Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Стрептококки группы В 11
1.1.1 Заболевания, вызванные стрептококками группы В 11
1.1.2 Факторы патогенности стрептококков группы В 13
1.2 Мобильные генетические элементы 19
1.2.1 Виды мобильных генетических элементов и способы их передачи 19
1.2.2 Мобильные генетические элементы стрептококков группы В 23
1.3 Острова патогенности 25
1.3.1 Общая характеристика островов патогенности 25
1.3.2 Острова патогенности стрептококков группы В 29
1.4 Заключение по обзору литературы 32
2 Материалы и методы 35
2.1 Материалы исследования 35
2.1.1 Характеристика используемых материалов 35
2.1.2 Оборудование 36
2.1.3 Объекты исследования 37
2.2 Методы исследования 38
2.2.1 Компьютерный анализ 38
2.2.Выделение геномной ДНК фенол-хлороформным методом 38
2.2.3 Выделение геномной ДНК набором ДНК-экспресс 39
2.2.4 Полимеразная цепная реакция 39
2.2.5 Мультиплексная полимеразная цепная реакция 43
2.2.6 Масс-спектрометрия штаммов стрептококков группы В 44
2.2.7 Рестрикция ДНК 45
2.2.8 Лигирование ДНК 45
2.2.9 Трансформация кишечной палочки
2.2.10 Схема создания слитой конструкции 46
2.2.11 Секвенирование 46
3 Результаты исследования 48
3.1 Определение серотипов СГВ с помощью мультиплексной ПЦР 48
3.2 Молекулярно-генетическая организация и распространенность острова патогенности XII з
3.3 Статистическая обработка результатов ПЦР с штаммами на гены острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl 59
3.4 Масс-спектрометрический анализ штаммов стрептококков группы В 61
3.5 Создание рекомбинантных конструкций для экспрессии и инактивации гена sspBl 63
3.6 Сравнительный анализ белков SspBl и SspBla с гомологичными белками других микроорганизмов 69
3.7 Определение распространенности гена sspBla 71
3.8 Определение области интеграции острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl 72
3.9 Сравнительный анализ острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl, с островом патогенности, ассоциированным с геном sspBla 83
3.10 Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов, ассоциированных с геном sspBla 85
4 Обсуждение 88
Заключение 95
Выводы 97
Список сокращений 98
Список литературы
- Факторы патогенности стрептококков группы В
- Методы исследования
- Статистическая обработка результатов ПЦР с штаммами на гены острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl
- Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов, ассоциированных с геном sspBla
Факторы патогенности стрептококков группы В
В настоящее время известны полногеномные нуклеотидные последовательности 11 штаммов стрептококков группы В: 3 штамма, выделенные от человека, 1 штамм - от коровы, 2 штамма - от верблюдов, 5 штаммов - от рыб [33; 34; 35; 52; 53; 54; 55; 82; 103; 107].
У СГВ обнаружены различные факторы патогенности, благодаря которым стрептококк проявляет свои болезнетворные свойства. К факторам патогенности относятся как полисахариды, так и белки.
Полисахаридная капсула - это основной фактор патогенности СГВ, который дает возможность бактерии уклоняться от врожденных и приобретенных механизмов иммунной защиты хозяина [25; 83]. Капсула СГВ состоит из остатков глюкозы, галактозы, N-ацетилнейраминовой (сиаловой) кислоты. У ряда серотипов в состав входит N-ацетилглюкозамин и рамноза. Ее антигенные различия определяются порядком соединения вышеупомянутых веществ в полимерную структуру [14].
Данные отличия положены в основу классификации СГВ. В настоящее время их разделяют на 10 серотипов [24]. В России наиболее распространены серотипы lb и III [6; 14]. Серотип 1а преобладает среди штаммов, вызывающих инвазивные заболевания взрослых людей в Португалии [43]. В Японии среди беременных женщин доминируют VI и VIII серотипы, а в Индии преобладают серотипы 1а, III, V, VII [109]. В Нидерландах и Тайване преобладает III серотип среди штаммов СГВ, вызывающих заболевания новорожденных. Среди колонизирующих штаммов в Нидерландах доминировал II серотип, а в Тайване - V [48]. Серотипы III, la, lb, II и V преобладают среди штаммов из американского, африканского, азиатского, европейского, средиземноморского, тихоокеанского регионов ВОЗ, обнаруженных у новорожденных детей младше трех месяцев [61]. Серотип 1а преобладает у СГВ, вызывающих маститы у коров в Восточном Китае и Германии [87]. Среди СГВ серотипов la, lb и III, обнаруженных у рыб, доминировал серотип 1а [105].
