Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Общая характеристика микромицетов рода Fusarium 11
1.1.1. Систематическое положение, морфология и распространение микромицетов рода Fusarium 11
1.1.2. Фитопатогенные свойства грибов рода Fusarium 14
1.1.3. Основные токсины, продуцируемые Fusarium 17
1.2. Общие представления о лектинах: определение, свойства, распространение и классификация 21
1.3. Лектины микромицетов: характеристика и классификация 26
1.4. Роль лектинов микромицетов в проблемах поверхностного взаимодействия клеток 30
1.4. Применение лектинов в сельском хозяйстве 38
1.5. Заключение 42
Экспериментальная часть 44
Глава 2. Материалы и методы 44
2.1. Объекты исследования 44
2.2. Состав сред для культивирования микроорганизмов 44
2.3. Выделение микромицетов из природных источников 45
2.4. Морфологическая и молекулярно-генетическая идентификация 45
2.5. Филогенетический анализ нуклеотидных послеловательностей 46
2.6. Определение фитопатогенности микромицетов 48
2.7. Выделение лектинов мицелия грибов 49
2.8. Поготовка эритроцитов к реакции гемагглютинации и их модификация. 50
2.9. Определение активности лектинов микромицетов 50
2.10. Определение специфичности поверхностных лектинов микромицетов к углеводам 51
2.11. Выделение и очистка поверхностного лектина фитопатогенного микромицета F.solani 6 51
2.12. Выделение и очистка поверхностного лектина сапрофитного микромицета F.solani 4 52
2.13. Определение чистоты и молекулярной массы лектинов 54
2.14. Масс-спектрометрическое определение структуры лектинов 55
2.15. Определение температурных рН-значений лектинов 55
2.16. Определение влияния ионов металлов и ЭДТА на активность лектинов 56
2.17. Изучение вличния поверхностного лектина F.solani 6 на устойчивость растений к фузариозу 56
2.18. Изучение влияние поверхностного лектина F.solani 6 на активность пероксидазы гороха 57
2.19. Определение концентрации белка 57
2.20. Статистическая обработка данных 58
Глава 3. Результаты исследований 59
3.1. Определение биоразнообразия грибов рода Fusarium, распространенных на территории Республики Татарстан. Выделение и идентификация изолятов грибов рода Fusarium по комплексу физиолого морфологических признаков 59
3.2. Скрининг грибов рода Fusarium на присутствие лектинов в мицелии изолятов 62
3.3 Выявление взаимосвязи способности микромицетов рода Fusarium к синтезу лектинов и их фитопатогенностью 66
3.3.1. Фитопатогенность микромицетов вида Fusarium solani 66
3.3.2 Сравнительный скрининг микромицетов Fusarium solani на способность к синтезу активных поверхностных лектинов мицелия 72
3.4. Общая характеристика поверхностных лектинов мицелия фитопатогенных и сапрофитных штаммов микромицетов Fusarium solani 75
3.4.1 Активность поверхностных лектинов Fusarium solani в отношении эритроцитов различных групп крови 75
3.4.2 Влияние модификации эритроцитов различными ферментами на гемагглютинирующую активность поверхностных лектинов Fusarium solani 77
3.4.3 Углеводная специфичность поверхностных лектинов Fusarium solani.. 79
3.5. Выделение и очистка поверхностных лектинов мицелия фитопатогенных и сапрофитных микромицетов Fusarium solani 82
3.5.1 Молекулярно-филогенетический анализ штаммов Fusarium solani на основе секвенированной области ITS1-5.8SrDNA-ITS2 рДНК 82
3.5.2 Определение динамики накопления активных лектинов в процессе роста фитопатогенного и сапрофитного штаммов Fusarium solani 86
3.5.3 Выделение и очистка поверхностного лектина фитопатогенного микромицета F.solani 6 88
3.5.4 Выделение и очистка поверхностного лектина сапрофитного микромицета F.solani 4 93
3.6 Определение чистоты и молекулярной массы препарата лектина F.solani 4 и F.solani 6 98
3.7 Определения первичной структуры поверхностных лектинов F.solani 4 и F.solani 6 100
3.8 Изучение физико-химических свойств поверхностных лектинов сапрофита F.solani 4 и фитопатогена F.solani 6 105
3.9 Лектины микромицетов как средство защиты растений 106
3.9.1 Изучение влияние поверхностного лектина F.solani 6 на активность пероксидазы проростков гороха 110
Обсуждение результатов 112
Выводы 125
Список литературы 127
- Основные токсины, продуцируемые Fusarium
- Фитопатогенность микромицетов вида Fusarium solani
- Выделение и очистка поверхностного лектина фитопатогенного микромицета F.solani 6
- Лектины микромицетов как средство защиты растений
Введение к работе
Актуальность проблемы
В настоящее время одним из перспективных подходов к разработке биопрепаратов для защиты растений путем формирования их индуцированной устойчивости является применение соединений, участвующих в процессах патогенеза.
