Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 18
1.1 Роль бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans в инфекционной патологии человека .18
1.2 Некоторые биологические свойства бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 22
1.3 Факторы патогенности бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 24
Глава 2. Материалы и методы исследования .32
2.1 Генетические методы исследования 35
2.2 Микроспокические методы исследования 37
2.3 Методы исследования некоторых биологических свойств .38
2.3.1.Методика изучения факторов патогенности и персистенции в условиях межбактериальных взаимодействий .38
2.3.2. Определение адгезивной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 39
2.4 Определение гемолитических свойств монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 41
2.4.1. Определение ДНК-азной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomita 43
2.4.2. Определение лецитиназной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans .44
2.5 Определение персистирующих свойств монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcom 45
2.6 Определение протистоицидной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 47
2.7 Методы определения вирулентности микроорганизмов in vivo .48
2.7.1. Методы определения патогенности in vivo путем интраназального заражения мышей 48
2.7.2. Метод определения токсичности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans с помощью теста «отек лап» 49
2.7.3. Определение токсичности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans на мышах-сосунках 49
2.7.4. Определение кожно-некротической способности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans .50
2.8 Определение антибиотикорезистентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 51
2.9 Определение антибиотикорезистентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans с помощью полимеразной цепной реакции 51
2.10 Выделение и контроль бактериофагов. Получение собственного бактериофага 54
2.11 Статистическая обработка результатов .55
Глава 3. Собственные исследования 56
3.1 Морфологические, культуральные свойства и ультраструктура монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, выделенных из ротовой полости при инфекционных процессах пародонта 56
3.2 Определение факторов патогенности и персистенции монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 68
3.2.1. Сравнительное изучение адгезивной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 69
3.2.2. Сравнительное изучение гемолитической активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans .76
3.2.3. Сравнительное изучение лецитиназной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 84
3.2.4. Сравнительное изучение дезоксирибонуклеазной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 86
3.2.5. Сравнительное изучение антилизоцимной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 89
3.2.6. Сравнительное изучение антикомплементарной активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans 93
3.2.7. Сравнительное изучение антиинтерфероновой активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans .96
3.2.8. Сравнительное изучение вирулентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans методом интраназального заражения белых мышей («Легочная модель») 100
3.2.9. Сравнительное изучение токсичности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans методом кожно-некротической пробы 102
3.2.10. Сравнительное изучение вирулентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans методом протистоцидного теста 106
3.3 Сравнительный анализ спектра антибиотикоустойчивости монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, выделенных из ротовой полости при инфекционных процессах пародонта .109
3.3.1. Определение антибиотикорезистентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans с помощью метода стандартных дисков .110
3.3.2. Определение антибиотикорезистентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans с помощью полимеразно-цепной реакции 112
3.4 Выделение вирулентного бактериофага к бактериям Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans в сточных водах 115
3.5 Сравнительный анализ литического действия собственного бактериофага и поливалентного биологического препарата «ФАГОДЕНТ» 118
Глава 4. Заключение .123
Выводы 129
Практические рекомендации .130
- Факторы патогенности бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans
- Определение антибиотикорезистентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans с помощью полимеразной цепной реакции
- Сравнительное изучение гемолитической активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans
- Сравнительное изучение токсичности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans методом кожно-некротической пробы
Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
В последние годы наблюдается увеличение удельного веса инфекционных заболеваний пародонта, вызванных ассоциациями условно-патогенных микроорганизмов (Усманова, И.Н. Оптимизация диагностики, лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта и слизистой оболочки рта у молодого возраста: автореф. дис. … д-ра. мед. наук. / И.Н. Усманова – Уфа, 2016. – 44 с.). Проявление пародонтитов человека характеризуется выраженным клиническим полиморфизмом, связанным с одновременным воздействием нескольких этиологических агентов, каждый из которых имеет в своем арсенале комплекс факторов патогенности. Интерпретацию результатов при этих инфекциях затрудняет высокая частота выявления из полости рта микроорганизмов, находящихся в составе микст-культур, каждая из которых обладает рядом характеристик, сочетание которых может определять патогенный потенциал патогенов в целом (Хуснутдинова, Л.М. Межбактериальные взаимодействия на слизистой оболочке миндалин человека: дисс. … канд. мед. наук. Оренбург, - 2004. – 23 с.). Изменение этиологической структуры инфекционной заболеваемости, по мнению многих исследователей, связано с неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным применением различных антибактериальных препаратов, а также нарушением естественной резистентности макроорганизма к различным видам ассоциированных культур (Фадеев, С.Б. Хирургичекая инфекция мягких тканей второго уровня, особенности этиотропной терапии: дис. … д-ра мед. наук / С.Б. Фадеев – Оренбург, 2010. – 165 с.).
