Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 13
1. Таксономия трибы Proteeae 13
2. Роль Proteus и Morganella в развитии патологических процессов 16
3. Анализ геномов и генов факторов вирулентности P. mirabilis и M. morganii 19
4. Инвазия бактерий в эукариотические клетки 25
5. Роль протеиназ комменсальных и условно-патогенных энтеробактерий в патогенезе 33
6. Внеклеточные металлопротеиназы бактерий 39
7. Внеклеточные металлопротеиназы Proteus 43
8. Внутриклеточные металлопротеиназы энтеробактерий 47
Заключение 52
Экспериментальная часть 54
Материалы и методы 54
1. Используемые штаммы бактерий и клеточные линии 54
2. Питательные среды 54
3. Условия культивирования 55
4. Идентификация микроорганизмов с помощью системы MALDI Biotyper 56
5. Получение культуральной жидкости бактерий и клеточного лизата 56
6. Получение актина 56
7. Определение протеолитической активности 57
8. Зимография 57
9. Выделение внутриклеточной протеиназы M. morganii 58
10. Выделение ДНК 58
11. Полимеразная цепная реакция 59
12. Биоинформационный анализ
13. Гентамициновый метод определения бактериальной инвазии эукариотических клеток 62
14. Определение жизнеспособности клеток HeLa 62
15. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
16. Влияние культуральной жидкости бактерий на монослой культуры клеток HeLa 64
17. Статистическая обработка результатов исследований 64
Результаты исследований 65
1. Идентификация клинических изолятов 65
2. Эффективность инвазии бактерий P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM
клеток M HeLa 68
2.1 Влияние бактерий P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM на жизнеспособность клеток M HeLa в зависимости от инфицирующей дозы 68
2.2 Эффективность инвазии бактерий в зависимости от соотношения бактериальных и эукариотических клеток 69
2.3 Зависимость инвазии энтеробактерий от возраста бактериальной культуры 71
2.4. Влияние культуральной жидкости энтеробактерий на монослой клеток HeLа 72
3. Сравнительная характеристика инвазивной активности энтеробактерий по данным конфокальной микроскопии 74
4. Исследование протеолитической активности штаммов P. mirabilis 5127-1 и M. morganii ZM 78
4.1 Определение внеклеточной и внутриклеточной протеолитической активности штаммов 78
4.2 Особенности биосинтеза внеклеточной протеиназы P. mirabilis 5127 1 81
5. Биоинформационный поиск и анализ генов металлопротеиназ и их гомологов в геномах аннотированных штаммов бактерий семейства Enterobacteriacea e 86
5.1 Поиск генов гомологов внеклеточной металлопротеиназы P. mirabilis 86
5.2 Поиск внутриклеточной металлопротеиназы в геноме аннотированного штамма M. morganii subsp. morganii KT и его ортологов в геномах энтеробактерий 88
5.3 Анализ геномных локусов, содержащих гены исследуемых протеиназ 91
6. Идентификация и анализ гена гипотетической металлопротеиназы в геноме штамма M. morganii ZM 94
7. Выделение внутриклеточной металлопротеиназы M. morganii ZM 98
Обсуждение результатов 101
Заключение 118
Список литературы
- Анализ геномов и генов факторов вирулентности P. mirabilis и M. morganii
- Идентификация микроорганизмов с помощью системы MALDI Biotyper
- Определение жизнеспособности клеток HeLa
- Определение внеклеточной и внутриклеточной протеолитической активности штаммов
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
В последние десятилетия значительно повысилась этиологическая роль
условно-патогенных бактерий в инфекционной патологии человека, а также
расширился клинический спектр проявлений этих инфекций (Spencer et al.,
2014; Fadeyibi et al., 2013; Jockenhfer et al., 2014; Gandham et al., 2014; Tsai et
al., 2013). Условно-патогенные бактерии являются важными возбудителями
оппортунистических инфекций, лечение которых представляет собой
актуальную проблему современного здравоохранения и требует дальнейших
усилий на пути разработки новых подходов и поиска новых мишеней (Rani et
al., 2015). Это обуславливает необходимость углубления наших знаний о
молекулярно-биологических основах вирулентности условно-патогенных
бактерий и особенностях патогенеза инфекций, вызванных этими
возбудителями.
Особое внимание привлекают уропатогенные штаммы рода Proteus и Morganella, вызывающие инфекции мочевыводящих путей, относящихся к наиболее распространенным оппортунистическим инфекциям (Kochiashvili et al., 2014). Как правило, уропатогенные бактерии подвижны и способны выживать в моче, что обеспечивает им быструю адгезию и колонизацию поверхности эпителия и катетеров. Уже во время адгезии на поверхности эукариотической клетки запускается механизм инвазии, что позволяет микроорганизму выживать и размножаться внутри макроорганизма, укрываться от действия антибиотиков (Mathoera, 2002; Alamuri et al., 2010).
В литературе мало данных об инвазивной способности бактерий рода Proteus и отсутствуют данные по инвазии Morganella. Не известен вклад протеолитических ферментов в инвазивный потенциал этих бактерий.
Инвазия P. mirabilis в эукариотические клетки является важным шагом к развитию инфекции (Finlay, Falkow, 1989; Finlay, 1990). Имеются данные о подавлении в присутствии р-нитрофенилглицерина инвазии P. mirabilis, а также синтеза данным микроорганизмом уреазы, протеиназы и гемолизина (Liaw et al., 2000; Liaw et al., 2001). Недавно установлено, что экспрессия гена -фактора RpoE, выступающего посредником при инвазии бактерий, индуцируется мочевиной (Liu et al., 2015). Анализ немногочисленных данных литературы по изучению инвазии P. mirabilis в эукариотические клетки позволяет предположить взаимосвязь процесса инвазии с синтезом большого количества факторов вирулентности, в частности, внеклеточной протеиназы (Jiang et al., 2010a; Jiang et al., 2010б). Внеклеточная металлопротеиназа ZapА P. mirabilis активно изучалась в 1990-х гг (Senior et al., 1991; Loomes et al., 1993; Allison et al., 1994; Wassid et al., 1995; Senior, 1999). Предполагается, что протеиназа ZapА может отвечать за протеолиз антимикробных пептидов в мочевыводящих путях (Belas et al., 2004). Несмотря на длительное исследование металлопротеиназы P. mirabilis, многие вопросы остаются без ответов. Например, неясна причина
образования изоформ фермента, регуляция экспрессии фермента in vivo, недостаточно данных о роли фермента в патогенезе (Pearson et al., 2011).
