Введение к работе
Актуальность проблемы. Последние два десятилетия отмечается возрастание роли синегнойной палочки в возниковении гнойно-воспалительных заболеваний. в том числе внутриОольничных инфекций (Г.К.Бодрова и др.,1995,1997; д.Д. Меньшиков и др., 1S96; С.й.Пыла-ева и др.,1997; Яковлева В.П. ,1997; Bert F. et ai.,1994; Beghi G. et al.,1995; Ritter E. et al., 1S95; Hideo I. et at.,1996; Balles-tero S. et a].,1996; Dronda F. et al., 1996).
В связи с недостаточной эффективностью антибактериальных средств при лечении синегнойной инфекции особое значение приобретает терапия иммунными препаратами направленного действия.
3 настоящее время в практике здравоохранения используется анатоксин слнегнойной палочки. Накоплен положительный опыт его применения для профилактики синегнойной инфекции в ожоговой, травматологической и кардиохирургической клиниках, а также для получения лечебной антлеинегнойной антитоксической плазмы, эффективность которой подтверждена в клинических "испытаниях Ш.А. Михайлова и др., 1993, 1995; Г.Н. Бодрова и др., 1995, 1995, 1997).
. Производство иммунобиологических препаратов требует разработки надезгных информативных и стандартных методов сценки их специфической активности.
По действующей нормативно-технической документации анатоксин синегнойной палочки контролируется в тесте выживаемости белых беспородных мышей и дозируется з мг белка в прививочной дозе. Поскольку по составу он представляет собой гетерогенную систему, поэтому дозирование в весовых единицах не учитывает истинное количество антигена экзотоксина Л в прививочной дозе. Методы количественной оценки его содержания в препарате з настоящее время не разработаны. Кроме того, определение имммуногенности анатоксина по проценту выживаемости, основанное на принципе минимальных требований, позволяет судить лишь о соответствии препарата условно принятым лимитам, не давая возможности тонко дифференцировать высокоактивные серии от относительно низкоактивных. В этом плане тест определения антиток-синсвязывающей активности синегнойного анатоксина представляется более совершенным, так как позволяет определять точное количество
антигена экзотоксина А в препарате, выявлять различия в свойствах анатоксинов разных серий и обеспечивает возможность рациональной стандартизации анатоксина по количеству антигена в препарате (ЕС/мл)
При использовании анатоксина для получения лечебной антитоксической противосинегнойной плазмы важное значение имеют методы определения ее качества по наличию специфических антитоксических антител.
Наиболее надежно и достоверно измерить их уровень позволяет метод, основанный на использовании реакции нейтрализации специфическим антитоксином летального действия экзотоксина Л - ведущего фактора патогенности синегнойной палочки.
Для решения широкого круга вопросов, связанных с разработкой и стандартизацией методов определения антитоксинсвязывающей активности анатоксина синегнойной палочки и антитоксической активности донорской противосинегнойной плазмы, проводимых in vivo, необходимо наличие тест-системы, включающей синегнойный токсин со стабильными свойствами и стандартный образец антитоксической противосинегнойной сыворотки, с точно охарактеризованной активностью.
Важной задачей является разработка адекватного серологического экспересс-метода выявления противосинегнойных антитоксических антител in vitro, способного заменить относительно сложный метод биологического теститрования. Многими исследователями показана пригодность РКГА с использованием диагностикумов на основе различных антигенов синегнойной палочки для оценки уровня специфических антител у больных и привитых синегнойными вакцинами доноров (И.А.Александрова и др.,1986; Л. Г. Подгорная, К.Ф.Дзюбан. 1986; С.А.Егизова и др., 1988, 1990; М. Polack, N.Taylor, 1977; K.Takeshi, J.Homma, 1978; M.Polack, L.Young, 1979). Создание коммерческого эритроцитарного диагностикума на основе анатоксина синегнойной палочки позволит стандартизовать условия проведения реакции, значительно упростить и ускорить лабораторные исследования при отборе иммунной противосинегнойной плазмы с токсиннейтрализующей активностью для чего, естественно, необходимо быть уверенным в том. что результаты, получаемые в РИГА, отражают истинное содержание антитоксина, выявляемое в опытах прямой нейтрализации токсина in vivo.