При изучении ассоциаций микроорганизмов решаются две проблемы. С одной
стороны, оцениваются механизмы межмикробных взаимодействий в микросистемах и их
роль в формировании биоценозов. С другой стороны, взаимодействие микроорганизмов-
представителей одного биотопа используется как инструмент для решения прикладных
задач медицины и микробиологии (Тец, В.В. Биопленки возбудителей уроинфекций и
использование фторхинолонов / В.В. Тец // Consilium medicum. – 2008. - № 4. – С. 110-
114). Особенности межмикробных взаимодействий могут существенно влиять на формы и
течение инфекционного процесса. Возбудители при смешанной инфекции чаще
характеризуются антибиотикорезистентностью, антилизоцимной, адгезивной,
гемолитической, антиинтерцидной, лецитоветилазной, ДНКазной активностями
(Габидуллин, Ю.З. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный
потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Enterobacter, Citrobacter, serratia, E.Coli, Proteus: автореф. дис. … д-ра мед. наук / Ю.З. Габидуллин. – Челябинск, 2015. – 40 с.).
В то же время межбактериальные взаимодействия как один из механизмов формирования ассоциаций в ротовой полости, а именно в пародонте при микст-инфекциях и изменения их в проявлении патогенных свойств представителями условно-патогенных бактерий с учетом их симбиотических связей изучены недостаточно.
Исходя из вышеизложенного в качестве модели для исследований нами были
выбраны условно-патогенные представители семейств Pasteurellaceae и
Porphyromonadaceae, а именно Aggregatibacter actinomycetemcomitans
(A.actinomycetemcomitans), Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis) и их сокультивируемые варианты, которые являются одними из ведущих патогенов, вызывающих специфические пародонтиты у человека.
Цель исследования
Сравнить некоторые биологические свойства монокультур Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans и их ассоциаций.
Задачи исследования
-
Провести комплексную фенотипическую характеристику монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, выделенных из ротовой полости при инфекционных процессах пародонта.
-
Изучить некоторые биологические свойства монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, ассоциированных с факторами патогенности.
-
Определить некоторые биологические свойства монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, ассоциированных с факторами персистенции.
-
Дать сравнительную характеристику спектра антибиотикоустойчивости монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, выделенных из ротовой полости при инфекционных процессах пародонта.
5. Провести поиск вирулентных бактериофагов к Porphyromonas gingivalis и
Aggregatibacter actinomycetemcomitans и сравнить их литическое действие с коммерческим препаратом ФАГОДЕНТ.
Методология и методы исследования
Материалом для исследований послужили 134 штамма изучаемых нами
микроорганизмов, выделенных как от больных, так и от здоровых людей: от 540 больных с
инфекционными заболеваниями пародонта было получено 82 штамма Aggregatibacter
actinomycetemcomitans и 32 штамма Porphyromonas gingivalis, а также 32 сокультивируемых
вариантов (Porphyromonas gingivalis + Aggregatibacter actinomycetemcomitans) за период с
2013 по 2016 гг. Чистые культуры бактерий были выделены бактериологическими
лабораториями Государственного бюджетного учреждения здравоохранения
«Республиканская детская клиническая больница», Государственного бюджетного учреждения здравоохранения «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова» г. Уфы, а также диагностической лабораторией при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Дополнительно были использованы 10 штаммов Porphyromonas gingivalis и 10 штаммов Aggregatibacter actinomycetemcomitans, выделенных от практически здоровых людей. В работе использовались микроскопические, микробиологические, молекулярно-генетические методы исследования, определяли патогенность и вирулентность клинических штаммов по общепринятым методикам на различных биологических моделях. Полученные данные были обработаны общепринятыми методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы SPSS 8.0 for WINDOW для вычисления средней арифметической ряда (М); средней ошибки (m); критерии значимости (t) Стъюдента и 2. Для выявления существенных различий между средними величинами ряда определяли достоверность различий между полученными данными (Р) и коэффициентом корреляции (r).
Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора
Полученные в ходе исследования результаты, сформулированные положения и выводы соответствуют теме диссертации, адекватны поставленным целям и решаемым задачам, статистически достоверны и основаны на анализе достаточного количества экспериментального материала с использованием современных методов и подходов.
Результаты исследований были представлены на VI ежегодном Всероссийском
конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2014); VII ежегодном Всероссийском
конгрессе по инфекционным болезням с международным участием (Москва, 2015); 82-й
Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученных «Вопросы
теоретической и практической медицины» (Уфа, 2017), XI съезде общероссийской
общественной организации «Всероссийское научно-практическое общество
эпидемиологов, микробиологов и паразитологов» (ВНПОЭМП) «Обеспечение
эпидемиологического благополучия: вызовы и решения» (Москва, 2017).
Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования.
Воплощение основной идеи, планирование научной работы, включая
формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции
диссертационного исследования проводились совместно с научным руководителем,
заведующим кафедрой микробиологии, вирусологии, ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России д.м.н., профессором Туйгуновым М.М. Цель и задачи сформулированы совместно с научным руководителем. Дизайн исследования разработан лично диссертантом. Анализ современной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме и интерпретация результатов исследования проведены лично диссертантом. Лабораторные исследования осуществлялись лично диссертантом при участии сотрудников кафедр микробиологии, вирусологии и терапевтической стоматологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России.
Статистическая обработка первичных данных и анализ полученных результатов, написание и оформление рукописи диссертации, представление результатов работы в научных публикациях и в виде докладов на конференциях осуществлялись диссертантом самостоятельно.