В настоящее время зарубежные исследователи ведут поиск ингибиторов активности металлопротеиназы P. mirabilis в условиях in vivo (Phan et al., 2008; Carson et al., 2011); исследуются механизмы регуляции и взаимосвязь таких факторов вирулентности P. mirabilis как роение, инвазия в эукариотические клетки, синтез гемолизинов и уреазы (Liu et al., 2015; Kurihara et al., 2013; Jiang et al., 2010). Однако в литературе отсутствуют данные о влиянии мочевины на продуктивность протеиназы, а также о влиянии данного фермента на процесс инвазии бактерий.
Ранее была выделена и частично охарактеризована новая бактериальная
металлопротеиназа ЕСР 32, специфически расщепляющая актин (Усманова,
Хайтлина, 1989). В референтном штамме Serratia grimesii 30063 DZMO
охарактеризована металлопротеиназа - гримелизин, идентичная протеиназе
ЕСР32 (Божокина, 2008). Также обнаружен гомолог гримелизина, протеализин,
синтезируемый S. proteamaculans (Demidyuk et al., 2006). Гены протеиназ
клонированы и секвенированы, их последовательности зарегистрированы в
Международной базе данных (гримелизин EU287452.1, протеализин
AY819662.1). Соответствующие белки выделены и очищены из клеточного
лизата, изучены их каталитические, физико-химические и энзиматические
свойства (Demidyuk et al., 2006; Bozhokina et al., 2008). Установлена
корреляция между протеолитической активностью продуцентов
гримелизина/протеализина и их инвазией в эукариотические клетки
(Божокина, 2008; Цаплина, 2011). Показано, что некоторые условно-
патогенные бактерии семейства Enterobacteriaceae также обладают
внутриклеточной металлопротеиназной активностью (Kothary et al., 2007; Kuan
et al., 2011). Однако данные металлопротеиназы остаются малоизученными.
В связи с этим остается актуальным исследование инвазивной и протеолитической активности клинических изолятов P. mirabilis и M. morganii, представителей одной трибы Proteeae. Сравнительное изучение инвазивной и протеолитической активности уропатогенных штаммов близкородственных видов энтеробактерий важно для понимания особенностей патогенеза инфекции и выяснения вклада протеолитических ферментов в вирулентный потенциал возбудителей.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлось исследование
инвазивной и протеолитической активности условно-патогенных
энтеробактерий Proteus mirabilis и Morganella morganii.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
1. Выявить инвазивную активность клинических изолятов P. mirabilis и M.
morganii в отношении культуры эукариотических клеток HeLa и определить
влияние основных факторов (возраст бактериальной культуры, инфицирующая
доза и время инкубации) на эффективность инвазии.
2. Охарактеризовать особенности инвазии бактерий P. mirabilis и M.
morganii с учетом морфологических изменений клеток HeLa.
3. Провести скрининг протеолитической активности клинических изолятов
P. mirabilis и M. morganii, установить ее локализацию и закономерности
биосинтеза внеклеточной металлопротеиназы P. mirabilis.
4. Идентифицировать ген внутриклеточной металлопротеиназы M.
morganii КТ с помощью биоинформационного анализа на базе референтной
последовательности гена гримелизина с последующим определением аналога в
геноме клинического изолята M. morganii ZM.
5. Выделить и очистить до гомогенного состояния функционально
активный белок металлопротеиназы M. morganii.
Научная новизна. Впервые показано, что бактерии M. morganii ZM способны к инвазии в эукариотические клетки. Установлена корреляция между эффективностью инвазии и инфицирующей дозой бактерий, временем инкубации и возрастом бактериальной культуры. Получены новые знания о различиях во влиянии бактерий M. morganii и P. mirabilis на культуру эукариотических клеток. Установлено, что P. mirabilis и M. morganii -бактерии, относящиеся к трибе Рroteeae, - различаются по протеолитической активности. Получены новые знания о влиянии мочевины на индукцию биосинтеза внеклеточной металлопротеиназы P. mirabilis. В клиническом изоляте M. morganii выявлена и охарактеризована протеолитическая активность. Впервые в геноме M. morganii ZM нами идентифицирован ген гипотетической металлопротеиназы длиной 1104 п.о., транслированная аминокислотная последовательность которого всего на 37% идентична гримелизину Serratia grimesii. Установлено, что фермент относится к семейству М4 нейтральных пептидаз суперсемейства глуцинкинов. Получен препарат высокоочищенной металлопротеиназы M. morganii ZM с молекулярной массой 35 кДа, что соответствует расчетной молекулярной массе зрелого продукта гипотетической металлопротеиназы M. morganii.
Теоретическая и практическая значимость работы. Нуклеотидная
последовательность гена гипотетической металлопротеиназы M. morganii
может быть использована для создания рекомбинантных бактерий-продуцентов
идентифицированного фермента. Полученный гомогенный препарат
внутриклеточной протеиназы может быть использован для изучения структуры и функции металлопротеиназы как потенциального фактора патогенности. Выявление различий у близкородственных видов бактерий в способности инвазировать эукариотические клетки, а также определение особенностей биосинтеза металлопротеиназ P. mirabilis и M. morganii важно для поиска новых мишеней и разработки новых стратегий для терапии таких инфекций.