Цель и задачи исследования. Все вышеизложенное обуславливает актуальность исследований, имеющих целью совершенствование к стандартизацию методов оценки специфической активности анатоксина си-
негнойной палочки и антитоксической противосинегнойной плазмы. В задачи исследования входило:
разработка эритроцитарного диагностикума на основе анатоксина си-негнойной палочки для выявления в РИГА антитоксических антител в -сыворотках крови иммунизированных животных и людей;
получение стабильной формы синегнойного токсина, изучение его свойств и возможности использования в серологических тест-системах;
получение иммунной антисинегнойной антитоксической сыворотки и сертификация ее в качестве стандарта анатоксина синегнойной палочки;
изучение возможности использования стандарта антитоксина синегнойной' палочки для количественной оценки специфической активности синегнойного анатоксина и донорской антисинегнойной плазмы в реакциях нейтрализации и антитоксинсвязывания;
сравнительная оценка специфической активности донорских плазм в реакции нейтрализации и РИГА.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Впервые научно обоснованы методические подходы к оценке специфической активности противосинепюйных иммунопрепаратов в опытах in vivo с использованием серологической тест-системы, включающей тест-токсин и стандарт антитоксина, и in vitro - в реакции непрямой гемагглютинации. Установлена прямая корреляция между показателями гуморального иммунитета, выявляемыми в РИГА и в реакции нейтрализации в опытах на белых мышах. Полученные данные позволили рассматривать РИГА в качестве надежного серологического теста при оценки антитоксического противосинегнойного иммунитета у привитых. Установлен лимит антитоксической активности лечебной плазмы , определяемый в РИГА.
Сконструирован сухой стабильный, чувствительный, специфичный оритроцитарный диагностикум на основе анатоксина синегнойной палочки, использование которого позволило стандартизовать условия проведения РКГА. Налажен производственный выпуск препарата.
Получен сухой синегнойный токсин со стабильными свойствами. Показана возможность его использования, а также его глицериновых растворов в качестве тест-токсина в реакции нейтрализации.
Разработан стандарт синегнойного антитоксина с точно установ-
.-6-
ленной активностью.
Впервые обоснована возможность количественной оценки антигенной активности анатоксина синегноинои палочки в единицах связывания (ЕС). Установлены пределы колебаний этого показателя для производственных серий препарата.
Разработанные диагностические тест-системы и методические приемы позволили стандартизовать условия проведения серологических реакций для оценки специфической активности анатоксина синегноинои палочки и донорской противосинегнойной плазмы.
Разработана и утверждена нормативно-техническая документация:
-
ВФС 42-361ВС-92. ВФС 42-2842-97 и ЭПР N 405-92. Диагностикум эритроцитарный синегнойный антигенный сухой. Инструкция по применению утверждена Минздравом РФ (1992).
-
ЭПР N 404-92. Анатоксин синегноинои палочки адсорбированный жидкий.
-
ВФС 42-362ВС-92. ФС 42-3366-97. Плазма антисинегнойная антитоксическая человека. Инструкция по применению утверждена Минздра-
. вом РФ (1992).
4. Стандартный образец предприятия (СОИ) антитоксической противоси
негнойной сыворотки. Утвержден Советом УфНИИВС им.И.И.Мечникова
(1988 г., протокол N 11).
Работа выполнена в рамках Союзной программы С-23 "Разработать и внедрить в практику здравоохранения эффективные меры борьбы и профилактики внутрибольничных инфекций и сепсиса".
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на республиканской научной кон-ференции"Иммунитет и иммунобиологические препараты" (Уфа, 1991); научно-практической конференции"Диагностика, профилактика и лечение гнойно-септических заболеваний лекартсвенными препаратами, выпускаемыми ИПО"Иммунопрепарат" (Уфа, 1993); международном симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова и 90-летш Уфимского НИИВС им.И.И.Мечникова НПО "Иммунопрепарат" (Уфа, 1995); межрегиональной научно-практической конференции "Госпитальная инфекция в реанимации и интенсивной терапии. Актуальные проблемі анестезиологии и реаниматологии" (Уфа, 1996); VII-ом съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов, паразитологов (М., 1997).
Структура и обьем диссертации
Диссертация состоит из введения, 3 глав обзора литературы,
глав собственных исследований, заключения, выводов и списка лите-
атуры. Материалы диссертации изложены на 143 страницах машинопис-
ого текста. Список литературы включает 131 источник отечественной
89- иностранной литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и
рисунками.