Положения, выносимые на защиту:
1. При совместном культивировании бактерий Porphyromonas gingivalis и
Aggregatibacter actinomycetemcomitans происходит изменение конструкции и архитектуры
взаиморасположения клеток, а так же взаимное индуцирование персистентных свойств и
факторов патогенности.
-
При совместном культивировании Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans происходит расширение спектра лекарственной устойчивости.
-
Микроорганизмы Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans были чувствительны к бактериофагам, входящим в состав коммерческого препарата
ФАГОДЕНТ, и собственным бактериофагам, спектр литической активности собственных бактериофагов был выше, чем фагов, входящих в состав комплексного препарата ФАГОДЕНТ.
Научная новизна
Впервые с помощью электронного микроскопа («JEM-100B», Япония) описаны
морфологические особенности взаимоотношений между бактериальными клетками
монокультур Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans и их
сокультивируемыми вариантами Porphyromonas gingivalis + Aggregatibacter
actinomycetemcomitans. Исследование показало, что в концентрических зонах колоний
изучаемых нами культур обнаружены клетки, имеющие большое количество швермеров,
которые образуются в зависимости от пульсации “биологических часов”. При этом у
штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans выявлены
различные типы межмикробных контактов: «конец в конец», «конец в бок», «бок в бок»,
плотное слипание и образование перемычек на уровне наружных мембран. При
электронно-микроскопическом исследовании обнаружено, что клетки сокультивируемых
штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, с высокой
адгезивной активностью в большом количестве (более 15) плотно прилипают к
эритроцитам цыпленка, тогда как количество прилипающих клеток у монокультур
составляло не более 5 на единичный эритроцит. Проведена и представлена сравнительная
характеристика данных об адгезивной, гемолитической (-гемолитической,
тиолзависимой), дезоксирибонуклеазной (ДНКазной), лецитиназной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, протистоцидной активностях, токсичности и вирулентности у моно - и сокультивируемых штаммов бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Сокультивируемые штаммы Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans чаще, чем их монокультуры, обладают способностью синтезировать высокоактивный токсин, - и тиолозависимый гемолизин, лецитиназу, ДНКазу, они способны к адгезии к эритроцитам, что подтверждает тяжесть ассоциированных инфекционных процессов пародонта. Выявлен более широкий спектр антибиотикоустойчивости у сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans, чем у их монокультур. Возможно, использование коммерческого и собственного моноспецифического бактериофага после проведения клинических испытаний позволит существенно улучшить результаты консервативного
лечения и профилактики заболеваний пародонта, вызванных культурами
вышеупомянутых микроорганизмов.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Данные о повышении у сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis + Aggregatibacter actinomycetemcomitans адгезивной, гемолитической, лецитиназной, дезоксорибонуклеазной, антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активностей и вирулентных свойств (протистоцидный тест, интраназальное заражение и отек лап мышей, кожно-некротическая проба), по сравнению с их монокультурами, расширяют представление о роли ассоциаций этих бактерий в этиологии тяжелых форм пародонтитов, что в дальнейшем позволит оценить подходы в лечении и профилактике инфекционных заболеваний пародонта и правильно подобрать антимикробные препараты.
В качестве лечебно-профилактических препаратов при лечении инфекционных процессов пародонта, вызванных монокультурами Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans и их ассоциациями, также может применяться гель с бактериофагами ФАГОДЕНТ фирмы ООО НПЦ «МикроМир» и собственный бактериофаги, естественно после проведения клинических исследований и получения рекомендации на практическое применение.
Внедрение результатов исследования в теоретическую и практическую медицину может способствовать разработке оптимальных вариантов этиопатогенетического подхода к лечению и профилактике инфекционных процессов, а также своевременной коррекции патологических нарушений, связанных с действием факторов патогенности бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans в целом.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследований используются в бактериологических лабораториях ГБУЗ РБ «Республиканская детская клиническая больница», ГБУЗ РБ «Республиканская клиническая больница им. Г.Г. Куватова». Также результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах микробиологии, вирусологии и терапевтической стоматологии ФГБОУ ВО БГМУ Минздрава России.
Публикации
Соискатель имеет 10 опубликованных работ, из них по теме диссертации опубликовано 7 научных работ общим объемом 1,33 печатного листа, в том числе 3
публикации в научных журналах и изданиях, которые включены в перечень российских рецензируемых научных журналов ВАК и изданий для опубликования научных результатов диссертаций, 4 публикации в изданиях, входящих в базу РИНЦ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 157 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 36 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 195 источников, из них 83 отечественных и 112 зарубежных авторов.
Факторы патогенности бактерий Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans
В настоящее время известные факторы патогенности (ФП) микроорганизмов подразделяются условно на 4 группы: 1-я определяет взаимодействие бактерий с эпителием соответствующих экологических ниш и колонизацию зоны первичного инфицирования; 2-я обеспечивает устойчивость микробов к факторам защиты макроорганизма и способность к размножению in vivo; 3-я индуциирует синтез цитокинов и медиаторы воспаления, способствующие развитие иммунопатологии; 4-я токсины и токсические продукты, ферменты агрессии, вызывающие патологические изменения в органах и тканях макроорганизма [122, 182].
Условно-патогенные микроорганизмы и их ассоциации часто встречаются в составе нормальной микрофлоры и вызывают заболевания в основном при снижении естественной резистентности организма [10, 131].
Поэтому одним из критериев возможной их этиологической роли может служить обнаружение у клинических изолятов их факторов патогенности. Среди известных свойств патогенности исследователи существенную роль отводят адгезивности, гемолитической, лецитиназной, ДНК-азной, антилизоцимной активности и продукции токсинов [132, 144]. Указанные факторы патогенности могут контролироваться как хромосомными, так и внехромосомными элементами наследственности.
Взаимодействие микроорганизма с клетками хозяина начинается с адгезии, основанной на избирательном взаимодействии бактерий с соответствующими рецепторами эпителиоцитов с последующим колонизацией бактерий на поверхности слизистой [134, 181].
P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans могут образовывать комплекс фимбриальных адгезинов. У некоторых из них обнаружены маннозочувствительные и маннозорезистентные гемагглютинины, обусловливающие склеивание эритроцитов различных животных и птиц. Их фенотипическая экспрессия строго коррелирует с образованием фимбрий Р 1-го и 3-го типов, обеспечивающих адгезию бактерий и быструю колонизацию на самых разнообразных эпителиальных поверхностях [135, 145].
Маннозозависимые фимбрии 1-го типа представлены тонкими ригидными структурами, характерными для всех представителей различных бактерий. Они состоят из основного белка FimA и адгезинов FimG и FimH. Необходимо отметить, что фимбрии 1-го типа имеют выраженную реакцию гемагглютинации и высокие показатели НР - 1400 (силы гемагглютинации). Маннозорезистентные фимбрии 3-го типа представлены нитевидными образованиями длиной 0,5 -2,0 нм. Помимо описанных выше структур, в адгезии A.actinomycetemcomitans и P.gingivalis важную роль играют мембранные протеины белка ОmpХ (17 кДа). Установлено, что они снижают образование поринов, повреждают клетки-мишени, и тем самым повышают их устойчивость к -лактамным антибиотикам. По наблюдениям других авторов, этот белок усиливает способность к инвазии в клетках различных типов. По сходствам аминокислотных последовательностей белок Оmp Х на 50-60% гомологичен белку прикрепления – инвазии (Ail), а также белкам Rsk (англ. resuscitation/selection/kit), которые определяют у некотрых микроорганизмов резистентность к сывороточным факторам [128, 136].
Секреторный «Repeats-inoxin» (RTX) экзотоксин, продуцируемый некоторыми грамотрицательными бактериями, представляет собой определенную последовательность белковых гомологий. Токсин имеет различное количество глицина, а также содержит ионы Ca2+, имеет тандемные повторы, которые связаны с N-терминальным концом [129, 139].
Лейкотоксин А A.actinomycetemcomitans, входящий в семейство RTX токсинов, является одним из основных факторов патогенности A.actinomycetemcomitans и играет важную роль в патогенезе заболевания острого локализованного периодонтита [41, 107, 108, 133, 180]. У людей этот лейкотоксин А оказывает цитолитическое действие по отношению к нейтрофилам, механизм действия которого осуществляется через порообразования в клетках. Этот токсин секретируется бактериями в периплазматическое пространство, через клеточную стенку выходят на наружную поверхность и связывается с внешней мембраной клеток мишеней. Он может поражать как лимфоидные, так и миелоидные фагоциты [22, 33, 140]. Клетками-мишенями могут быть и полиморфно-ядерные лейкоциты, моноциты и макрофаги человека. Тромбоциты, фибробласты, эндотелиальные и эпителиальные клетки резистентны к воздействию данного токсина. Восприимчивость клеток-мишеней зависит от степени экспрессии на их поверхности молекулы 2 – интегрина, антигенсвязывающего мембранного белка 1 типа (LFA 1) лимфоцитов, Лейкотоксин А кодирован в опероне 4 генами. Ген А кодирует сам лейкотоксин и продуцирует в форме неактивной протоксина. Два гена: В и С, кодируют белки, которые активируют механизм клеточной гибели, известные как некроз и апоптоз [104]. Известно, что лейкотоксин А целенаправленно расширяет поры клеточных мембран, вследствие чего происходит осмотический лизис клетки.
Этот процесс происходит, когда лейкотоксин А действует в высоких концентрациях, при низких же концентрациях лейкотоксин А вызывает гибель клетки через механизмы апоптоза. Этот лейкотоксин считается одним из основных факторов вирулентности в патогенезе локализованного острого пародонтита и других форм начального пародонтита [23, 118, 148, 153, 164].
Клинически более тяжелые формы острого пародонтита и другие формы начального пародонтита в первую очередь связаны именно с высокотоксичными культурами A.actinomycetemcomitans [124, 147, 186].