Положения, выносимые на защиту:
1. Способность бактерий M. morganii ZM и P. mirabilis 5127-1 к инвазии клеток эпителиоидной карциномы шейки матки человека М HeLa сопровождается у P. mirabilis, в отличие от M. morganii, выраженным цитотоксическим действием: нарушением монослоя культуры клеток, обусловленным внеклеточной протеолитической активностью бактерий.
-
Охарактеризована металлопротеиназа P. mirabilis 5127-1: она является секретируемой, ее биосинтез повышается в присутствии мочевины в среде культивирования; фермент образует 2 изоформы, образование второй изоформы фермента зависит от состава среды культивирования.
-
M. morganii ZM обладает внутриклеточной металлопротеиназой, на 37% идентичной гримелизину. Фермент с молекулярной массой 35 кДа выделен в виде высокоочищенного препарата.
Достоверность результатов проведенных исследований подтверждается большим объемом многократных лабораторных экспериментов, выполненных и анализированных на современных высокоточных приборах; опубликованием полученных данных в отечественных журналах, с рецензированием ведущими учеными в данной области.
Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на
международных и региональных конференциях: Международной конференции
студентов, аспирантов и молодых учёных «ЛОМОНОСОВ», МГУ, (Москва,
2010), XLIX Международной научной студенческой конференции "Студент и
научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2011), Всероссийском
симпозиуме с международным участием "Биологически активные вещества микроорганизмов - прошлое, настоящее, будущее" (Москва, 2011), 19-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология -наука ХХI века" (Пущино, 2011, 2014, 2015), V международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины" (Ростов-на-Дону, 2013), Международном симпозиуме "Биохимия -основа наук о жизни" (Казань, 2013), Международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (Казань, 2014), VII Всероссийской конференции "Протеолитические ферменты: структура, функции, эволюция" (Петрозаводск, 2014), VI Ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2014), Всероссийской школеконференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2014).
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно–исследовательских центров, а также, частично, за счет средств субсидии, выделенной Казанскому федеральному университету для выполнения государственного задания в сфере научной деятельности. Исследования выполнены при поддержке грантов: 13-04-97130 р_поволжье_а; Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»: 2012-1.3.1-12-000-1002-015; Федеральной целевой программы № 14.A18.21.1118, № 14.A18.21.1516, № 14.A18.21.0857. Личный вклад автора заключается в разработке основной проблемы исследования, планировании, организации и реализации ее экспериментального решения, интерпретации полученных результатов.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 6 научных работ в реферируемых журналах, рекомендуемых ВАК.
Общая структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, заключения и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включает 25 рисунков, 13 таблиц. Библиография включает 233 наименования.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему
научному руководителю к.б.н., доценту кафедры микробиологии А.М.
Мардановой за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и
обсуждение результатов; к.б.н., с.н.с. Н.П. Балабан и д.б.н., проф. М.Р.
Шариповой за постоянные консультации и обсуждение полученных
результатов; аспиранту, м.н.с. Л.Ф. Миннуллиной за помощь в секвенировании
гена металлопротеиназы; к.б.н., с.н.с. Е.А. Науменко и аспиранту М.Р.
Дзамуковой за культивирование эукариотических клеток в лаборатории
Бионанотехнологий КФУ; к.б.н., н.с. А.А. Тойменцевой за идентификацию
бактерий с помощью системы MALDI Biotyper; директору
Междисциплинарного центра «Аналитическая микроскопия» КФУ Ю.Н. Осину
за возможность проведения лазерной сканирующей конфокальной
микроскопии; к.б.н., н.с. Е.С. Божокиной за постоянную и неоценимую поддержку на всех этапах работы. Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского федерального университета д.б.н., профессору, академику АН РТ О.Н. Ильинской и всем сотрудникам кафедры за всестороннюю помощь и доброжелательную рабочую атмосферу.
1. Используемые штаммы бактерий и клеточные линии
Штаммы P. mirabilis 5127-1 (№17) и P. mirabilis WV 10513 (№57)
предоставлены д.б.н. Хайтлиной С.Ю. (Институт цитологии РАН, Санкт-
Петербург) и являются клиническими изолятами, полученными от
урологических пациентов (Charite, Berlin).
В работе использовали клетки постоянной линии M HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния HeLa), полученные из Российской коллекции культур клеток позвоночных Института цитологии РАН.
2. Питательные среды и условия культивирования
Культивирование штаммов проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989). Мочевину в конечных концентрациях 4–600 мМ вносили в среду LB перед посевом в виде стерильных растворов. Агаризованная среда LBA включала дополнительно 2% агара.
«Искусственную» мочу готовили согласно (Jones et al., 2007) и стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. В качестве натуральной мочи использовали детскую объединенную мочу,
которую стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Стерильность подтверждали высевом на LB.
Для культивирования клеток М HeLa использовали среду ЕMEM (Sigma), 10% FBS (Hyclone).
Культивирование бактерий проводили в колбах объемом 100 и 250 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1:5 на лабораторных качалках на вибростенде (B. Braun, Германия) с интенсивностью качания 200 об/мин при температуре 37оС. Прирост биомассы измеряли нефелометрически на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при длине волны 590 нм.
Клетки стабильной линии M HeLa культивировали на покровных стеклах или 6-луночных и 12-луночных планшетах (Nunc, Дания) до образования 80%-ого монослоя в течение 48 ч в атмосфере 5% СО2 при 370С в среде EMEM без антибиотиков с добавлением 10% FBS. Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева.
3. Получение культуральной жидкости бактерий, клеточного
лизата и актина
Клетки отделяли от культуральной жидкости с помощью
центрифугирования при 13 000 об/мин в течение 15 мин, культуральную жидкость замораживали и хранили при -20оС. Для получения клеточного лизата клетки дважды отмывали 0.8% NaCl, ресуспендировали в 0.05М Трис-HCl буфере, pH 7.3 и разрушали с помощью ультразвукового диспергатора УЗДИ–А (ООО Селми, Украина), центрифугировали в течение 20 мин при 20 000 об/мин (4С). Лизат хранили при -20оС. Актин мышц кролика выделяли из ацетонового порошка, предоставленного д.б.н. Хайтлиной С.Ю. (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), стандартным способом (Bozhokina et al., 2011).