Известно, что на первых стадиях патогенеза растений существенную роль играют поверхностные структуры партнеров, которые вступают в определенные не до конца изученные взаимодействия. Одним из видов такого взаимодействия является углевод-белковое распознавание, где важную роль отводят лектинам.
Лектины - гемагглютинирующие гликопротеины, обладающие уникальной способностью избирательно взаимодействовать со структурами клеток тканей, содержащими углеводные детерминанты, и изменять сигналы в биологической системе [Garner, Baum, 2008; Houser, 2014]. Исследования, проводимые зарубежными лектинологами на микроскопических грибах, показывают, что лектины, находящиеся на поверхности клеток микромицетов, могут играть значимую роль в процессах патогенеза растений [Larroque et al., 2011].
Среди фитопатогенов, способных паразитировать на высших растениях,
наибольший интерес вызывают грибы рода Fusarium. Они широко
распространены природе и способны к поражению большинства
сельскохозяйственных и культурных растений [Голиков, 2003]. К активным фитопатогенам относится вид Fusarium solani - возбудитель корневой гнили, который способен поражать горох, фасоль, сою, пшеницу, томаты, огурцы, дыни и арбузы [Горленко, 1976; Bogale et al., 2009; Домаш с соавт., 2014;]. Данный вид производит широкий спектр вторичных токсичных метаболитов, микотоксинов (монилиформин и трихотецены ДОН, Т-2, зеараленон) [Монастырский, 2000; Гагкаева с соавт., 2009; Рыстаева с соавт., 2009; Carvajal-Moreno, 2015], с которыми связаны не только болезни растений, фузариозы, но и болезни человека, домашних животных, такие как микозы, гипертрофия миокарда, гематологические заболевания и другие. Высокая агрессивность этих микромицетов в значительной степени определяется особенностями жизненной стратегии и их обширным диапазоном приспособительных реакций, среди которых, и способность к синтезу поверхностных лектинов. Однако в литературе имеется незначительное количество данных о способности микромицетов рода Fusarium к синтезу лектинов, а информация по синтезу поверхностных лектинов, в том числе и фитопатогенными видами, отсутствует.
В связи с этим, учитывая важность лектинов в физиологических процессах живых организмов, является актуальным направление исследований по сравнительной характеритике лектинов сапрофитных и фитопатогенных грибов, а также процесса их биосинтеза, свойств и специфичности.
Цель работы - выделение, характеристика и изучение биохимической активности поверхностных лектинов сапрофитных и фитопатогенных грибов F.solani и их влияние на рост растений при патогенезе.
Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи:
-
Провести выделение и скрининг микромицетов рода Fusarium для выявления видовой способности штаммов продуцировать лектины.
-
Установить зависимость между активностью лектинов и фитопатогенностью изучаемых микромицетов.
-
Разработать условия получения гомогенных лектинов сапрофитного и фитопатогенного штаммов микромицетов Fusarium solani.