Кроме секреторных факторов патогенности у грамотрицательных микроорганизмов важную роль играют липополисахариды клеточной стенки и белки наружной мембраны. Доказано, что липополисахариды A.actinomycetemcomitans являются мощными модуляторами, стимулируют продукцию интерлейкина-1, интерлейкина-1 и фактора некроза опухоли макрофагами в воспалительном процессе и вызывают костную резорбцию, а также липополисахарид оказывает цитотоксичность фибробластам окружающих тканей [74, 88, 113, 154, 160]. Механизм резорбтивной функции костной ткани связывают с протеолизом в микровезикулах остеобластов, а также возможны механизмы активации местных остеокластов. В этих сложных механизмах играют определенную роль и белки наружной мембраны, которые блокирует клеточный цикл, и оказывает провоспалительный эффект через индукцию интерлейкина – 6 и интерлейкина – 8 в моноцитах и фибробластах. Костная ткань рассасывается, напоминая «феномен сгорания» и это клинически наблюдается в виде атрофии альвеолярного отростка [129, 86, 111, 167, 188].
В патогенезе инфекционного процесса важны механизмы межмикробных взаимоотношений. В этом контексте известен белок «Аctinobacillin», продуцируемый некторыми штаммами A.actinomycetemcomitans, губительно оказывающие влияние против конкурентов, в частности действует против S.sanguis, S.uberis и Асtinomyces viscosus путем увеличения проницаемости клеточных мембран микробов [22, 161]. Однако по отношению «союзников инфекционного процесса», в частности P.gingivalis, действие бактериоцина A.actinomycetemcomitans в доступной нам литературе не нашли.
Что касается P.gingivalis, они активно поражают ткани парадонта, механизмы патогенного действия которого имеет свои особенности, в отличиии от A.actinomycetemcomitans, в частности осуществляется через механизмы инвазии. Данный микроб продуцирует достаточное количество токсических веществ для колонизации и деструкции тканей парадонта, однако продукция классических токсинов у P. gingivalis раннее не установлена.
Фимбрии P.gingivalis являются фактором взаимодействия бактерий с тканями хозяина, так способствуют адгезии и инвазии в таргетные ниши. Фимбрии P.gingivalis, вероятно, прерывают передачу клеточных сигналов через механизмы трансформации белков внутриклеточного матрикса в пародонтальных тканях [166, 193]. Они способствуют присоединению с некторыми ферментами слюны, белками внеклеточного матрикса и симбиотическими бактериями, а также адгезировать с клеточным alpha5beta1-интегрином чувствительных клеток [101, 168]. После адгезии P.gingivalis захватывается клеточной псевдоподией, которая делает возможным инвагинацию их внутрь клеток. Известно, что процесс инвазии требует от хозяина динамин, актиновые волокна, микроканальцы и липидные рафты. Фимбрии P.gingivalis классифицируются по 6 генотипам (типы I - V и Ib) на основе разнообразия генов fimA, кодирующих каждую субъединицу фимбрии. Было обнаружено, что интрацеллюлярная P.gingivalis с типом II фимбрии явно разрушает интегринсвязанные сигнализирующие молекулы, паксиллин и киназу, что делает невозможным клеточную миграцию иммунокомпетентных клеток и пролиферацию фибробластных и эпителиальных клеток хозяина [116]. Было выявлено, что у большинства пациентов, страдающих пародонтитом, обнаружены P.gingivalis с фимбриями типа II fimA, а также тип IV. Причем P.gingivalis с фимбриями типа II, гораздо чаще встречается у пациентов с более тяжелыми формами пародонтита [60, 172, 194].
Определение антибиотикорезистентности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans с помощью полимеразной цепной реакции
Технологию ПЦР применяли для диагностики антибиотикорезистентности. Для избирательной амплификации in vitro определенных участков МГС (межгенный спейсер) ДНК был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет за 20-30 последовательных циклов денатурации, отжига праймеров и их элонгации многократно увеличить число копий фрагмента ДНК, заключенного между сайтами отжига олигонуклеотидных затравок, подобранных с таким расчетом, чтобы после их отжига на разных цепях молекулы ДНК, синтез соответствующих комплементарных цепей был направлен навстречу друг другу. Для аналитической ПЦР использовался объем реакционной смеси 20-30 мкл, в то время как для препаративной амплификации ДНК он достигал 100 мкл. В этом случае реакционная смесь объемом 100 мкл содержала 1 мкл геномной ДНК (100 нг/мкл), 10 мкл 10-кратного буфера для Таq-полимеразы, поставляемого в наборе с используемым ферментом, 200 мкМ каждого из дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ и дТТФ), 200 нг (0,2 мкМ) каждого праймера и 2,5 - 5 е.а. Taq-полимеразы. Во избежание испарения жидкости на поверхность каждой реакционной смеси наслаивали 50 мкл вазелинового масла. ПЦР проводилась в амплификаторе МС-2 фирмы «ДНК-технология» (Россия). На начальном этапе проводилась денатурация ДНК при 94С, после чего следовали 25 - 30 циклов амплификации, каждый из которых включал стадию денатурации ДНК в течение 40 сек. при 94С, стадию отжига праймеров продолжительностью 1 мин 30 сек. при температуре от 54 до 72С (в зависимости от длины и GC состава нуклеотидных последовательностей использованных праймеров), и стадию элонгации в течение 1 мин 30 сек при температуре 72С, которая оптимальна для активности Taq-полимеразы. В некоторых случаях, для оптимизации ПЦР и уменьшения количества неспецифичных продуктов амплификации использовалась специальная процедура, получившая название «горячего старта». При этой процедуре добавление Taq-полимеразы, разбавленной в 10 мкл соответствующего 1-кратного буфера, в реакционную смесь осуществлялось только после нагрева последней до 94С, что исключало возможность неспецифичного отжига праймеров на нуклеотидных последовательностях с низкой гомологией. По завершении амплификации из реакционной смеси отбирали аликвоту объемом 10 мкл и анализировали в 2%-ом агарозном геле на электрофорезе.