4. Определение протеолитической активности
Определение специфической активности по расщеплению актина
проводили по методу, описанному в работе (Khaitlina, 1991). Расщепление актина анализировали методом SDS-ПААГ-электрофореза (Laemmli, 1970). Гидролиз желатина исследовали методом зимографии (Oliver et al., 1999). Определение протеолитической активности по гидролизу азоказеина
проводили по методу, описанному в работе (Wassif et al., 1995).
Для определения влияния ингибиторов на активность протеиназ использовали о-фенантролин и фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma, США). Клеточный лизат инкубировали с 5 мМ о-фенантролина или 2 мМ PMSF в течение 1 ч при 37C, после чего определяли остаточную активность по гидролизу актина и азоказеина. Продуктивность выражали в условных единицах (Активность/Рост).
5. Выделение внутриклеточной протеиназы M. morganii
Выделение фермента из клеточного лизата M. morganii ZM проводили с помощью сульфатаммонийного фракционирования с интервалом насыщения 0-20%, 20-50% и 50-70% и гидрофобной хроматографии на фенилсефарозе (Pharmacia, США). Фенилсефарозу уравновешивали 0.05 М Трис-HCl буфером,
рН 7.3, 5 мМ Са2+, содержащим 35% сульфата аммония. Белок эллюировали тем же буфером с понижением концентрации сульфата аммония до 10–15%.
6. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция
Выделение геномной ДНК. Выделение геномной ДНК из клеток M. morganii ZM проводили с использованием коммерческого набора GeneJetTM DNA Purification Kit (Fermentas) согласно протоколу производителя.
Выделение ДНК из агарозного геля. Для экстракции ДНК из агарозного геля использовали набор GeneJetTM Gel Extraction Kit (Fermentas).
Полимеразную цепную реакцию для амплификации нуклеотидных последовательностей геномной ДНК или генов 16S рРНК проводили по методу, описанному в работе (Mullis, Faloona, 1987). Реакцию ПЦР-амплификации проводили в термоциклере BioRad MJ MiniTM Gradient Thermal Cycler.
7. Биоинформационный анализ
Для биоинформационного поиска и анализа использовали программы
BLAST (),
MUSCLE (), MEGA 4 и BioEdit (v. 7.0.0),
базы данных ASAP (?) и
Gene ). Анализ промоторной области
проводили с использованием программы BPROM
( gfindb).
8. Гентамициновый метод определения бактериальной инвазии
эукариотических клеток
Для количественной оценки эффективности инвазии использовали гентамициновый метод, описанный в работе (Bozhokina et al., 2015). Клеточные линии HeLa выращивали в среде EMEM, 10% FBS в течение 48 ч на 6-ти луночных планшетах. За 100% КОЕ внутриклеточных бактерий принимали наибольшее число КОЕ.
Жизнеспособность клеток HeLa определяли по исключению красителя трипанового синего по методу, описанному в работе (Шамов с соавт., 2012).
9. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
Лазерную сканирующую конфокальную микроскопию проводили на базе Междисциплинарного центра «Аналитическая микроскопия» ИФМиБ, КФУ. Клетки HeLa выращивали в течение 2 суток на покровных стеклах и инкубировали с бактериями. Актиновый цитоскелет окрашивали родамин-фаллоидином (Sigma). ДНК эукариотических и бактериальных клеток окрашивали DAPI (Sigma). Голубую флуоресценцию (DAPI) возбуждали лазером с длиной волны 405 нм, красную (родамин-фаллоидин) – He-Ne лазером с длиной волны 543 нм. Срезы в плоскости Х0Z были получены с приращением примерно 0.2 мкм.
10. Статистическую обработку результатов исследований осуществляли
с использованием стандартного пакета Microsoft Office Excel путем расчета
среднеквадратичного отклонения (). Результаты считали достоверными при
среднеквадратичном отклонении <10%. В качестве критерия достоверности
получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая P <0.05 за достоверный уровень значимости.
Анализ геномов и генов факторов вирулентности P. mirabilis и M. morganii
Микроорганизмы, принадлежащие к трибе Proteeae, широко распространены в окружающей среде. Они могут быть найдены в загрязненной воде, в почве и навозе, где играют важную роль в разложении органического вещества животного происхождения. Некоторые представители трибы обладают высокой протеолитической активностью в аэробных и факультативно анаэробных условиях (Kim et al., 2003).
Кроме сапрофитного образа жизни в естественной среде, в кишечнике человека, диких и домашних животных бактерии рода Proteus при благоприятных условиях способны вызвать патологии в основном у пожилых людей и пациентов в отделениях интенсивной терапии, у которых ослаблен иммунитет (Makam, 2014; Custovic et al., 2014). Так, P. mirabilis является распространенным возбудителем инфекций при различных болезнях, в том числе при воспалительных заболеваниях малого таза, хронических язвах, туберкулезном отите (Spencer et al., 2014; Fadeyibi et al., 2013; Jockenhfer et al., 2014; Gandham et al., 2014). Кроме того, P. mirabilis оказался одной из двух самых распространенных бактерий, найденных в пищеварительной системе кровососущего насекомого Phlebotomus papatasi, основного переносчика зоонозного кожного лейшманиоза в Европе (Maleki-Ravasan et al., 2013).
