Введение к работе
Актуальность проблемы. Симбиоз межпу бобовыми растениями и-клубеньковыми --бактериями приводит к связыванию атмосферного азота и к переводу его в доступную для растения восстановленную форму. Биолоіичсская фиксация азота является экологически чистой и экономичной альтернативой применению минеральных удобрений. Бобово -ризобиальный симбиоз можно представить как молекулярный диалог между партнерами, в котором появление очередной сигнальной молекулы зависит от понимания предыдущей. В этом диалоге к настоящему времени наиболее полно охарактеризованы два этапа; выделение растением сигаалов флавоноидной природы, регулирующих экспрессию бактериальных nod іенов, и синтез бактериями продуктов nod генов - Nod факторов -олигомеров хитина, стимулирующих деления клеток коры корня растения, приводящие к образованию клубеньков (Long, 1989).
Химическая структура сигнальных молекул, выделяемых партнерами, определяет специфичность симбиоза (Zaat et al., 1987; Truchet et al., 1991; Spaink et al., 1991). В лаборатории биотехнологии ВЫИИСХМБ изучается высокоспецифичная симбиотическая система - линии гороха афганского происхождения, несущие в гомозиготе ген sym2 и незаражаемые обычными европейскими штаммами ризобий, и штамм А1, способный образовывать клубеньки на этих линиях. Биохимические основы этого взаимодействия не изучались, и причины расширенной хозяйской специфичности у штамма А1 не были известны.
В связи с эшм нами было предпринято изучение активности, состава и структуры сшнальных молекул, синтезируемых на начальных стадиях симбиоза растениями гороха и бактериями и выявление генетических детерминант, требующихся штамму для заражения афганского гороха. Данная работа выполнялась при финансировании программой "Интербиоазот - 2000" и грантами РФФИ, 1SF, INTAS, NWO (Нидерланды) и LNV (стипендия от Министерства сельского хозяйства Нидерландов). Часть работ выполнялась в лаборатории академика РАСХН, профессора Б. Люхтенберга, Лейденский Университет.
Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось исследование молекулярно -генетических механизмов избирательного заражения через определение особенностей продукции сигнальных молекул на ранних стадиях симбиоза между штаммом А1 Rhizobium leguminosarum bv. viceue и линиями гороха афганского происхождения. Конкрентныс задачи исследования состояли в следующем:
провести сравнительный анализ количественного и качественного состава флавоноидов в корневых эксудатах афганских и европейских линий гороха;
изучить специфичность состава Nod метаболитов, продуцируемых штаммом А1;
определить генетические факторы, необходимые для синтеза специфических молекул, участвующих в данном симбиотическом взаимодействии;
протестировать биологическую активность Nod метаболитов, выделямых штаммом А1 и эталонным штаммом CIAM1026, in planta и in vitro;
на основании полученных данных выявить факторы, придающие штамму А1 способность к заражению линий гороха афганского происхождения;
- разработать способ направленного конструирования штаммов с заданным составом
сигнальных молекул.
Научная новизна. В работе проанализирован состав сигнальных молекул, участвующих в ранних стадиях симбиоза между штаммом Al R.leguminosarum и афганскими линиями гороха. Методами TLC и HPLC проведено сравнение состава фтавоноидсодержащих фракций корневых эксудатов гороха европейских и афганских линий и охарактеризован состав Nod метаболитов, синтезируемых штаммом А1.
Впервые показано, что к заражению афганских форм гороха способен штамм с высокой продукцией Nod факторов - А1.
Определена структура Nod факторов штамма А1. Штамм А1 является первым выделенным из почв Северо - Запада штаммом R.leguminosarum bv. viceae, у которого в составе Nod факторов описаны дважды ацетилированные молекулы. Среди Nod факторов штамма А1 впервые обнаружены молекулы, несущие в качестве заместителей редкие жирные кислоты.
Впервые определена последовательность гена nodX из штамма А1, и показана его гомология гену nodX штамма ТОМ.
Впервые продемонстрировано, что фактором, достаточным для придания штамму R.leguminosarum bv. viceae способности к заражению афганского гороха, является наличие в С-б позищш редуцирующего конца Nod фактора не только ацетильной, но и фукозильной группировки.
Обнаружены различия в деформациях корневых волосков в комплементарных и некомплементарных симбиотических взаимодействиях.
На культурах тканей гороха показаны митогенный и некротизиругощий эффекты бактериальных метаболитов. Найдена корреляция между гормональным статусом растения и его чувствительностью к действию Nod факторов.
Практическая значимость. Знание механизмов хозяйской специфичности позволяет создавать высококомплементарные симбиотические пары, где микросимбионт обладает признаками повышенной эффективности азотфиксашш и конкурентоспособности, а макросимбионт устойчив к заражению аборигенными ризобиальными штаммами и способен отбирать из почвы внесенный штамм. Данная проблема - регулирование
процессов узнавания растением почвенных ризобий - является ключевой для понимания вопросов конкурентоспособности. Именно для гороха, довольно слабо отзывчивой на инокуляиию культуры, - направленное _ регулирование процессов узнавания является наиболее актуальным. Результаты данной работы открывают возможность не только селекции природных штаммов, избирательно заражающих афганский горох, но и возможность генетического конструирования таких штаммов. Результаты данной работы используются при селекции юроха с повышенной избирательностью заражения в Институте зернобобовых культур (г.Орел) в совместной работе с Т. С. Наумкиной.
Атіробщия.рзіжгьі. Результаты работы докладывались на 1-й Европейской конференции но азотфиксации (Сегед, Венгрия. 1994), 9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксании (Москва, 1995), 1-м съезде ВОГИС (Саратов, 1994), X Международном кошрессе но азотфиксации (Санкт - Петербург, 1995), 2-й Европейской конференции по азотфиксации (Познань, Польша, 1996).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания