Системы генетического обмена патогенных псевдомонад Меринова, Людмила Константиновна

Введение к работе

Возбудители мелиоидоза (Pseudomonas pseudomallei) и сапа (Pseudomonas mallei) являются высокопатогенными для человека и животных представителями обширного рода псевдомонад, в большинстве своем состоящего из убиквитарных сапрофитов и фитопатогенных бактерий ( Илюхин, 1985; Беляков и др., 1990; Смирнов, Киприанова, 1990; Bergan, 1981; Palleroni, 1984).

В отличие от многих известны; патогенных микроорганизмов, P.pseudomallei и P.mallei имеют ограниченное географическое распространение. Тем не менее, случаи заболевания мелиоидозом и сапом постоянно регистрируют в странах, отдаленных от эндемичных районов (США, Франция, Канада, Япония), куда инфекции оказываются завезенными больными людьми или инфицированными животными (Howe et al.,1971; Dodin, Galimand, 1976; Mayer, 1981; Bremmelgaard et al., 1982; Galimand, Dodin, 1982; Wilks et al., 1994).

Надежных средств защиты от мелиоидоза и сапа не найдено. Лечение их, несмотря на непрерывно растущий арсенал химиотерапев-тических веществ, остается серьезной проблемой, связанной с высокой естественной резистентностью видов к антибиотикам (Антонов и др. 1991; Батманов, 1991, 1994; Eickhoff et al., 1970; Ashdown, Frettingham, 1984; Mc Eniry et al., 1988; Yamamoto et al., 1990; Haase et al., 1995). К этому необходимо добавить отсутствие препаратов для специфической профилактики заболеваний, во-многом объясняющееся эклектичностью подходов к получению вакцин, неизбежного при недостатке теоретически обоснованных представлений о реализации микроорганизмами патогенных свойств.

Современные знания биологии P.pseudomallei и P.mallei нуждаются в притоке новых научных данных, способных раскрыть природу и механизмы адаптационной изменчивости и патогенности, присущих бактериям, что требует разработки у них эффективных способов анализа геномов. Изучение структуры и функции генетических детерминантов, ответственных за важнейшие биологические признаки рассматриваемых псевдомонад, является определяющим фактором целенаправленной перестройки их генетического аппарата, выделения штаммов с заданными свойствами, конструирования вакцин, создания средств профилактики и лечения вызываемых микроорганизмами заболеваний.

P.pseudomallei и P.mallei мало известны в качестве объектов генетического исследования. Публикации непосредственно относящиеся к генетике мелиоидоза и сапа относительно немногочисленны. Это, преж-

де всего, работы по получению у того и другого видов маркировании штаммов (Ряпис, Ширяев, 1971; Шиповская, Ряпис, 1982; Шиповская др. 1983; Тарасова, Ряпис, 1984; Levine, Maurer,1958; Evans, 1966;), а та* же изучению у P.pseudomallei генетической трансформации (Тарасов* Ряпис, 1983; Буланцев, Лозовая, 1985). У возбудителя мелиоидоза выявле естественный механизм формирования компетентности клеток, разрабс таны основные параметры трансформации хромосомной ДНК на плот ной среде, определены частотные характеристики образования рекомбі^ нантов при передаче признаков ауксотрофности.

Осуществлен ряд работ по применению трансформации для карта рования участков хромосомы P.pseudomallei, ответственных за биох* мическую активность микроорганизма (Тарасова, Меринова, 1984; Тс расова, 1984; Тарасова, Антонов, 1984), а также для идентификации ш тогенных псевдомонад.

Наряду с природной трансформабельностью у P.pseudomallei yen новлена способность к восприятию в конъюгации плазмиды RP4, рециш ентные свойства в отношении этой плазмиды одновременно была выя: лена у P.mallei (Петере и др. 1983). При конъюгации в жидкой ере;) плазмида с низкой частотой передавалась в штаммы микроорганизме от гетерологичного донора (P.aeruginosa), проявляя стабильное наслед( вание в новых бактериальных хозяевах и эффективную экспрессию д< терминируемых RP4 признаков резистентности к тетрациклину и каш мицину.