P. mirabilis является важным возбудителем инфекций мочевыводящих путей (Shakya et al., 2014; Sujatha, Nawani, 2014; Flores-Mireles et al., 2015), природа которых может быть подразделена на две категории: системные инфекции (гематогенный путь) и восходящие инфекции, при которых бактерии колонизируют последовательно уретру, мочевой пузырь, мочеточники, почки (Rubin et al., 1986). Особенно часто P. mirabilis встречается при мочекаменной болезни почек. Полагают, что мочекаменная болезнь является результатом повторяющихся хронических инфекций мочевыводящих путей, вызванных уреаза-положительными бактериями (Chen et al., 2014; Torzewska, Ralski, 2015). Одной из причин того, что инфекции повторяются, является способность бактерий инвазировать уроэпителиальные клетки, сохраняясь в них, что создает возможность повторного заражения. Показано, что при образовании камней в почках P. mirabilis обнаруживается чаще других бактерий (в 70% случаев) (Torzewska et al., 2014). Как показали исследования последних лет, проблема усугубляется распространением антибиотикорезистентных штаммов P. mirabilis (Jockenhfer et al., 2014; Shakya et al., 2014)
Несмотря на широкое распространение M. morganii в природе, долго считали, что данный микроорганизм редко становится причиной инфекций человека. Однако, в последнее время появляется все больше доказательств в пользу того, что М. morganii является важным оппортунистическим патогеном, способным вызывать инфекции мочевыводящих путей, кожи и мягких тканей, а также менингит и бактериемию (Tsai et al., 2013).
М. morganii является важным и опасным уропатогеном, особенно для пациентов, находящихся на стационарном лечении. Известен случай вспышки нозокомиальной инфекции, вызванной M. morganii. В течение 6 месяцев бактерии М. morganii были выделены 15 раз из образцов мочи 10 пациентов. Все пациенты значительно различались по возрасту и поставленным диагнозам (затылочно-теменное сотрясение, перелом таза, заболевание коронарной артерии, легочная жировая эмболия с дыхательной недостаточностью, перфорация подвздошной кости и др.). Однако, общим было то, что все пациенты имели урологические катетеры и прошли инвазивные процедуры, что свидетельствует об опасности этих возбудителей для катетеризованных пациентов (Singla et al., 2010).
Данный микроорганизм может быть причиной инфекций с летальным исходом у новорожденных и людей с ослабленным иммунитетом. Описан случай, когда 59-летний мужчина с нейтропенией, вызванной химиотерапией, умер от массивного гемолиза и метаболического ацидоза, несмотря на предпринятое врачами интенсивное лечение. Две пробы крови показали наличие в них культур М. morganii. Таким образом, сепсис, вызванный М. morganii, может вызвать фатальный массивный гемолиз, ведущий к смерти (Kim et al., 2007).
Инфекции ЦНС, вызванные M. morganii, встречаются редко. До 1997 года сообщалось о девяти случаях инфекций ЦНС, вызванных M. morganii, четыре из них были диагностированы как отогенный менингит (Patil et al., 2012). Хотя M. morganii является редким возбудителем инфекций ЦНС, роль бактерии этого вида особенно важна в случаях абсцесса мозга отогенного происхождения. Этот микроорганизм должен быть заподозрен в первую очередь, когда пациента лечат от абсцесса головного мозга, развивающегося на фоне отогенной инфекции. Таким образом, важно повышать уровень осведомленности людей об осложнениях отита, который сам по себе легко лечится (Patil et al., 2012).
Хотя обычно костно-суставные патологии не связаны с инфекцией, вызванной M. morganii, такие случаи встречаются все чаще и характеризуются высоким уровнем смертности. Описан случай с 56-летним пациентом с остеомиелитом в дистальном отделе бедренной кости и проксимальном отделе большеберцовой кости, вызванным M. morganii, и осложненным септическим артритом в коленном суставе (Koyuncu, Ozan, 2012).
Формирование абсцесса из-за инфекции эхинококковой кисты в печени является важным осложнением данного заболевания. Ранее считалось, что М. morganii не может стать причиной абсцесса печени. Однако известен случай обнаружения у 77-летней женщины с эхинококковой кистой гигантского абсцесса печени, который возник из-за заражения эхинококка культурой М. morganii (Hakyemez et al., 2012).
Кроме того, в 2012 году зарегистрирован первый случай возникновения у цыплят смертельной инфекции, вызванной М. morganii. Эти данные подтверждены путем экспериментального инфицирования (Zhao et al., 2012).
Таким образом, роль P. mirabilis и M. morganii в инфекционной патологии человека значительно изменилась за последние десятилетия. Возросла опасность этих инфекций и расширился клинический спектр их проявлений. Представители данных видов бактерий могут и должны рассматриваться в качестве важных оппортунистических патогенов.
Идентификация микроорганизмов с помощью системы MALDI Biotyper
Штаммы P. mirabilis 5127-1 (№17) и P. mirabilis WV 10513 (№57) были предоставлены д.б.н. Хайтлиной С.Ю. (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) и представляли из себя клинические изоляты, полученные от урологических пациентов (Charite, Berlin).
В работе использовали клетки постоянной линии M HeLa (эпителиоидная карцинома шейки матки человека, сублиния HeLa), полученные из Российской коллекции клеточных культур позвоночных Института цитологии РАН.
Культивирование штаммов проводили на среде LB (Sambrook et al., 1989) (%): триптон — 1.0, дрожжевой экстракт — 0.5, NaCl – 0.5, pH 8.5. Агаризованная среда LBA включала дополнительно 2% агара. Для определения казеинолитической активности использовали среду (г/л): казеин – 5, дрожжевой экстракт – 5, NaCl – 5, агар - 2%. Для определения гемолитической активности использовали кровяной агар с добавлением 5% суспензии эритроцитов барана. Для первичной дифференциации штаммов использовали агар Клиглера (Эпидбиомед-диагностика). Готовую среду разливали в пробирки по 6 мл, стерилизовали, а затем скашивали так, чтобы остался столбик высотой 2–2.5 см. Для определения способности к ферментации углеводов использовали готовые среды Гисса (Эпидбиомед-диагностика) с сахарозой, мальтозой, глюкозой, маннитом. Состав «искусственной» мочи, г/л (Jones et al., 2007): пептон – 1, дрожжевой экстракт - 0.05, молочная кислота - 0.1, лимонная кислота - 0.4, мочевина - 10, СаС12 2Н20 - 0.37, NaCl - 5.2, FeS04 - 0.012, MgS04-7H20 -0.49, Na2S04 -10H2O - 3.2, КН2Р04 - 0.95, К2НР04 - 1.2, ЖЦС\ - 1.3, Н20 дистиллированная. Среды стерилизовали при 1 атм в течение 40 мин. «Искусственную» мочу стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Мочевину в конечных концентрациях 4-600 мМ вносили в питательную среду перед посевом в виде стерильных растворов. В качестве натуральной мочи использовали детскую объединенную мочу, которую стерилизовали фильтрованием через мембранный фильтр с диаметром пор 0.2 мкм. Стерильность подтверждали высевом на LB. Для культивирования клеток М HeLa использовали среду ЕMEM (Sigma), 10% FBS (Hyclone).