Помимо полисахаридов на поверхности СГВ локализованы белковые структуры, часть из которых относится к факторам патогенности.
Белок а и а-подобные белки относят к факторам патогенности СГВ. К а-подобным белкам относят Alp 2, Alp 3, Alp 4, Alpha С, Epsilon и Rib [19]. Поверхностный Alpha С белок способствует попаданию СГВ в цервикальные эпителиальные клетки человека [74].
Другим фактором патогенности является р белок (Вас), который взаимодействует с двумя компонентами иммунной системы человека: Fc фрагментом иммуноглобулина А и фактором Н. Авторы предполагают, что он играет роль в уклонении от иммунного распознавания специфическими антителами [81]. К факторам патогенности СГВ также относится ScaAB, который является липопротеином, участвующим в транспорте двухвалентных металлов и в процессе адгезии, его относят к семейству Lral [10]. Ген данного липопротеина был обнаружен у всех штаммов СГВ [14].
Фибриноген-связывающий белок FbsA является фактором патогенности, который связывается с фибриногеном, что играет значительную роль в адгезии бактерий и их защите от иммунной системы [16; 81]. Существует и другой фибриноген-связывающий белок, обозначенный как FbsB или Fgag, несвязанный с FbsA. Считается, что он может вносить вклад в бактериальную инвазию эпителиальных клеток человека [81].
В патогенезе стрептококков группы В важную роль играет Р-гемолизин, представляющий собой экзотоксин [ПО]. Он необходим для развития инвазивных заболеваний и сильно влияет на внутриклеточное выживание СГВ в клетках хозяина [122]. Р-гемолизин способствует инвазии СГВ в эпителиальные и эндотелиальные клетки легких и гематоэнцефалического барьера [104].
Другим фактором патогенности является CAMP фактор, представляющий собой порообразующий гемолизин, действующий совместно с Р-токсином Staphylococcus aureus [14]. Данные по принадлежности CAMP фактора к факторам патогенности противоречат друг другу. Одни авторы показали, что инъекции очищенного CAMP фактора могут увеличивать смертность кроликов и мышей, тогда как другие авторы не смогли продемонстрировать какого-либо эффекта на патогенность СГВ путем делеции гена, кодирующего CAMP фактор [26].
На поверхности СГВ выделяют адгезии BibA, который является консервативным, заякоренным в клеточную стенку белком. Данный белок способствует адгезии СГВ к эпителиальным клеткам и выживанию стрептококков группы В в крови человека [23].
Фактор патогенности LrrG - поверхностный белок, содержащий лейцин-богатый повтор. Данный белок способен защищать лабораторных животных от экспериментальной СГВ инфекции, а также участвует в адгезии бактерий к эпителиальным клеткам [27].
Пили также относятся к факторам патогенности СГВ. Они состоят из двух или трёх различных субъединиц, которые являются белками LPXTG, то есть заякоренными в клеточной стенке. Их сборка происходит с помощью фермента сортазы С. Заякоривание происходит с помощью сортазы А. Пили являются адгезивными органеллами, которые вносят вклад в бактериальную адгезию, колонизацию тканей хозяина и в образование биопленок [38]. Например, они способствуют адгезии к эндотелию микрососудов мозга человека и цервикальным эпителиальным клеткам [97]. Способность пилей содействовать в выживании в кишечнике человека позволяет рассматривать их как «факторы ниши», а не как факторы патогенности [38; 68]. Пили кодируются на островах патогенности, которые обозначили как PL У СГВ обнаружено три варианта PL РГ1, Р1-2а и Р1-2Ь [38; 75]. Подробнее о каждом из них написано в главе 3.