-
Определить физико-химические и биохимические свойства лектинов сапрофитного и фитопатогенного штаммов.
-
Изучить влияние лектина фитопатогенного штамма на рост растений при патогенезе.
Научная новизна
Впервые проведено комплексное изучение зависимости между
фитопатогенностью микромицетов и их способностью к синтезу активных лектинов. Установлено, что фитопатогенные штаммы микромицетов, независимо от условий культивирования продуцентов, синтезируют лектины более высокой степени активности по сравнению с сапрофитными штаммами.
Разработана и стандартизована схема выделения и очистки лектинов сапрофитных и фитопатогенных штаммов микромицетов Fusarium solani, позволяющая получить гомогенные препараты.
Впервые получены новые гомогенные лектины из сапрофирного и
фитопатогенного штаммов Fusarium solani, сравнительная характеристика
которых, выявила значительные различия в их молекулярной массе,
аминокислотной последовательности структуры лектинов, углеводной
специфичности, температурном - и рН - оптимуме.
Впервые обнаружено, что лектин фитопатогенного микромицета Fusarium solani обладает выраженной способностью защиты растений от фузариоза. Предварительная обработка корней растений препаратом поверхностного лектина F.solani 6 до их инфицирования фитопатогеном оказывает положительное действие на рост и развитие надземной и подземной частей растений, а также существенно уменьшает степень поражения и распространенность гнили корней гороха.
Теоретическая и научно-практическая значимость работы
Полученные в рамках диссертационной работы результаты о скрининге,
динамике образования, физико-химических свойствах, углеводной
специфичности лектина штаммов микромицетов Fusarium solani расширяют знания в области лектинологии.
Установленная зависимость активности лектинов от фитопатогенности штаммов микромицетов, позволяет рекомендовать их в качестве маркеров для экспресс анализа штаммов на фитопатогенность.
Полученные новые препараты лектинов сапрофитного и фитопатогенного микромицета Fusarium solani, могут быть использованы для экспериментов в изучении механизмов углевод-белкового и углевод-углеводного взаимодействия биологических структур, а также в расшифровке механизма патогенеза растений.
Установленная способность лектина фитопатогенного штамма микромицета F.solani 6 способствовать защите растений от фузариоза в процессе предобработки корней растений, позволяет рекомендовать его, для дальнейшего исследования в качестве потенциального препарата для сельского хозяйства.
Положения, выносимые на защиту:
-
Микромицеты, синтезирующие активные лектины, обладают выраженными фитопатогенными свойствами.
-
Сапрофитные и фитопатогенные микромицеты одного вида, при одинаковых условиях культивирования, синтезируют разные по физико-химическим свойствам и углеводной специфичности лектины.
3. Лектины фитопатогенных микромицетов F.solani могут служить
средствами защиты растений от фузариозов.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается
значительным объемом многократных лабораторных экспериментов,
выполненных и проанализированных с использованием современных
высокоточных приборов, а также опубликованием полученных результатов в международных и отечественных журналах с рецензированием ведущими учеными в данной области.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались,
обсуждались и были представлены на Итоговой научной конференции (Казань,
КФУ, 2016, 2014, 2012), I Республиканской выставке-конференции
«Биотехнология в Республике Татарстан - состояние и перспективы» (Казань, РЦИБ, декабрь 24-25, 2015), IV Международной научной Интернет - конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, КФУ, март 24-25, 2015), III Международной научной – Интернет конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» (Казань, КФУ, апрель 17-19, 2012), VII Молодежная школа-конференция с международным участием «Актуальные аспекты современной
микробиологии» (Москва, Институт микробиологии им. Виноградского РАН,
2011), 1-ая Международной Интернет-конференции "Растения и
микроорганизмы" (Казань, КФУ, 2011).
Связь работы с научными программами. Исследования выполнены в соответствии с тематическим планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета «Микробные ферменты и метаболиты как основа новых биотехнологий в сельском хозяйстве (Проект 14-83 от 2014 г.).