Культивирование бактерий проводили в колбах объемом 100 и 250 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1:5 на лабораторных качалках на вибростенде (B. Braun, Германия) с интенсивностью качания 200 об/мин. Культуру выращивали при температуре 37оС. В качестве инокулята использовали 12 ч культуру, выращенную на среде LB, которую разводили до значения оптической плотности 0.1 (OD590) и вносили в среду в количестве 2% по объему. Прирост биомассы измеряли нефелометрически на фотоэлектрокалориметре КФК-2 при длине волны 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах светопоглощения в кювете толщиной 1 см. Клетки окрашивали по Граму и микроскопировали с помощью микроскопа MICROS AUSTRIA МС 300 при различных увеличениях.
Клетки стабильной линии М HeLa культивировали на покровных стеклах или 6-луночных планшетах (Nunc) до образования 80%-ого монослоя в течение 48 ч в атмосфере 5% СО2 при 37 С в среде ЕMEM без антибиотиков с добавлением 10% FBS (Hyclone). Количество клеток подсчитывали с использованием камеры Горяева. 4. Идентификация микроорганизмов с помощью системы MALDI Biotyper
Для идентификации бактерий с помощью системы MALDI Biotyper (Bruker Daltonik) использовали 18 ч культуру, выращенную при 37 С на среде LBA. Метод основан на масс-спектрометрии и сравнении спектра рибосомальных белков с базой данных. Видовая принадлежность определялась при значениях Score 2.300 –3.000.
Клетки отделяли от культуральной жидкости с помощью центрифугирования при 13 000 об/мин в течение 15 мин. Культуральную жидкость отбирали в отдельные эппендорфы, замораживали и хранили при -20 оС.
Для получения клеточного лизата клетки, полученные из 200 мл культуры, дважды отмывали от культуральной жидкости 0.8% NaCl. К отмытым клеткам добавляли 5 мл 0.05М Трис-HCl буфера, pH 7.3, и разрушали клетки при помощи ультразвукового диспергатора УЗДИ–А (ООО Селми, Украина) при частоте 22 кГц (5-6 подходов по 7-8 сек с перерывами в 1 мин) при 4 С. Клеточный лизат центрифугировали в течение 20 мин при 20 000 об/мин (4 С) и отбирали в отдельные эппендорфы. Лизат хранили при -20 оС.
Актин мышц кролика выделяли из ацетонового порошка, предоставленного д.б.н. Хайтлиной С.Ю. (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург), стандартным способом (Bozhokina et al., 2011). 1 г порошка растворяли в 25 мл буфера G (0.2 мМ АТФ, 0.1 мМ CaCl2, 5 мМ Трис-HCl, 1 мМ NaN3, рН 7.5) и инкубировали во льду в течение 10 мин. Затем центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 1 мин. Супернатант отбирали и диализовали в течение 12-18 ч на холоду относительно буфера G. Раствор актина разводили до конечной концентрации, равной 0.5 мг/мл, в буфере G.
Определение специфической активности по расщеплению актина проводили по методу, описанному в работе (Khaitina, 1991). Раствор фермента добавляли к раствору актина (0.5 мг/мл) в соотношении 1:1 и инкубировали при температуре 37 С в течение 2 ч. Реакцию останавливали добавлением буфера для проб (0.5 М Трис-HCl, pH 6.8 – 3 мл, SDS – 0.4 г, DTT – 0.3 г, глицерин – 2 мл, бромфеноловый синий – 0.1 мг) и кипячением в течение 10 мин. Расщепление актина анализировали методом SDS-ПААГ-электрофореза (Laemmli, 1970).
Гидролиз желатина исследовали методом зимографии (Oliver et al., 1999). Определение протеолитической активности по гидролизу азоказеина проводили по методу, описанному в работе (Wassif et al., 1995). За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин.
Для определения влияния ингибиторов на активность протеиназ использовали о-фенантролин и фенилметилсульфонилфторид (PMSF) (Sigma, США). Клеточный лизат инкубировали с 5 мМ о-фенантролина или 2 мМ PMSF в течение 1 ч при 23C, после чего определяли остаточную активность по гидролизу актина и азоказеина.
При проведении зимографии в качестве субстрата использовали желатин в конечной концентрации 1 мг/мл. Буфер для проб (0.625 М Трис-НCl, рН 6.8; 2% SDS; 10% глицерин; 0.01% бромфенол синий) добавляли в образцы и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Белки разделяли в 10% ПААГ в денатурирующих условиях в присутствии 0,1% SDS в Трис-глициновом буфере при значении тока 150V. После проведения электрофореза гель отмывали от SDS 2.5% раствором Тритона Х-100 2 раза по 30 мин, после чего инкубировали в течение 12 ч при 370С в 50 мМ Трис-HCl буфере, pH 7.4, содержащем 5 мМ CaCl2. Затем гель окрашивали раствором Кумасси G-250; при этом зоны, содержащие протеолитический фермент, проявлялись в виде неокрашенных полос (Oliver et al., 1999).
Определение жизнеспособности клеток HeLa
Количество клеток M HeLa в монослое через 2 ч инкубации культуры клеток с бактериями M. morganii ZM (А) и P. mirabilis 5127-1 (Б). 1-3 – соотношение клеток HeLa к бактериям 1:10, 1:50 и 1:100 соответственно. К – количество клеток HeLa без бактерий.