Факторами патогенности СГВ также являются гликопротеины, богатые сериновыми повторами (Srrl и Srr2). Srrl связывает фибриноген человека путем взаимодействия с Аа цепью данного белка, что может вносить вклад в формирование инфекционного эндокардита [112].
Другим фактором патогенности является С5а пептидаза, которая представляет собой сериновую протеазу, которая расщепляет и инактивирует компонент С5а комплемента человека [37; 113]. Она связывает фибронектин и способствует бактериальной инвазии в эпителиальные клетки [81]. Ген scpB, кодирующий С5а пептидазу, был обнаружен у 100% изолятов, выделенных от человека [30]. По данным других авторов ген scpB присутствовал у 98% штаммов, выделенных от людей, и у 44% штаммов от коров [45].
Методы исследования
К мобильным генетическим элементам относятся плазмиды, бактериофаги, интегроны, транспозоны, а также более крупные генетические образования - так называемые «острова патогенности». Гены, локализованные на островах патогенности, часто рассматриваются как молекулярные маркеры для диагностирования бактериальных патогенов. Острова патогенности играют важную роль в патогенезе инфекционных заболеваний бактериальной природы, способствуют быстрой адаптации к новым условиям окружающей среды и повышают вирулентный фенотип бактерии.
У СГВ обнаружено до 15 островов патогенности, различающихся по организации, структурным особенностям и размерам. Однако в большинстве случаев области генома, обозначаемые в качестве островов патогенности, выявляются исключительно посредством биоинформационного анализа без детального анализа их структуры и находящихся на островах генов. Считается, что острова патогенности вносят вклад в быстрые эволюционные изменения бактерий, однако данные элементы широко представленные у СГВ практически не изучены. По данным литературы известно, что остров патогенности XII начинается с гена gbsl296, а заканчивается геном gbsl373. Ген sspBl локализован на острове патогенности XII и его обнаружение коррелирует с более частым возникновением инфекций урогенитального тракта. В связи с ассоциацией гена sspBl с инфекциями в мочеполовом тракте, было сделано предположение, что и другие гены на острове патогенности XII, могут участвовать в развитии инфекции. Так гены scpB и Imb, кодирующие известные факторы патогенности С5а-пептидазу и ламинин-связывающий белок соответственно, также расположены на острове патогенности XII [51]. По данным других авторов они локализованы на сложном транспозоне [47; 69]. Часть генов острова патогенности XII, локализованных в штамме 2603V/R, имеют высокую степень гомологии с генами острова патогенности 89К Streptococcus suis [17]. Tettelin и соавторы полагают, что гены sagl247-sagl299 штамма 2603V/R расположены на конъюгативном транспозоне [33]. Однако эти же гены входят в состав острова патогенности XII, согласно Herbert и соавторам [51]. По данным Brochet и соавторов в штаммах NEM316 и 2603 V/R локализованы 2 разных интегративных конъюгативных элемента, которые имеют как сходства, так и отличия [77]. У гена sspBl существует гомолог sspBla, также локализованный на мобильном генетическом элементе. В связи с противоречивыми литературными данными, необходимо сравнить организацию мобильных генетических элементов, содержащих гены sspBl и sspBla. Их распространенность среди штаммов стрептококков группы В, циркулирующих в России, практически неизвестна. Для того чтобы объяснить существующие противоречия в научной литературе следовало определить организацию различных вариантов острова патогенности XII и его распространенность, что позволило бы создать новые генетические маркеры для выявления наиболее вирулентных штаммов стрептококков группы В. Все вышеперечисленное определило цели и задачи данного исследования. 2 Материалы и методы
Праймеры создавались с помощью компьютерной программы Primer 3.0. G+C состав генов определяли с помощью программы FastPCR. Статистический анализ осуществлялся с помощью программы Statistica ver.10. При представлении нуклеотидной последовательности в виде вторичной структуры использовалась компьютерная программа The mfold Web Server (http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form). Филогенетический анализ осуществлялся с помощью программы MEGA 6 методом Maximum Parsimony.