Работа была выполнена при финансовой поддержке гранта по
инновационным исследованиям «У.М.Н.И.К.», НИОКР по теме: «Исследования и
разработки молодыми учеными IT-систем, алгоритмов и программ, способов,
материалов, устройств, приборов и механизмов по направлениям:
информационные технологии; медицина будущего; современные материалы и технологии их создания; новые приборы и аппаратные комплексы; биотехнологии» (государственный контракт № 11717р/17263 от «05» апреля 2013г.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 9 научных работ, включая 5 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, входящих в Перечень Scopus и ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов: введение, обзор литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования, их обсуждения, выводов и списка литературы. Объем работы составляет 148 страниц, включает 16 таблиц и 29 рисунков. Библиографический список включает 58 наименований российских и 136 наименований зарубежных авторов.
Основные токсины, продуцируемые Fusarium
В настоящее время различают 6-8 основных классов микотоксинов, вырабатываемые грибами рода Fusarium, среди которых, прежде всего, выделяют токсины трихотеценового ряда (ТрМТ), фумонизины (ФУМ), зеараленоны (ЗЕН) и монилиформин (МОН), отличающиеся между собой химическим строением, токсическими, канцерогенными свойствами в отношении теплокровных животных [Гагкаева, 2011; Thrane, 2001; Mirocha et al., 2003; Bnti et al., 2017].
Трихотецены, трициклические сесквитерпеновые эпоксидные соединения, по химическому строению разделены на группу А, включающую диацетоксисцирпенол (ДАС), моноацетоксисцирпенол (МАС), неосоланиол (НЕО), Т-2 и НТ-2 токсины, и группу В, включающую дезоксиниваленол (ДОН, син. вомитоксин) и ниваленол (НИВ) и их моноацетат и диацетат производные [Ueno, 1983, Mirosha et al., 2003; Cortinovis et al., 2014; Shi, et al., 2016]. К этому классу относят более 80 микотоксинов.
Среди группы А: Т-2 и НТ-2 токсины в основном синтезируют виды F.poae, F.sporotrichioides, F.acuminatum, и F.sambucinum, МАС и ДАС - F.poae, F.sporotrichioides, F.cerealis, F.acuminatum, F.equiseti и F.sambucinum, НЕО -F.sporotrichioides, F.poae и F.acuminatum. Среди группы В: ДОН - виды F.graminearum и F.culmorum, НИВ и его производные (например, фузаренон-Х) -F.graminearum, F.poae и F.cerealis. Установлено, что виды фузариума, продуцирующие трихотецены, особенно группу В, не способны к образованию ФУМ и МОН [Proctor et al., 2003; Tan, Niessen, 2003; Proctor et al., 2004; Kristensen et al., 2005; Kristensen et al., 2007].
Наиболее токсичными считаются ТрМТ группы А, куда относят токсин-Т2, являющийся одним из наиболее токсических соединений среди микотоксинов грибов [Фисинин, Сурай, 2012; Miller et al., 2001]. Токсичность трихотеценов, главным образом, связана со способностью этих веществ ингибировать экспрессию белка у эукариотических организмов [Ferrigo, et al., 2016; Chilaka et al., 2017].
Трихотеценовые микотоксины обладают тератогенными и цитотоксическими свойствами, влияют на ЦНС и органы кроветворения, могут приводить к анемии и лейкопении, а также к пищевым отравлениям человека и теплокровных животных [Шамрай, 2010; Ferrigo, et al., 2016]. Однако физиологическое действие отдельно взятых трихотеценов значительно различаются друг от друга: T2-токсин способен вызывать алейкию и поражение желудка, печени, лёгких и сердца; ДОН -раздражение конъюнктивы и кожи; НИВ - дегенеративные изменения слизистой оболочки тонкого кишечника, лимфоузлов, селезенки и тимуса, разрушение тканей костного мозга, приводит к развитию опухолей [Леонтьев, Сербина, 2010].