В данном контексте следует упомянуть также работы по изучент фагов P.pseudomallei, как возможных инструментов генетического иі следования (Манзенюк и др., 1993; Денисов, Каплиев, 1995; Гришкині 1996), и собственных плазмид микроорганизма (Петере, 1982; Антоної 1995). Фаги и плазмиды возбудителя мелиоидоза не нашли пока примі нения в изучении геномов патогенных псевдомонад, скорее они выявил необходимость в дальнейшем развитии методического базиса гені тического анализа видов, требующейся для самостоятельного иселедові ния структуры и функции обнаруженных внехромосомных репликонов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ заключалась в изучении у P.pseudomallei и P.mall систем генетического обмена и оценке их возможностей в качестве мет< дической основы для исследования геномов микроорганизмов и пі лучения штаммов с заданными свойствами.

1. Совершенствовать технику проведения трансформации у P.pseudomall для создания эффективного способа передачи у неё различных хром<

сомных признаков. Изучить возможность проведения трансформации у P.mallei. Разработать трансформацию микроорганизма хромосомной ДНК в условиях естественной или индуцированной компетентности.

1. Выяснить возможность трансформационной передачи возбудителям сапа и мелиойдоза ДНК плазмид, способных реплицироваться в широком круге бактериальных хозяев.

2. Изучить реципиентную способность различных штаммов P.pseudomallei и P.mallei в отношении R-плазмид Iric'Pl группы и плазмид других групп несовместимости. Разработать оптимальные условия проведения у обоих видов конъюгации.

3. Разработать у P.pseudomallei и P.mallei способы инсерционного мутагенеза с использованием транспозонов Тп 10, Тп9, Тп5. Оценить перспективность транспозонного мутагенеза для получения мутантов, недостаточных по продукции некоторых внеклеточных ферментов и поверхностных антигенов, потенциальных факторов патогенности возбудителей мелиойдоза и сапа.

4. Исследовать в штаммах P.mallei и P.pseudomallei мобилизующую активность плазмид Inc Р1 группы в отношении хромосомных генов. Определить возможность использования этих плазмид для конструирования донорных штаммов, пригодных для первичного картирования хромосом микроорганизмов.

5. Изучить у P.pseudomallei и P.mallei мобилизующую способность плазмид Inc PI группы в отношении неконъюгативных решшконов. Разработать альтернативный трансформации способ переноса в клетки псевдомонад рекомбинантных ДНК и собственных критических плазмид возбудителя мелиойдоза.

Изучены системы генетического обмена патогенных псевдомонад.

Впервые показан феномен генетической трансформации у возбудителя сапа. Определены условия проведения ее по маркерам ауксотроф-ности при использовании в качестве донорного материала хлороформных лизатов клеток микроорганизма или очищенных препаратов ДНК. Наряду с мелиоидозным микробом возбудитель сапа охарактеризован как природнотрансформирующийся вид, отличающийся от P.pseudomallei более низким уровнем трансформационной активности.

Разработаны условия трансформации возбудителя мелиойдоза в системе естественной компетентности. Установлено, что минимальная среда не является определяющим фактором развития компетентности клеток микроорганизма и может быть заменена плотными средами пол-

ноценного состава, в том числе, селективными для исследуемых трансформантов. Варьирование условий скрещиваний позволило трансформировать P.pseudomallei по различным признакам, не связанным с ауксо-трофностью - подвижности, антибиотикорезистентности, внеклеточной ферментативной активности.

Впервые отмечена возможность трансформации обоих видов микроорганизмов ДНК плазмид RSF1010 OncQ) _и RP4 (incPl) в условиях, не требующих специальной подготовки клеток реципиентов. Показано.что трансформация плазмидными ДНК, в сравнении с передачей хромосомы, является малоэффективным процессом переноса, протекающим с низкой частотой.

У возбудителей мелиоидоза и сапа изучен опосредованный R-плазмидами Р1 группы несовместимости процесс конъюгации. В качестве основного фактора, обеспечивающего эффективную передачу плазмид в межвидовых и внутривидовых скрещиваниях, отмечено значение инкубирования конъюгационных смесей на плотной среде при температуре оптимальной для роста каждого микроорганизма. Установлены особенности наследования плазмид и выражение плазмидных генов антибиотикорезистентности в новых хозяевах. Обнаружено значительное снижение конъюгативных свойств Р1 репликонов в клетках P.pseudomallei. Показано, что контакт клеток донорных и реципиентных культур на плотной среде у этого микроорганизма дает начало одновременно двум, протекающим независимо друг от друга процессам - конъюгации и естественной трансформации, при этом первая служит преимущественно способом передачи плазмид, вторая - хромосомной ДНК.