Изолированную колонию СГВ посеяли с агаризованной среды в 10 мл бульона ТНВ. Клетки инкубировали при 37С в течение ночи. Культуру центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре. Осадок ресуспендировали в 500 мкл ТЕ буфера (Трис-HCl ЮтМ, рН=8,0, ЭДТА 1 шМ рН=8,0), содержащего 1 мг лизоцима. Клетки инкубировали при 37С в течение часа при периодическом перемешивании. После добавления 4 мкл протеинкиназы К (20 mg/ml ТЕ) была проведена инкубация при 65С в течение 15 минут. Затем добавили 70 мкл 10% SDS (натрий додецил сульфат) и инкубировали при 65С в течение 45 минут. Лизированные клетки смешали с одним объемом фенола и перемешивали в течение 4 минут. Затем провели центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 минут. Отобрали верхнюю фракцию, к которой добавили 1 объем смеси фенол-хлороформ (1:1), и перемешивали в течение 4 минут. Смесь центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 минут. Отобрали верхнюю фракцию, к которой добавили 1 объем хлороформа, и перемешивали в течение 4 минут. Провели центрифугирование, а затем к верхней фракции, содержащей ДНК, добавили 2,5 объема 96% спирта, охлажденного до -20С. Плавно перемешали и инкубировали при -20С в течение ночи. Затем провели центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 минут. ДНК отмыли 70% спиртом и ресуспендировали в 100 мкл ТЕ буфера или воды.
Статистическая обработка результатов ПЦР с штаммами на гены острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl
На острове патогенности XII были локализованы гены факторов патогенности: scpB, Imb, sspBl, гены лактозного оперона, системы токсин-антитоксин, транспозазы, интегразы, релаксазы, системы хромосомной сегрегации, системы абортивной инфекции, метилтрансферазы, система секреции IVC типа. Наибольшее внимание было обращено на гены острова вокруг гена sspBl (gbsl356), так как была обнаружена корреляция между наличием данного гена и инфекцией урогенитального тракта [1]. Гены gbsl359, gbsl360, gbsl362, gbsl364, по литературным данным, относятся к компонентам системы секреции IVC типа, характерной для грамположительных бактерий [130]. G+C состав большинства генов острова отличался от G+C состава, характерного для СГВ.
С целью определения распространенности и организации острова патогенности, ассоциированного с геном sspBl, для дальнейшего исследования были выбраны следующие гены: gbsl343, gbsl348, gbsl352, gbsl356 (sspBl), gbsl360, gbsl364, gbsl376. Данные гены кодируют следующие белки: zeta токсин, белок Zn-finger, метилтрансферазу, SspBl, компонент системы секреции IVC VirB4, компонент системы секреции IVC VirD4, АТФ-зависимую протеазу. Ген gbsl376 локализован за пределами острова патогенности, поэтому был выбран в качестве положительного контроля ПНР. Присутствие острова патогенности XII в геномах штаммов оценивали по наличию генов, локализованных на острове и прилежащих к гену sspBl. Для детекции выбранных генов в штаммах СГВ были сконструированы праймеры, которые представлены в таблице 1. С помощью ПНР было определено, что в геноме 090R штамма присутствуют все гены, выбранные для первичного анализа.
На следующем этапе работы был проведен анализ остальных штаммов СГВ, выбранных для исследования. С помощью полимеразной цепной реакции проанализирована распространенность исследуемых генов в геномах штаммов из России (Санкт-Петербурга), а также из ряда зарубежных стран (таблица 4). Ген gbsl376, кодирующий АТФ-зависимую С1р протеазу, локализованный за пределами острова, присутствовал в геномах всех штаммов из России. Гены острова патогенности были обнаружены в геномах 16 из 113 штаммов из России. Однако у 5 штаммов отсутствовали ген gbsl343, кодирующий zeta токсин, и ген gbsl364, кодирующий компонент VirD4 системы секреции IVC, а у одного штамма не было обнаружено гена gbsl352, кодирующего метилтрансферазу, и гена gbsl364, кодирующего компонент VirD4 системы секреции IVC. Так как остальные гены присутствовали в геномах данных штаммов, то было сделано заключение, что остров патогенности локализован в геномах этих штаммов. Однако у двух штаммов (05н/08, 05у/08) были обнаружены только гены gbsl348 и gbsl352, кодирующие белок Zn-finger и метилтрансферазу соответственно, поэтому в данных штаммах остров отсутствовал. У одного штамма (506) присутствовал только ген gbsl343, кодирующий zeta токсин. Поскольку ген zeta токсина мог быть локализован на другом участке хромосомы или на плазмиде, логично допустить, что в штамме 506 отсутствует остров патогенности.