Следующий класс фузариотоксинов - фумонизины - многоатомные алифатические углеводороды с 2-мя гидрофильными боковыми цепями, содержащими сфингозин. Этот обширный класс включает 28 аналогов, среди которых преимущественно встречаются ФУМ группы B с разновидностями В1 и В2. Фумонизины продуцируются видами F.oxysporum, F.moniliforme, F.vericillioides, F. proliferatum, F.redolens [Гагкаева, 2011; Гагкаева с соавт., 2011].
Токсичность ФУМ, прежде всего, обусловлена их способностью конкурировать со сфингозином, фосфолипидом цитоплазматической мембраны клеток. Встраиваясь в мембраны клеток, они нарушают их функциональные особенности и дезактивируют фермент церамидсинтазу сфингозинового обмена, что приводит к ингибированию роста клеток и последующей индукции их гибели по апоптическому типу [Леонтьев, Сербина, 2010].
Фумонизины обладают канцерогенным действием для человека и животных и могут провоцировать развитие рака, в основном пищевода [Ferrigo, et al., 2016]. У сельскохозяйственных животных, таких как свиньи и лошади они способны вызывать также отек легких и энцефаломаляцию, у птиц - диарею и увеличение печени, у КРС - нарушение работы печени и иммунной системы [Леонтьев, Сербина, 2010; Шамрай, 2010].
Фумонизины обладают фитотоксическим эффектом. Установлено, что повышенное содержание ФУМ в семенах кукурузы ингибирует прорастание, рост и развитие данных растений [Doehlert et al., 1994].
Еще один класс микотоксинов, продуцируемых грибами рода Fusarium, представляет собой зеараленоны и его производные, кислородсодержащие полициклические соединения, близкие к терпеноидам. К этому классу относят 15 микотоксинов. Синтезируют их в основном микромицеты F.graminearum, развивающиеся на хлебных злаках, а также некоторые другие виды фузариума, такие как F.culmorum, F.cerealis, F.equiseti, F.avenaceum, F.sambucinum, F.sporotrichioides и F.semitectum [Гагкаева, Гаврилова, 2009; Шамрай, 2010; Гагкаева, 2011; Chilaka et al., 2017].
Токсичность ЗЕН связана с их эстрогенным (гормоноподобным) действием. [Chilaka et al., 2017]. Зеараленоны способны физиологически конкурировать с эстрадиолом за взаимодействие с рецепторами клеточных мембран, таким образом, проникать в клетку и связываться с ее генетическим аппаратом [Леонтьев, Сербина, 2010]. У сельскохозяйственных теплокровных животных (свиньи, лошади), зеараленоны приводят к эстрогенному синдрому - нарушение репродуктивной функции. У человека способны вызывать тошноту, рвоту, диарею, анемию и серьезные психические расстройства [Леонтьев, Сербина, 2010].
Грибы рода Fusarium способны продуцировать и другие микотоксины. Так, многие штаммы видов F.solani, F.oxysporum, F.acuminatum, F.proliferatum, F.avenaceum, F.tricinctum, F.chlamydosporum и F.subglutinans образуют микотоксин под названием монилиформин [Гагкаева с соавт., 2009; Шамрай, 2010; Гагкаева, 2011]. Загрязненные данным токсином корма вызывают у свиней, утят и цыплят различные гематологические заболевания и гипертрофию миокарда [Шамрай, 2010].
Представители Fusarium, поражающие такие сельскохозяйственные растения как пшеницу, ячмень, рожь, овес, рис и кукурузу, синтезируют большое количество микотоксинов вышеперечисленных типов. По данным многих авторов, установлено, что не менее 25 % выращиваемых зерновых сельскохозяйственных растений загрязнены фузариотоксинами [Ferrigo, et al., 2016; Chilaka et al., 2017]. Среди них, в загрязненном зерне, наиболее встречаемые и опасные фузариотоксины трихотецены - ДОН и токсин-Т2. ЗЕН преимущественно накапливается в зерне кукурузы и хлебных злаков, приводя к тяжелым токсикозам человека [Chilaka et al., 2017]. Среди ФУМ в большей степени в зерновых культурах распространена разновидность B1, по всей вероятности, являющейся наиболее токсичной [Ferrigo, et al., 2016; Bnti et al., 2017]. Поражаются ими также и корма с высоким содержанием клетчатки (сено, силос).