Для использования ПЦР в экспресс диагностике антибиотикорезистентности первоначально был осуществлен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей, детерминирующих антибиотикорезистентность. Исследования проводили с помощью компьютерной программы DNASIS (HitachiSoftwareEngineering Со, Япония), а также с помощью пакета компьютерных программ Lasergene фирмы DNASTAR, Inc.” (США) с использованием Microsoft-совместимых персональных компьютеров, начиная от COREi3 до COREi7. Отправной точкой исследований явились нуклеотидные последовательности гена антибиотикорезистетности E.coli., которые были взяты для анализа из опубликованных статей, полученых по электронной почте из Европейского банка нуклеотидных последовательностей (EMBL European Bioinformatic Institute, Гинкстон, Великобритания), из EMBL Nucleotide Sequence Database, Release 41, декабрь 2015г. (EMBL European Bioinformatic Institute), а также из базы данных “DNA Data”, датированной январем 2016 г. фирмы «DNA STAR, Inc.» или посредством Интернета в обновляемых версиях «GenBank».
Нами были выявлены ряды специфических детерминант антибиотикорезистентности, к которым были подобраны соответстующие пары праймеров, специфичные генам : blaТ–12 - фрагмент гена tem-26B, определяющие резистентность к -лактамным антибиотикам; sat-2 ген инактивации стрептомицина и aadB-ген активации аминогликозидов [данный раздел был выполнен совместно с УНЦ РАН, с.н.с., к.б.н. Ахуновым Э.Д.]
Наиболее распространенным механизмом устойчивости к -лактамам является их ферментативная инактивация в результате гидролиза одной из связей -лактамного кольца ферментами -лактамазами. В этой связи, нами был проанализирован участок гена bla T-12, к которому была подобрана пара праймеров. Нуклеотидные последовательности полученных праймеров представлены в таблице 1.
Главной отличительной особенностью проведения амплификации, кроме фрагментов генов и подобранных к ним праймеров, было так же изменение температуры отжига, которая составила 56,6С и 56,8С соответственно.
Сравнительное изучение гемолитической активности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans
Условно-патогенные бактерии имеют сложную систему ферментов (токсинов), которые осуществляют процессы, позволяющие им преодолевать защитные механизмы макроорганизма.
Особое место в ряду факторов патогенности микроорганизмов семейства Porphyromonadaceae и Pasteurellaceae занимают внеклеточно секретируемые молекулы с мембраноповреждающей способностью, получившие общее название «гемолизины» [142].
Исследования последних лет показывают, что гемолизины различных типов относят к числу важнейших ферментов патогенности, которые и могут быть отнесены к факторам, указывающим в пользу потенциальной патогенности бактерий. Поражение токсином эритроцитов начинается с узнавания специфической рецепторной структуры, находящейся на клеточной поверхности. Гемолизины способны повреждать плазматическую мембрану эритроцитов в результате формирования пор, вызывая прямой лизис эритроцитов и получая микроорганизмами Fe+ организма хозяина. Порообразующие токсины и ферменты формируют трансмембранные поры и нарушают селективный вход и выход ионов через плазматическую мембрану.
В настоящее время у бактерий выявлено несколько типов гемолизинов. Среди них наиболее патогенетически значимым является пороформирующий -гемолизин, представляющий собой водорастворимый мономерный полипептид.
Исходя из выщеизложенного, мы сочли необходимым провести сравнительное изучение - и тиолзависимой гемолитической активностей у монокультур бактерий с P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans, и у их совместно культивируемых вариаций P.gingivalis + A.actinomycetemcomitans.
Исследование -гемолитической активности монокультур P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans показало, что из 32 культур с P.gingivalis гемолитической активностью обладали 8 штаммов (25,0±7,7%), среди которых 2 (25,0±7,7%) проявляли высокую, 1 (12,6±5,9%) - среднюю и 5 (62,5±8,6%) - слабую -гемолитическую активность. Не проявляли активность 24 (75,0±7,7%) культуры. Из 82 монокультур A.actinomycetemcomitans 46 (56,1±5,5%) штаммов обладали гемолитической активностью, среди которых 15 (32,6±5,2%) проявляли высокую, 10 (21,7±4,6%) -среднюю и 21 (45,7±5,5%) - слабую активность, и не проявляли -гемолитическую активность 36 (43,9±5,5%) культур. Штаммы P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans, изолированные от здоровых людей, проявляли -гемолитическую активность в 9% и 11% процентах случаев, соответственно.