Эффективность инвазии оценивали по количеству внутриклеточных бактерий с помощью гентамицинового метода. Исследовали зависимость инвазии P. mirabilis и M. morganii от соотношения эукариотических клеток к бактериальным и времени инкубации. Установили, что инвазия обоих штаммов энтеробактерий зависит от инфицирующей дозы и времени инкубации (Рисунок 2). При соотношении клеток HеLа и P. mirabilis 1:10, количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 мл лизата клеток (что соответствует 400–600 эукариотических клеток) составляет 60 при инкубации клеток в течение 1 ч и 375 при инкубации клеток в течение 2 ч. При увеличении инфицирующей дозы до 1:50 количество КОЕ увеличивается до 123 и 409 для 1 и 2 ч инкубации клеток соответственно. Однако при дальнейшем повышении инфицирующей дозы (1:100) наблюдали уменьшение эффективности инвазии – снижение КОЕ в лизате до 90 и 351 КОЕ для 1 и 2 ч инкубации клеток соответственно. Таким образом, оптимальным для эффективной инвазии штамма P. mirabilis 5127-1 оказалось соотношение эукариотических клеток к бактериям равное 1:50 и время инкубации 2 ч (Рисунок 2 А).
В случае инвазии M. morganii, при соотношении клеток 1:10, количество КОЕ внутриклеточных бактерий составляет 275 (время инкубации клеток 2 ч) и 380 (время инкубации клеток 4 ч). При повышении инфицирующей дозы до 1:50 количество КОЕ увеличивается до 370 и 593 для 2 и 4 ч инкубации клеток соответственно. Оптимальным для эффективной инвазии оказалось соотношение эукариотических клеток к бактериям 1:100 и время инкубации 4 ч. В данных условиях количество КОЕ было максимальным и достигало 1190 на мл лизата (Рисунок 2 Б).
Зависимость количества внутриклеточных бактерий P. mirabilis (А) и M. morganii (Б) от времени инвазии и инфицирующей дозы. Соотношение HeLa к бактериям: 1 – 1:10, 2 – 1:50, 3 – 1:100. При сравнении эффективности инвазии двух штаммов энтеробактерий видно, что при соотношении клеток HeLa к бактериям, равном 1:10, штамм P. mirabilis инвазировал немного эффективнее штамма М. morganii (Рисунок 3). Количество инвазировавших бактерий составило 40 и 30% соответственно. Однако при увеличении инфицирующей дозы (соотношение клеток 1:100), эффективность инвазии повышалась только для культуры М. morganii. Количество внутриклеточных бактерий (КОЕ) было выше более чем в 2-2.5 раза в сравнении с P. mirabilis.
Исследовали эффективность инвазии P. mirabilis 5127Ч и М. morganii ZM в зависимости от стадии роста бактериальной культуры. Использовали клетки бактерий, находящиеся в экспоненциальной фазе роста (12 ч), стационарной фазе (24 ч) и стадии отмирания культуры (48 ч). Эффективность инвазии рассчитывали по количеству проникающих в эукариотические клетки бактерий. В случае обоих бактериальных штаммов, эффективнее всего инвазировали клетки, находящиеся в экспоненциальной фазе роста (12 ч). Значение КОЕ внутриклеточных бактерий молодых культур принимали за 100%. Как видно из Рисунка 4, эффективность инвазии значительно снижалась при инфицировании клеток HeLa 24 ч и 48 ч культурами бактерий. 24 ч культура инвазировала в 3 раза, а 48 ч – в 20 раз менее эффективно, чем культура бактерий на экспоненциальной фазе роста (12 ч).
Влияние культуральной жидкости энтеробактерий на монослой клеток HeLа Для выяснения влияния экзогенных метаболитов бактерий исследовали влияние культуральной жидкости на целостность монослоя клеточной культуры. Использовали культуральную жидкость после 12 ч роста P. mirabilis и M. morganii. Как видно из Рисунка 5, при внесении культуральной жидкости происходит увеличение количества «свободных» клеток в среде в случае обеих культур. Однако культуральная жидкость P.mirabilis способствует откреплению клеток значительно сильнее, чем культуральная жидкость M. morganii. Так, культуральная жидкость P.mirabilis, разведенная в 3 и 6 раз, увеличивала процент открепившихся клеток в 2.4 и 2.7 раз соответственно в сравнении с контролем. В тех же условиях культуральная жидкость M. morganii увеличивала количество открепившихся клеток не более чем в 1.4 раза относительно контроля. Инактивация культуральной жидкости обеих бактерий обработкой 60С приводила к прекращению открепления клеток. В обоих случаях при обработке культуры клеток инактивированной культуральной жидкостью количество открепившихся клеток было близко к контролю.
Деструкция монослоя клеточной линии M HeLa в присутствии культуральной жидкости P. mirabilis 5127-1 и M.morganii ZM. Соотношение ростовой среды EMEM и культуральной жидкости: 1 – EMEM без КЖ, 2 – 15:1, 3 – 6:1, 4 – 3:1, 5 – EMEM + инактивированная КЖ 6:1.
Таким образом, в культуральной жидкости P. mirabilis присутствует фактор (или факторы), способствующий разрушению монослоя клеточной культуры и откреплению клеток от субстрата. Этот фактор разрушается под действием высокой температуры и присутствует в незначительных количествах у M. morganii. 3. Сравнительная характеристика инвазивной активности энтеробактерий по данным конфокальной микроскопии Для качественного подтверждения инвазии бактерий и характеристики изменения морфологии эукариотических клеток использовали лазерную сканирующую конфокальную микроскопию. Для этого клетки HeLa, инкубированные с бактериями P. mirabilis 5127-1 (2 ч) и M. morganii ZM (4 ч), фиксировали на стеклах, окрашивали родамин-фаллоидином (окрашивает актин в красный цвет) и красителем DAPI (окрашивает ДНК в голубой цвет). Препараты исследовали с помощью срезов в плоскости X0Z (размер среза 0.2 мкм) в микроскопе Leica TCS SL. В качестве контроля использовали клетки HeLa без бактерий.