Установлено, что каждый вид микромицета способен продуцировать свой характерный видоспецифичный спектр микотоксинов [Гагкаева, 2011], поэтому исследование видового состава патогенных грибов в партии зерна позволяет прогнозировать накопление определенного токсина в зерне [Гагкаева, Гаврилова, 2009]. Однако, зерно и корм, содержащие микотоксины считаются непригодными для пищевых и кормовых целей.
Фитопатогенность микромицетов вида Fusarium solani
Фитопатогенность штаммов F. solani определяли по действию споровой суспензии изолятов с титром 105 макроконидий/мл на семена озимой пшеницы и посевного гороха. В экспериментах определяли всхожесть семян, длину и биомассу надземной части, длину и биомассу корней проростков, а также распространенность и развитие корневой гнили в зерновых и овощных культурах. В качестве контроля использовали водопроводную воду.
Определение всхожести семян показало, что штаммы микромицетов F.solani оказывали свое действие в большей степени на семена растений гороха по сравнению с семенами пшеницей (рис. 3).
Наиболее интенсивно снижали всхожесть семян растений штаммы F.solani, F.solam 6, F.solani 12, F.solani 13, F.solani 15, и F.solani 17. Их отрицательное действие на всхожесть семян гороха составило 23,9-36,2 %, а семян пшеницы 9,1-17,8 %. Все остальные штаммы микромицетов, а именно F.solani 1, F.solani 2, F.solani 3, F.solani 4, F.solani 5, F.solani 7, F.solani 8, F.solani 9, F.solani 10, F.solani 11, F.solani 14 и F.solani 16 снижали всхожесть семян гороха значительно меньше, от 0,5 до 23,4 %, а семян пшеницы (0-9%).
Измерение длины проростков и корней 14-ти суточных растений показало, что штаммы F.solani, F.solani 6, F.solani 12, F.solani 13, F.solani 15 и F.solani 17 в большей или меньшей степени влияли на длину надземной части растений (6-22 %), но значительно ингибировали рост подземной части растений на 15-30 % для корней пшеницы, на 27-51 % для корней гороха (табл. 3).
Штаммы F.solani 1, F.solani 2, F.solani 3, F.solani 4, F.solani 5, F.solani 7, F.solani 8, F.solani 9, F.solani 10, F.solani 11, F.solani 14 и F.solani 16 незначительно снижали рост, как надземной части растений в среднем на 1-6 % для пшеницы, на 1-14 % для гороха, так и корней пшеницы и гороха - на 1-15 % и 1-23 %, соответственно.
Выращивание семян растений на споровой суспензии макроконидий штаммов F.solani, F.solani 6, F.solani 12, F.solani 13, F.solani 15 и F.solani 17 достоверно снижала биомассу листьев пшеницы на 8-16 % и корней проростков -на 16-37 %, гороха - на 17-28 % и корней - 36-61 % (рис. 4 и 5).
Остальные изоляты F.solani снижала содержание биомассы их проростков и корней менее чем на 24 %.
Действие микромицетов с различной фитопатогенной способностью наглядно представлено на снимках 16-ти суточного посевного гороха (рис.6).
На фотографиях видны, потемневшие участки на корнях (от темно-коричневых до черных), разрушение или гниение прикорневой и корневой части, а также уменьшение длины проростков и корней растения, что свидетельствует о развитие корневой гнили.
Степень пораженности корней гнилью и распространенность болезни, представлены в таблице 4.