В следующей серии опытов нами было проведено изучение гемолитической активности совместно культивируемых вариаций: P.gingivalis + A.actinomycetemcomitans. При этом, частота встречаемости гемолитической активности были значительно выше, чем у их монокультур 75,0±7,7% (24 вариации из 32) (рисунок 22,23).
При этом штаммы P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans при совместном культивировании значительно чаще проявляли высокую и среднюю -гемолитическую активности: в частности 12 (50,0±8,8%), 7 (29,2±8,0%) соответственно (таблица 3).
Таким образом, полученные результаты показали, что штаммы P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans при совместном культивировании, чаще проявляют -гемолитическую активность, чем их монокультуры, что по нашему мнению, возможно, связано с взаимным индуцированием -гемолитической активности сокультивируемых штаммов, что говорит об этиологической значимости ассоциациированых культур P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans, выделенных при инфекционных заболеваниях пародонта.
Albesa J. et al. (1985) доказали, что некоторые бактерии синтезируют отличающийся от -гемолизина тиолзависимый гемолизин, который в той или иной степени обуславливает патогенный потенциал возбудителя.
Исходя из этого, нами была изучена способность синтезировать тиолзависимый гемолизин на кровяном агаре с эритроцитами кролика у монокультур P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans и их сокультивируемых штаммов P.gingivalis+A.actinomycetemcomitans.
Проведенные исследования показали, что из 32 монокультур P.gingivalis тиолзависимой гемолитической активностью обладали 9 (28,1±7,9%) штаммов, среди которых 2 (22,2±7,4%) обладали высокой, 2 (22,2±7,4%) - средней и 5 (55,6±8,8%) штаммов – слабой тиолзависимой гемолитической активностью, не проявляли активность 23 (71,9±7,9%) культуры. Из 10 культур P.gingivalis, выделенных от здоровых людей, 2 (20,0%) штамма обладали слабой тиолзависимой гемолитической активностью. Из 82 монокультур A.actinomycetemcomitans, 20 (24,4±4,7%) синтезировали тиолзависимый гемолизин, среди которых 3 (15,0±3,9%) штамма проявляли высокую активность, 4 (20,0±4,4%) - среднюю, 13 (65,0±5,2%) - низкую активность и 62 (75,6±4,74%) культуры не обладали тиолзависимой гемолитической активностью. Из культур, изолированных от здоровых людей, один штамм A.actinomycetemcomitans давал высокую тиолзависимую гемолитическую активность. Среди 32 сокультивируемых штаммов, 14 вариаций (43,7±8,8%) синтезировали тиолзависимый гемолизин, среди которых 7 (50,0±8,8%) проявляли высокую активность, 6 (42,9±8,8%) -среднюю и 1 (7,1±4,5%) - слабую активность и не обладали активностью 18 (56,3±8,8%) вариаций.
Таким образом, результаты данного раздела исследований позволяют нам сделать заключение о том, что бактерии P.gingivalis и Aggr.act при совместном культивировании, значительно чаще проявляют - и тиолзависимую гемолитическую активности, чем их монокультуры, что показывает взаимную индукцию гемолитической активности этих бактерий, которую необходимо учитывать при оценке этиологической значимости микроорганизмов, выделенных в виде ассоциаций при заболеваниях пародонта.
Сравнительное изучение токсичности монокультур и сокультивируемых штаммов Porphyromonas gingivalis и Aggregatibacter actinomycetemcomitans методом кожно-некротической пробы
В качестве одного из маркеров токсичности моно - и совместно культивируемых штаммов P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans мы использовали кожно-некротическую пробу. В качестве экспериментальных животных использовали кроликов – самцов весом 2,5 кг.
Способность некротизировать участки кожи у кроликов, при внутрикожном введении суспензий моно - и совместно культивируемых штаммов P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans изучалась нами следующим способом: на выстриженный участок боковой поверхности кролика вводили внутрикожно 2-х миллиардную суточную агаровую культуру моно- или совместно культивируемых штаммов P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans.
Количество внутрикожных инъекций не превышало одной у каждого кролика. Результаты регистрировали через 6, 8, 12, 24, 48 и 72 часа путем измерения размеров воспалительного фокуса и установления характера воспалительного процесса (некротизирующий фактор, характер гнойно воспалительного процесса, общее состояние испытуемого животного). Все взятые в эксперимент животные до опытов выдерживались на карантине около 2-х – 3-х недель с целью исключения какой-либо инфекции. В опыт нами были взяты 7 кроликов, на которых были исследованы культуры P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans (по 2 кролика на каждую культуру) и вариации совместно культивируемых штаммов P.gingivalis + A.actinomycetemcomitans – по 2 испытуемых животных на каждую вариацию и один кролик для контроля.
Критерии оценки проведенных исследований были следующими: 1) Разница в величине воспалительного участка (гнойника, некроза) на месте введения моно - и совместно культивируемых штаммов изучаемых бактерий. 2) Разница в течении и развитии инфекционного очага и процесса, их характера и сроков течения (общее состояние испытуемого животного) при введении монокультур P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans и их совместно культивируемых вариаций P.gingivalis + A.actinomycetemcomitans.