Таким образом, остров патогенности XII был обнаружен в геномах 16 из 113 штаммов из России, что составило 14%. При этом он характеризовался гетерогенностью.
Для определения распространенности острова в различных регионах мира были проанализированы коллекции штаммов из США, Германии, Великобритании, Португалии и референс штаммы из Чешской республики посредством ПЦР (таблица 4).
В геномах всех штаммов из США, Германии, Великобритании, Португалии и Чешской республики был обнаружен только ген gbsl376, не относящийся к острову патогенности. В геномах 59 штаммов из зарубежных стран не удалось обнаружить исследуемые гены, что свидетельствовало об отсутствии данного острова патогенности в проанализированных штаммах (таблица 4).
Таким образом, остров патогенности обнаружен только в геномах 16 из 113 штаммов из России и не был обнаружен в геномах 59 штаммов из зарубежных стран. Таблица 4 - Анализ штаммов стрептококков группы В методом ПЦР
Штаммы из России, в геномах которых были обнаружены гены острова патогенности, принадлежали к разным серотипам, то есть сопоставление данных мультиплексного типирования с результатами анализа на локализацию генов острова показало, что не существует корреляции между наличием острова патогенности и серотипом СГВ (таблица 5).
Анализ штаммов из Португалии и Анголы на наличие генов, ассоциированных с геном sspBla
Стрептококки группы В являются причиной возникновения тяжелых заболеваний новорожденных и взрослых людей. СГВ обладают различными мобильными генетическими элементами, способствующими быстрой адаптации к новым условиям окружающей среды. Данная работа посвящена исследованию острова патогенности XII стрептококков группы В.
Первоначально нумерация островов патогенности у СГВ была введена для штамма NEM316 [54]. Дальнейший анализ мобильных генетических элементов в геноме СГВ позволил выявить наличие сходного острова несколько отличающегося по организации. На острове патогенности XII СГВ было локализовано несколько генов патогенности, включая гены С5а пептидазы, ламинин-связывающего белка и адгезина sspBl, наличие которого в геноме штаммов СГВ коррелирует с возникновением инфекций в урогенитальном тракте [1; 41; 54]. В отличие от первоначально охарактеризованного PAI XII в штаммах с другой организацией острова вместо гена sspBl обнаруживался его аналог, обозначенный как sspBla.
В процессе анализа свойств гена sspBl созданы конструкции для экспрессии и инактивации гена sspBl, которые могут быть использованы при создании вакцины против стрептококков группы В и для определения вклада гена sspBl в формирование вирулентных свойств СГВ соответственно.
Для исследования состава и структурных особенностей генов СГВ, расположенных на острове патогенности XII, был проведен компьютерный анализ каждой из открытых рамок считывания с помощью программы BLAST. В результате компьютерного анализа последовательностей в базе данных GenBank были сконструированы ДНК праймеры для проведения ПНР на ДНК из коллекции штаммов, выделенных в России и ряде зарубежных стран. Распространенность острова патогенности XII составила 14% и 0% среди штаммов СГВ из России и зарубежных стран соответственно. Коллекции штаммов СГВ из России, США, Германии были охарактеризованы с использованием мультиплексной ПЦР на гены капсульного оперона [90]. При сопоставлении данных мультиплексного типирования с результатами анализа распространенности острова патогенности XII было обнаружено, что выбранные в исследовании штаммы принадлежали разным серотипам, но не существует корреляции между наличием РАІ XII и серотипом СГВ.
С помощью точного критерия Фишера была проверена гипотеза о связи двух качественных признаков: наличия острова патогенности и происхождения штаммов. Частота встречаемости острова патогенности XII в геномах штаммов СГВ из зарубежных стран оказалась достоверно ниже, чем в геномах штаммов из России (р 0,05).