Определение параметров корневой гнили проростков растений показало, что интенсивность поражения корневой системы гороха изолятами F.solani, F.solani 1, F.solani 6, F.solani 8, F.solani 12, F.solani 13, F.solani 15 и F.solani 17 была в 1,1-2,9 раза выше по сравнению с озимой пшеницей и находилась в пределах 10,8-62,1 % (0,98-3,23 балла по 4-ех бальной шкале). Для корней пшеницы интенсивность поражения составила 6,1-24,9 % (0,74-1,95 балла). Распространенность фузариоза составила 42,3-77,1 % для проростков гороха и 32,3-51,1 % для проростков пшеницы. Интенсивность поражения корней растений остальными микромицетами F.solani не превышала 10,8 %, что говорит об отсутствии развития болезни у тест-объектов.
Сравнивая фитопатогенные свойства выделенных микромицетов F.solani, был сделан вывод, что 44 % штаммов (F.solani, F.solani 1, F.solani 6, F.solani 8, F.solani 12, F.solani 13, F.solani 15, F.solani 17) обладали выраженной фитопатогенной активностью. Остальные 56 % F.solani (F.solani 2, F.solani 3, F.solani 4, F.solani 5, F.solani 7, F.solani 9, F.solani 10, F.solani 11 и F.solani 14, F.solani 16) не оказывали значительного действия на всхожесть и развитие растений, т.е. были отнесены к сапротрофным штаммам.
Таким образом, различные изоляты одного вида микромицетов могут иметь широкий диапазон степени фитопатогенности.
Выделение и очистка поверхностного лектина фитопатогенного микромицета F.solani 6
Схема выделения и очистки поверхностного лектина из мицелия F.solani 6 включала шесть стадий: получение белкового экстракта, высаливание белков, диализ и фильтрация с использованием мембранных фильтров Millex, две чередующихся друг за другом гидрофобных хроматографий на колонке Phenyl Sepharose High Performance (1 мл), гель-фильтрация на колонке с Sephadex G-75 (рис. 12). Чистоту полученных препаратов лектинов контролировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
Первоначально выделение лектина F.solani 6 проводили методом концентрирования белков буферного экстракта мицелия грибов, насыщением раствора сульфатом аммония до 75%. На данном этапе удалось получить препарат лектина, удельная активность которого была в 1,8 раза выше, чем исходный экстракт белка. Выход белка составил 109,1 %.
Для дальнейшей очистки препарата поверхностного лектина F.solani 6 применяли метод колоночной хроматографии. Поиск необходимого сорбента для очистки лектина показал, что наибольший выход и чистоту удалось получить при применении колонки с Phenyl Sepharose High Performance. Хроматография на данной колонке осуществлялась дважды, что позволило повысить чистоту получаемого лектина до 40,6 по удельной активности. Выход лектина составил 52,6 % (табл. 12).
Элюцию, связавшегося лектина с фенил-сефарозой, проводили с помощью линейного градиента 1,50 М (NH4)2SO4. Скорость элюции 0,5 мл/мин (рис. 13 А, Б).
Хроматограмма препарата поверхностного лектина F.solani 6 на колонке с Phenyl Sepharose High Performance. Условия: колонка: Phenyl Sepharose High Performance (1 мл); скорость элюции: 0,5 мл/мин; стартовый буфер (А): 20 мМ Tris-HCI буфер, 1,5 М сульфат аммония, рН 7.4; элюент (В): 20 мМ Tris-HCI буфер, рН 7.4; градиент: 0100 % буфер В; объем фракций - 1,5 мл. Система: BioLogic LP производства компании Bio-Rad. А - первый этап гидрофобной хроматографии, Б – второй этап. Зеленой стрелкой показаны фракции, обладающие агглютинирующей активностью
Результаты исследований показали, что с помощью гидрофобной хроматографии удалось лишь частично очистить белок лектина от сопутствующих примесей, поэтому фракции с гемагглютинирующей активностью объединяли, диализовали против раствора стандартного буфера, концентрировали и использовали для дальнейшей очистки на колонке с Sephadex G-50. Элюцию лектина проводили тем же буферным раствором, но со скоростью 1,0 мл/мин (рис. 14).