Впервые у возбудителей мелиоидоза и сапа осуществлен инсерци-онный мутагенез. Определены основные условия для включения транспозонов ГпЮ и Тп9 в хромосому P.pseudomallei из репликонов тем-пературочувсгвительных плазмид RPl::TnlO Rep ts и RPl::Tn9 Rep ts и Tn5 ( в хромосомы обоих микроорганизмов) из репликона "суицидной" плазмиды pSUP5011. Установлены наиболее типичные сайты ауксо-трофности, служащие ь. хтом внедрения транспозонов, отмечено отсутствие способности Tn-элементов индуцировать в хромосоме псевдомонад вторичные геномные перестройки. Показано стабильное наследование клетками инсерционных мутантов возбудителя мелиоидоза плазмиды RP1 Rep ts - вектора транспозонов ТпЮ и Тп9. Получены и охарактеризованы инсерционные ауксотрофные мутанты микроорганизмов, а также мутанты с дефектами в генах, ответственных за признак подвижности, синтез ряда внеклеточных ферментов (лецитиназы, протеазы, липазы), гемолитическую активность и продукцию антигена 8.

Изучено поведение температурочувствительной по репликации гшазмиды RPl Rep ts в клетках P.pseudomallei. Высказано предположение этносительно нестабильной интеграции плазмид Р1 группы несовместимости с хромосомой микроорганизма и ограниченной способности их к мобилизации хромосомы. Установлена возможность интеграции с хромосомой P.mallei плазмиды рТНЮ в клетках, резистентных к фагу PRD1 клонов штамма Ц-4. Охарактеризованы свойства полученного впервые сонорного штамма P.mallei Ц-4 Д53, с помощью которого проведено начальное картирование участка хромосомы возбудителя сапа, ответ-гтвенного за синтез рада аминокислот.

Впервые показана возможность эффективной мобилизации конъ-югативными плазмидами Inc PI группы в клетки P.pseudomallei и P.mallei кеконъюгативных репликонов (плазмиды Inc Q группы RSF1010, ре-комбинантных ДНК на её основе, а также найденных в штаммах возбудителя мелиоидоза криптических плазмид). Установлены условия селекции, а также общие закономерности наследования клетками обеих лсев-їомонад мобилизуемых и мобилизующих плазмид в виде автономных репликонов.

Разработаны методы трансформации P.pseudomallei и P.mallei на эснове природной способности клеток обоих видов поглощать ДНК, гозволяющие осуществлять передачу различных хромосомных маркеров "'Способ картирования хромосомы псевдомонад" защищен авторским ;видетельством 1067821).

В качестве метода идентификации патогенных псевдомонад гене-гическая трансформация включена в методические рекомендации " Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа", утвержденные 16.03.95 г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Г.Г. Они-ценко.

Разработаны способы проведения у P.pseudomallei и P.mallei сонъюгации. Предложен оригинальный подход для отбора трансконъ-огантов P.mallei, несущих интегрированную с хромосомой микроорганизма плазмиду рТНЮ. Получен донорный штамм P.mallei Ц-4 Д53, іригодньїй для начального картирования её хромосомы.

Разработаны способы включения в хромосому P.pseudomallei гранспозонов ТпЮ, Тп9, Тп5. Приемы, необходимые для инсерции ГпЮ, изложены в "Методических рекомендациях по использованию гранспозона ТпЮ для получения инсерционных мутантов возбудителя лелиоидоза", утвержденных директором ВолгНИПЧИ 12.03.92.

Предложен эффективный способ переноса в клетки P.pseudomallei P.mallei ДНК плазмид (рекомбинантных молекул или собственных вн хромосомных репликонов возбудителя мелиоидоза) путем мобилизаци их конъюгативными плазмидами Р1 группы несовместимое! ("Методические рекомендации по применению конъюгативных I плазмид для мобилизации в штаммы Pseudomonas pseudomallei некой^-, югативных плазмид" утверждены директором ВолгНИПЧИ 12.03.92).