При изучении кожно-некротической способности 2 монокультур штаммов A.actinomycetemcomitans у взятых в опыт 2-х животных путем внутрикожного введения 2-х миллиардной суспензии, через 8 часов отмечалось повышение температуры тела животных 39С (нормальная температура у кроликов равна 38-38,5С), снижение активности, и развитие на месте введения суспензии монокультур A.actinomycetemcomitans очага гиперемии и отека. В дальнейшем эти явления становились более интенсивными, но, не доходя до развития обособленного очага гнойного воспаления. Очаг воспалительного фокуса через 12 часов составлял 2,02,5 см и 2,52,5 см с повышением температуры тела кроликов до 40С; через 24 часа с момента внутрикожного заражения очаги увеличились до размеров 33,5 см. и 33 см, с образованием обособленных участков и гнойно-воспалительных очагов размерами 11,5 см и 11, гнойным мешком и с повышением температуры до 41С. Через 48 часов, с момента введения суспензии культур A.actinomycetemcomitans воспалительные очаги сохраняли свои границы и признаки интоксикации и проявлялись в виде увеличения температуры до 42С, с ухудшением общего состояния кроликов. Через 72 часа после введения суспензии A.actinomycetemcomitans характер развития инфекционного процесса развивался в пользу убывания, и проявлялся в виде спада температуры тела кроликов до 41С и улучшения общего состояния животных. Что касается места введения суспензии монокультур A.actinomycetemcomitans, то в течение последующих 4, 5, 6 и 7 суток, происходило заживление с процессом рассасывания гнойных очагов воспаления, без образований каких-либо выраженных и видимых изменений кожных покровов животных.
При внутрикожном введении 2-х миллиардной суспензии культур бактерий рода P.gingivalis, картина развития воспалительного процесса показала, что при введении бактерий P.gingivalis, через 8 часов, отмечалось повышение температуры тела кроликов до 40С и 41С, снижение активности, пассивность, развитие на месте введения суспензии монокультур штаммов бактерий P.gingivalis очагов гиперемии и отека размерами 1,51,5 см. и 1,01,5 см., с образованием неоднородных гиперемированных участков, что сопровождалось в дальнейшем признаками развития инфекции, образуя очаги воспалительной зоны, размерами 2,02,5 см. и 2,02,0 см. Очаги воспалительного фокуса через 12 часов составляли 3,02,5 см и 2,52,5 см, приобретали красный цвет с последующим образованием гнойных мешков с серозно-гнойным экссудатом и повышением температуры до 42С; через 24 часа очаги увеличились до размеров 3,54 см. и 3,03,5 и образовались обособленные участки с гнойным мешком размерами 1,51,5 см. и 1,01,5 см., с повышением температуры до 43С. Через 48 часов, с момента введения суспензии P.gingivalis, воспалительные очаги сохраняли свои границы, но признаки интоксикации проявлялись в меньшей степени, в виде снижения температуры тела до 41С, улучшением общего состояния кролика. Через 72 часа после введения суспензии бактерии P.gingivalis происходило снижение температуры тел кроликов до 39С и 40С, с улучшением общего состояния испытуемых животных.
Что касается характера воспалительного процесса, вызванного введением 2 миллиардной суспензии культур совместно культивируемых штаммов P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans, то через 6 часов, отмечалось повышение температуры тела кроликов до 42С, резкое снижение активности кроликов, угнетенное состояние, пассивность, развитие на месте введения обширного очага гиперемированного участка и гнойно-геморрагического отека, размерами 3,54,0 см, а так же с образованием мешка с гнойно геморрагическим содержимым размерами 2,53,0, что сопровождалось в дальнейшем с образованием воспалительного очага обширной гиперемированной зоной, размерами 5,06,0 см (рис.15). Очаг воспалительного фокуса через 12 часов составлял 6,57,0 см., с ярко багрово-красным цветом, с обильным накоплением геморрагического экссудата гнойного мешка размерами 4,04,0 см. и 4,54,0 см., а так же повышением температуры тела до 43С; через 24 часа с момента внутрикожного введения, гнойно-воспалительный очаг увеличился до размеров 6,06,5 см. с образованием разлитой и обширной гиперемии размерами 1012см., а так же увеличением размеров гнойного мешка до 5,55,0 см. и повышением температуры до 43С. Через 48 часов, с момента введения суспензий совместно культивируемых штаммов P.gingivalis + A.actinomycetemcomitans, воспалительный очаг расширял свои границы и признаки интоксикации приобретали более выраженный характер, что проявлялось в виде повышения температуры до 43,5С. Через 72 часа после введения суспензий совместно культивируемых штаммов P.gingivalis + A.actinomycetemcomitans развитие инфекционного процесса приобрело ярко выраженный характер, что привело к гибели 1-го из 2-х экспериментальных животных.
Полученные результаты позволяют нам сделать вывод, что бактерии P.gingivalis и A.actinomycetemcomitans способны вызывать положительную кожно-некротическую пробу, которая значительно ярче проявляется у суспензий совместно культивируемых вариаций, что возможно связано с взаимным индуцированием факторов патогенности при совместном культивировании этих бактерий.