Хроматограмма препарата поверхностного лектина F.solani 6 после гель - фильтрации на Sephadex G-50. Условия: колонка: Sephadex G-50; скорость элюции: 1,0 мл/мин; буфер: 20 мМ Tris-HCI буфер, рН 7.4; объем фракции - 2,0 мл. Система: BioLogic LP производства компании Bio-Rad. Зеленой стрелкой показана фракция, обладающая агглютинирующей активностью
Метод гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-50 позволил полностью удалить балластные белки и повысить удельную активность лектина в 90,3 раза (табл. 12).
Из полученных данных следует, что на стадии гель-фильтрации потерь гемагглютинирующей активности не происходило, а удельная активность лектина увеличивалась до 7111 ± 51,6 U/мг, что говорит о высокой степени очистки белка. Расчет показал, что из 1 г сухого мицелия микромицета F.solani 6 можно получить 8,8 мкг/мл очищенного белка.
Лектины микромицетов как средство защиты растений
С целью изучения способности лектинов к защите растений от фитопатогенов, проводили обработку корней 3-х суточных проростков посевного гороха поверхностным лектином штамма F.solani 6 в концентрациях 1,25; 2,5; 5,0 и 10,0 мкг/мл в течение 24 часов (рис 25). Контрольные образцы растений обрабатывались буферным раствором. На 5-ые сутки опытные и контрольные растения обрабатывались споровой суспензией фитопатогенного штамма F.solani 6, а на 8 сутки анализировались на изменение длины корней и проростков, а также на накопление биомассы и развитие гнилостного процесса.
Влияние лектина фитопатогенного штамма на рост и развитие посевного гороха, обработанных фитопатогеном F.solani 6: 1 - водопроводная вода; 2 - контроль, фитопатогенный штамм F.solani 6; 3, 4, 5 и 6 - препарат лектина в концентрациях 1,25; 2,5; 5,0 и 10,0 мкг/мл, соответственно.
Результаты исследований показали, что предварительная обработка растений препаратом поверхностного лектина F.solani 6 в концентрации 5 мкг/мл до инфицирования корней фитопатогеном оказало ярко выраженное положительное действие на рост и развитие надземной и подземной частей растений (рис. 26).
Влияние предварительной обработки препаратом лектина в различных концентрациях до их инфицирования патогеном F.solani 6 на длину побега и корней посевного гороха
Обработка корней гороха препаратом лектина в концентрации 5,0 мкг/мл приводила к достоверному повышению роста надземной части в среднем на 5,7% и подземной - на 12,7 %, по сравнению с контролем. Соответственно наблюдалось увеличение накопления биомассы побегов и корней проростков, на 10,1 % и 15,6 %, соответственно. Применение остальных концентраций исследуемого препарата лектина существенно меньше влияло на процесс развития растений (рис 27).
Дополнительным показателем влияния лектинов на растения в качестве средств их защиты было определение параметров интенсивности поражения и распространение корневой гнили у проростков гороха. Результаты исследований показали, что на 8-ые сутки после обработки растений препаратом лектина в концентрации 5 мкг/мл, интенсивность поражения корневой системы грибом F.solani 6 снижалось на 39,7 %. Данная обработка уменьшала распространенность фузариоза на 32,1 % по сравнению с контролем. Более высокие и низкие концентрации лектина оказали меньшее влияние на параметры интенсивности поражения растений корневой гнилью (рис 28).
Таким образом, обработка растений препаратом лектина положительно влияет на их развитие, поскольку длина и биомасса надземной и подземной частей проростков, которые были предварительно обработаны лектином имели значительный прирост по сравнению с необработанными растениями. Кроме того, обработка лектином растений уменьшала распространенность фузариоза и степень поражения их корневой системы на 39,7 %. Действие лектина на растения является дозозависимым.