На Рисунках 6 и 7 представлены результаты конфокальной микроскопии клеток M HeLa после инкубации с бактериями M. morganii ZM. Как видно из фотографий, бактериальные клетки в большом количестве обнаруживаются в межклеточном пространстве, на поверхности клеток в прикрепленном состоянии, а также в цитоплазме эукариотических клеток (Рисунок 6 - 3; Рисунок 7), что позволяет говорить о способности клеток M. morganii ZM к адгезии и инвазии. Морфология эукариотических клеток при этом изменяется: наблюдается значительная реорганизация актинового цитоскелета клеток (Рисунок 6 - 4), разрыхление клеточного монослоя, появление множества протрузий.
Определение внеклеточной и внутриклеточной протеолитической активности штаммов
В настоящее время, на катетер-ассоциированные инфекции мочевыводящих путей приходится до 40% внутрибольничных инфекций (Armbruster et al., 2014). Данные, собранные за последние 30 лет, показывают, что до 86% КАИМП являются полимикробными, включая такие бактерии как P. mirabilis, Providencia stuartii, M. morganii, E.coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae и др. Потенциальные осложнения, вызванные КАИМП, включают блокировку катетера и мочекаменную болезнь. Бактериемия является другим опасным осложнением КАИМП (Torzewska, Ralski, 2015). Мочекаменная болезнь является самым распространенным заболеванием мочевыделительной системы и затрагивает все возрастные группы. Уровень распространенности мочекаменной болезни достигает 5-12% у мужчин и 4-7% у женщин (Mehmet, Ender, 2015). Бактерии трибы Proteeae являются основными видами, ответственными за формирование кристаллических биопленок на катетерах (Torzewska, Ralski, 2015).
P. mirabilis и M. morganii входят в состав нормальной микрофлоры человека. Тем не менее, они способны вызывать инфекции мочевыводящих путей, а также бактериемию, инфекции мягких тканей и кожи, менингит, бактериальный перитонит, септический артрит, инфекцию печени, сепсис новорожденных и абсцесс головного мозга (Vijaya D et al., 2014; Seija et al., 2015; Fagan et al., 2015). Геномы данных бактерий несут в себе гены множественной устойчивости к антибиотикам (Pearson et al., 2008; Chen et al., 2012).
Исследуемые клинические изоляты были выделены от урологических больных и предварительно идентифицированы как представители рода Proteus – штаммы №17 и №57. Как известно, некоторые виды рода Proteus на агаризованной среде дают «ползучий рост» (роящиеся H-формы). Феномен роения имеет очень важное значение не только в колонизации бактериями твердых субстратов, но и в их патогенности (Senior, 1998). Нами показано, что штамм №17 образовывал колонии с характерными концентрическими кольцами, а штамм №57 не проявлял способности к роению, вследствие чего можно сделать вывод о том, что он относится к нероящимся штаммам рода Proteus или же принадлежит к другому роду.
Культивирование бактерий на среде с кровяным агаром позволило выявить различия в гемолитических свойствах изолятов: штамм №17 проявлял более высокую гемолитическую активность в сравнении со штаммом №57. Оба штамма вызывали образования зон полного гемолиза среды вокруг колоний, что свидетельствует о том, что бактерии обладают -гемолитической активностью. Эти результаты коррелируют с данными литературы о том, что представители рода Proteus обладают способностью синтезировать ряд ферментов, среди которых присутствует гемолизины (Красноженов, 2005). Анализ роста бактерий на средах Гисса и Клиглера показал, что штамм №17 способен к синтезу сероводорода, но не способен к утилизации маннита, что характерно для представителей рода Proteus. Штамм №57, напротив, не синтезировал сероводород, но ферментировал маннит, что характерно для видов рода Morganella (O Hara, 2000). Однако в отличие от большинства штаммов Morganella, штамм №57 ферментировал сахарозу. Для представителей рода Morganella характерна вариабельность по гемолитическим свойствам. Так показано, что 56% клинических изолятов Morganella обладают гемолитическими свойствами (Kim, 2007). Штамм №57 не проявил способности к роению, но проявлял небольшие гемолитические свойства, что позволяет его отнести к роду Morganella (Красноженов, 2005).
Для определения наличия внеклеточных протеолитических ферментов, расщепляющих казеин, бактерии культивировали на молочном агаре. Было показано, что протеолитическую активность в отношении казеина проявляет только штамм №17. Вокруг колоний штамма №57 не обнаружено зоны просветления среды. Полученные данные также свидетельствуют о принадлежности штамма №17 к роду Proteus, так как известно, что изоляты Proteus spp., способные к роению, могут секретировать протеиназы, расщепляющие казеин (Senior, 1998). Различия в свойствах изолятов определили необходимость проведения более точной дифференцировки бактерий с использованием молекулярно-биологических методов. Использованный набор микробиологических тестов не позволил нам сделать однозначный вывод о принадлежности исследуемых культур к тем или иным видам. Однако использование современных молекулярно-биологических методов, основанных на гомологии последовательности генов 16S рРНК и масс-спектрометрии рибосомальных белков с помощью системы MALDI Biotyper, позволило с высокой вероятностью идентифицировать видовую принадлежность штаммов и отнести их к видам M. morganii и P. mirabilis. Бактериям было присвоено название штаммов M. morganii ZM и P. mirabilis 5127-1. В настоящее время эти виды энтеробактерий относятся к разным родам, входящим в трибу Proteeae, хотя ранее эти виды были отнесены к одному роду Proteus (O Hara, 2000).
По данным исследований результаты идентификации бактерий с помощью системы MALDI Biotyper оказались на 15-25% точнее результатов обычных бактериальных анализаторов (Panda et al., 2014). Важно отметить, что использование системы MALDI Biotyper для идентификации позволяет экономить время и минимизировать усилия.