Штаммы СГВ с островом патогенности XII и без него были проанализированы с использованием масс-спектрометрии в диапазоне молекулярных весов от 2000 до 18000 Да, однако отличия не были выявлены, что указывает на недостаточную разрешающую способность данного метода детектировать белки, кодируемые генами РАІXII.
В связи с отсутствием гена sspBl в штаммах зарубежного происхождения, был проведен сравнительный компьютерный анализ белка SspBl и его гомолога SspBl а. В результате анализа обнаружили, что белок SspBla имеет более высокую степень гомологии с белками других микроорганизмов, что свидетельствует о большей распространенности белка SspBla по сравнению с белком SspBl. По результатам филогенетического анализа можно сделать предположение о том, что ген, кодирующий белок SspBl, принадлежал к геному общего предка с бактериями, содержащими гомологи SspBla, после чего в процессе эволюции произошла дивергенция данных генов, которые в настоящее время обнаруживаются в различных штаммах СГВ (рисунок 18). Не исключено, что гены sspBl и sspBla попали в СГВ из различных хозяев в процессе горизонтального переноса. Поэтому штаммы СГВ из зарубежных стран и штаммы из России, у которых отсутствовал ген sspBl, проанализировали на наличие гена sspBla. В результате было обнаружено, что распространенность гена sspBla среди штаммов СГВ оказалась значительно выше по сравнению с геном sspBl, что подтверждает компьютерный анализ.
Исследование распространенности острова патогенности XII среди штаммов СГВ выявило определенное противоречие. Известно, что ген scpB, первоначально локализованный на PAI XII, встречается у 100% штаммов, выделенных у людей [30; 37; 54]. Однако по результатам ПЦР анализа остров патогенности XII был обнаружен у 14% штаммов СГВ из России. В связи с этим было сделано предположение о том, что ген scpB не принадлежит к PAI XII, а локализован на другом генетическом элементе. По мнению Franken с соавторами и Al Safadi с соавторами гены scpB и Imb входят в состав сложного транспозона [47; 69]. В результате полимеразной цепной реакции и компьютерного анализа было сделано предположение о том, что PAI XII состоит из трех мобильных генетических элементов (рисунок 23).
В межгенном пространстве генов gbsl324-gbsl325 и gbsl373-gbsl374 были обнаружены нуклеотидные последовательности, образующие вторичные структуры в виде «шпилек» (рисунок 20). Наличие двух «шпилек» в областях gbsl324-gbsl325 и gbsl373-gbsl374 позволяет предположить, что в данных участках могла происходить ошибка репликации хромосомной ДНК с «выщеплением» мобильного элемента в виде автономного ДНК фрагмента.
По литературным данным в геноме штамма 2603 V/R в области острова патогенности XII присутствуют гомологи генов, локализованных на PAI 89К Streptococcus suis [17]. PAI 89К фланкирован прямыми повторами attR и attL (TTATTTAAGAGTAAC) [58]. Такие же прямые повторы были обнаружены Brochet и соавторами на интегративных конъюгативных элементах штаммов NEM316, 2603V/R, А909, прилегающих к гену рибосомного белка [77]. В результате компьютерного анализа геномов штаммов СГВ такие же повторы были обнаружены на 3 конце гена gbsl374, кодирующего рибосомный белок 50S, и в межгенном пространстве генов gbsl313-gbsl314, gbsl324-gbsl325. Повторы в межгенном пространстве gbsl313-gbsl314, gbsl324-gbsl325 и на 3 конце гена gbsl374 подтверждают гипотезу, выдвинутую на основании результатов ПЦР, о том, что остров патогенности XII состоит из трех мобильных генетических элементов. Способность острова патогенности PAI-A и геномного островка PAI-B выходить из генома как совместно, так и по отдельности была показана с использованием ПЦР анализа (рисунки 24 и 25).
В связи с тем, что остров патогенности XII был разделен на три части, вышеупомянутые результаты о распространенности острова патогенности XII относятся к острову патогенности, ассоциированному с геном sspBl и обозначенному в данном исследовании как PAI-A. Таким образом, распространенность острова патогенности PAI-A составляет 14% и 0% среди штаммов СГВ из России и зарубежных стран соответственно