesota, а также их детоксифицированных производных. Полученные препараты были использованы для изучения химической структуры ЛОС возбудителя чумы (Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва), молекулярных механизмов воздействия ЛОС на альвеолярные макрофаги (Институт инженерной иммунологии, п. Любучаны Московской обл.), молекулярной организации ЛОС Y.pestis и их иммунобиологических свойств (ГНЦ прикладной микробиологии, п. Оболенск).

Получен набор антисывороток и создана коллекция моноклональных антител к капсульному антигену и ЛОС, используемых в ГНЦГГМдля тестирования соответствующих препаратов. Создана коллекция штаммов-продуцентов капсульного антигена чумного микроба. На штамм S. minnesota R595pFSl, депонированный в РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), получен Российский патент на изобретение № 2046145. Этот штамм используется для получения высокоимму-ногенных препаратов капсульного антигена. Сконструирован штамм S. typhimurium SL3261pFSl, стабильно наследующий рекомбинантную плазмиду in vitro yl in vivo. Штамм используется для определения эффективности различных систем доставки капсульного антигена при формировании протективного противочумного иммунитета.

Изучена чувствительность к бактериофагам вирулентных и авирулентных штаммов Kpestis из коллекций живых культур ГНЦПМ, РосНИПЧИ «Микроб», НИПЧИ Сибири и Даль-

него Востока, что выявило их популяционную гетерогенность в отношении ЛОС. На основании данных о варьировании чувствительности штаммов возбудителя чумы, изолированных в различных природных очагах, к бактериофагам, предложены дополнительные методы для внутривидовой дифференциации патогена.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов:

1. Методика лабораторная способа использования стандартного инокулята для проверки
ростовых качеств плотных питательных сред Утверждена 27.04.1990 зам. директора ВНИИПМ
проф. Волковым В.Я. (учрежденческий уровень внедрения).

1. Методика лабораторная по усовершенствованию питательной среды для периодического глубинного культивирования с аэрацией в колбах вакцинного штамма чумного микроба EV НИИЭГ при температуре 27 С. Утверждена 30.07.1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Боровиком Р. В.

2. Методика лабораторная оценки качества жидких питательных сред с помощью рефе-ренс-инокулята. Утверждена 21.05. 1990 зам. директора ВНИИПМ проф. Волковым В.Я.

Методические приемы, разработанные в ходе работы над диссертацией, штаммы-продуценты, очищенные препараты антигенов, антисыворотки и моноклональные антитела, а также диагностические системы в настоящее время применяются в микробиологических, генетических, молекулярно-биологических, иммунологических и других исследованиях ряда лабораторий ГНЦПМ (Оболенск), РосНИПЧИ "Микроб" (Саратов), НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока (Иркутск), ИОХ им. Н.Д. Зелинского РАН (Москва), ИБХ им. ММШемякина и Ю.А.Овчинникова РАН (Москва).

Материалы диссертации доложены и представлены на итоговых научных конференциях ГосНИИПМ (Оболенск, 1986, 1987, 1989, 1990); межведомственной научной конференции "Актуальные вопросы профилактики опасных инфекционных заболеваний" (Киров, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИПМ "Новыетехнологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); IV Всероссийском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нижний Новгород, 1991), Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993), межгосударственной научной конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Профилактика и меры борьбы с чумой" (Алматы, 1994); I съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994); межгосударственной научно-практической конференции, посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы "Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний" (Ставрополь, 1994); международной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1996), 3^rd John Humphrey Advanced Summer School "Cell and molecular biological aspects of immunology" (Пущино, 1996); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997); 4 * конференции по бактериальной защите (Munich), Germany, 1997); совместном Американо-Российском семинаре в USAMRIID (Fort Detrick, USA, 1997), International Workshop in the Institute for Experimental Medicine and Bio-sciences (Borstel, Germany, 1998), 7^th International Congress on Yersinia (Nijmcgcn, the Netherlands, 1998), 4^th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущино, 1998); 8^th International Congress on Yersinia (Turku, Finland, 2002), Carbohydrate Workshop (GOstTOW-Rostock,

Germany, 2003); XII^,h European Carbohydrate Symposium (Grenoble, France, 2003); 2-ом Московском международном Конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (Москва, 2003).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научной конференции ГНЦ ПМ 5 мая 2003 г. (протокол № 1).

Основное содержание работы отражено в 55 научных публикациях (из которых 11 в центральной печати и 14 в материалах международных конференций и симпозиумов), в том числе в авторском свидетельстве на изобретение и патенте. Список публикаций приводится в конце автореферата.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