В ходе выполнения работы получены коллекции маркированнь штаммов, нашедших применение при разработке у патогенных псевд< монад систем генетического обмена, а также использованных в исследа ваших по совершенствованию средств профилактики и лечения сапа мелиоидоза (авторские свидетельства NN 255040, 255041, 29823 322767, 193486). "Методические рекомендации по получению ауксотроф ных, температурочувствительных, антибиотикорезистентных мутанте возбудителей сапа и мелиоидоза" утверждены начальником Главног Управления МЗ СССР В.И.Михайловым 5.03.82. Генетически изменеї ные штаммы нашли применение при испытании питательных сред ра: личного целевого назначения (патент N 2070924 на изобретем "Транспортная среда для патогенных псевдомонад" зарегистрирован Государственном реестре изобретений 27.12.96).

Коллекции мутантов P.pseudomallei с инсерциями в хромосом ТпЮ, Тп9, дефектных по продукции внеклеточных ферментов, а такав мутантов P.mallei, индуцированных Тп5, недостаточных по синтезу ai тигена 8, предназначенных для изучения генетических детерминанте факторов патогенности возбудителей мелиоидоза и сапа, депонированы Российской коллекции патогенных бактерий научно-исследовательског противочумного института "Микроб". В этой же коллекции депонирова набор чистых линий бактериофагов, выделенных из различных штаммо P.pseudomallei.

1. У возбудителей ;лелиоидоза и сапа выявлено наличие двух» стем передачи генетического материала - трансформации и конъюгацш обеспечивающих этим микроорганизмам способность к обмену хроме сомной ДНК и ДНК плазмид.

2. P.pseudomallei и P.mallei относятся к природнотрансформирук щимся микроорганизмам с различным уровнем естественной компетеш ности. Трансформация у них является, главным образом, способом пер« дачи хромосомной ДНК и менее эффективно может служить перенос ДНК плазмид.

3. Возбудители сапа и мелиоидоза воспринимают в конъюгации от гетерологичных доноров R-плазмиды Inc Р1 группы, стабильно наследуют Р1 репликоны и эффективно экспрессируют их гены, детерминирующие признаки резистентности к антибиотикам.

4. Трансконъюганты P.pseudomallei и P.mallei, несущие плазмиды Р1 группы несовместимости, проявляют, с некоторыми отличиями, донор-ную активность во внутривидовых скрещиваниях или в скрещиваниях с гетерологичными микроорганизмами. У P.pseudomallei в условиях, оптимальных для конъюгационной передачи плазмид, происходит также ее-, тественная трансформация хромосомной ДНК.

5. Транспозоны ТпЮ, Тп9, Тп5 при включении в хромосомы P.pseudomallei или P.mallei индуцируют повреждения в различных участках геномов, что позволяет получать инсерционные мутанты псевдомонад с различными свойствами.

6. Температурочувствительные плазмиды , RPl::TnlO Rep ts RP1 ::Tn9 Rep ts, векторы транспозоновТпЮ и Тп9, находятся в клетках инсерционных мутантов P.pseudomallei в состоянии нестабильной интеграции с хромосомой и не обнаруживают мобилизующей активности в отношении хромосомных генов. При определенных условиях плазмиды' Р1 группы способны интегрироваться с хромосомой P.mallei, опосредуя направленный перенос хромосомных маркеров.

7. Плазмиды Inc PI группы проявляют выраженную мобили
зующую активность в отношении неконъюгативных плазмид, способных
реплицироваться в P.pseudomallei и P.mallei. Мобилизация с помощью .
плазмид Р1 группы является эффективным методом переноса в клетки
этих псевдомонад рекомбинантных ДНК и собственных нетрансмиссив-^:
ных репликонов возбудителя мелиоидоза.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены H.a_t. Всесоюзной конференции "Молекулярная биология и генетика возбуди-;/ телей ООИ (Маркс, 1982); выездном заседании союзной проблемной ко-' миссии "Генетика бактерий" (Ставрополь, 1984); Всесоюзной конференции "Молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителей ООИ" (Ростов-на-Дону, 1984); на научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 1982, 1983, 1985, 1986, 1987, 1989, 1990 гг.; на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности ООИ" (Волгоград, 1992), на юбилейной конференции, посвященной 25-летию Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 46 работ, в том числе патент и 6 авторских свидетельств на изобретения. Материалы диссертации вошли в две коллективные монографии.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