Введение к работе
Актуальность проблемы. Экспрессная индикация антигенов возбудителя эотулизма необходима в условиях производства профилактических препаратов, где специфическая детекция проводится постоянно и связана с большими трудовыми и материальными затратами, а также в системе санэпиднадзора для жстреннои диагностики этиологии тяжелых пищевых интоксикаций, их :воевременной терапии и организации эффективного контроля за іроизводством и хранением определенных групп пищевых продуктов, что особенно актуально в настоящее время в связи с проводимой приватизацией )бъектов общественного питания и торговли, расширением изготовления и іеалнзации различных пищевых продуктов (в том числе консервированных и в ткуумной упаковке) мелкими производителями и частными лицами. По щнным литературы (А.А.Иванов, Н.Н.Трушкина,1996; И.С.Каздобина с соавт., 995) в России с 1992 года наблюдается рост заболеваемости ботулизмом при ;мертности 8,2% (в 1992 году) - 10,5% (в первое полугодие 1996 года).
Классическим методом индикации ботулинических антигенов является іиопроба и ее варианты (реакция нейтрализации токсина на мышах). Этот метод гока не имеет альтернативы. Несмотря на высокую чувствительность, есть ряд юментов, которые сильно снижают его диагностическую ценность — это іеобходимость использования для постановки реакции большого количества бсолютно здоровых животных определенной массы и возраста, а также тдаленность учета результатов реакции (до 4 суток). К тому же постановка іетода может проводиться лишь в хорошо оснащенных лабораториях при аличии соответствующих специалистов. В последнее время для лабораторной иагностики ботулизма применение биологической пробы стало зтруднительным в связи с дефицитностью и высокой стоимостью абораторных животных. В условиях производства бактерийных препаратов аиболее ярко проявляются такие негативные качества этого метода, как рудоемкость и ретроспективность, что делает невозможным применение его
4 на отдельных стадиях производства, требующих немедленного получения результата (например, на стадии ультрафильтрации).
Кроме того, сейчас по чисто этическим соображениям ставится задача максимального исключения животных из контроля бактерийных препаратов и высказываются сомнения в корректности распространения результатов тестов на животных непосредственно на человека (C.Hendrikcen, 1995).
Учитывая чувствительность серологических методов индикации микробных антигенов, можно полагать, что они могут с успехом заменить существующий метод. Очевидно, что эти методы должны в полной мере отвечать высоким требованиям современного серологического анализа по уровню чувствительности и специфичности, а также должны быть оперативными, экспрессными, экономичными и легко воспроизводимыми.
В этом отношении реакция коагглютинации (РКОА) и иммуноферментный анализ (ИФА) являются наиболее перспективными, так как отвечают всем вышеперечисленным требованиям.
Диагностические реагенты для РКОА представляют собой взвесь инактивированных стафилококковых клеток, на которых за счет белка А иммобилизованы иммуноглобулины (антитела) класса G и обозначаются как специфически направленные стафилококковые реагенты (СНСР). Благодаря экспрессное, экономичности и простоте воспроизведения РКОА предлагается для идентификации большой группы микроорганизмов и их растворимых антигенов (В.Г.Асеева, 1993; О.Ф.Белая, 1997; И.К.Мазурова,1993; B.P.Minshew, 1985). Однако данных по использованию этого метода для индикации токсинов ботулизма мы не обнаружили.
Одним из наиболее активно развивающихся направлений иммунохимических методов является иммуноферментный анализ (ИФА). Это обусловлено такими его достоинствами, как высокая специфичное!'.» и чувствительность, удобство и скорость выполнения, безопасность и хорошая воспроизводимость. ИФА хорошо зарекомендовал себя в разнообразных
аналитических определениях и, в частности, для определения антигенов в биологических субстратах (А.М.Егоров, 1987; В.И.Покровский с соавт., 1983; L.I.Reiker et al., 1996). Можно полагать, что ИФА может стать альтернативным методом для распознавания ботулизма и выявления источников инфекции.
В Пермском НИИВС уже имелся большой опыт по разработке серологических микротестов и конструированию иммуноферментных тест-систем для определения бактериальных растворимых антигенов (Л.Ю.Смурова, 1988; В.Н.Сперанская, 1987). Эти исследования продолжены применительно к ботулиническим токсинам-анатоксинам типов А, В и Е.
Работа базируется также на опыте исследований, проводившихся в институте в области иммунохимии антител, являющихся основными специфическими составляющими стафилококковых диагностикумов и иммуноферментных тест-систем (Л.И.Райхер, И.И.Райхер, 1995), и выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ Пермского НПО «Биомед» (№ гос. регистрации 01.90.0014562).
Цель работы: Изучить возможность серологической индикации и дифференциации ботулинических токсинов-анатокинов типов А, В и Е в реакции коагглютинации и иммуноферментном анализе.
Основные задачи исследования:
-
Получить противоботулинические антительные препараты типов А, В и Е на основе аффинноочищенных антител и их Р(ав);-фрагментов для конструирования противоботулинических специфически направленных стафилококковых реагентов (СНСР) и иммуноферментных тест-систем (ИФТС).
-
Разработать стабильные противоботулинические СНСР типов А, В и Е.
-
Оценить в экспериментах чувствительность и специфичность РКОА для определения ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в условиях производства бакпрепаратов.
4. Разработать иммуноферментные тест-системы для экспрессного определения видо- и типоспецифичности ботулинических токсинов-анатоксинов
типов А, В и Е.
5. Исследовать в модельных экспериментах и клинико-эпидемиологических наблюдениях возможность выявления бытового ботулизма с помощью разработанных иммуноферментных тест-систем.
Научная новизна и практическая ценность. 1.Впервые разработаны высокочувствительные специфически направленные стафилококковые реагенты для детекции ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е в РКОА, в которых для сенсибилизации клеток стафилококка использованы кроличьи аффинноочищенные специфические антитела.
2. Впервые разработаны модифицированные противоботулинические
СНСР с использованием специфических лошадиных антител, генуинно не
обладающих аффинитетом к белку А золотистого стафилококка. Получены
стабильные лиофилизированные препараты.
3. Впервые получены стабильные цветные СНСР для детекции
ботулинических токсинов-анатоксинов типов А, В и Е.
4. Установлена перспективность использования РКОА с
противоботулиническими СНСР в условиях производства токсинов-
анатоксинов.
5. Получены разновидовые противоботулинические антительные
препараты для конструирования иммуноферментных тест-систем.
6. Впервые получены антительные препараты, дифференцирующие
типы токсинов А и В. Разработана методика комбинированной аффинной
очистки иммунных противоботулинических сывороток, включающая
перекрестную очистку антител на гетерологическом антигенном
иммуносорбенте.
7. Все антительные препараты для иммуноферментных тест-систем разработаны в виде F(aB)2 — фрагментов аффинноочищенных антител, что позволяет устранить неспецифические реакции, обусловленные
7 -х-рецепцней, характерной для интактных иммуноглобулинов.
8. Получены и оценены в модельных опытах оригинальные
высокочувствительные иммуноферментные тест-системы для детекции
зотулинических токсинов типов А, В и Е.
9. Впервые с помощью тест-систем проведена индикация
эотулинических токсинов в крови, моче, патологоанатомическом материале, в
эстатках пищи и исходных продуктах, рвотных массах, промывных водах, а
также в посевах этих материалов на питательных средах после
подращивания.
-
Иммуноферментные тест-системы для индикации ботулинических токсинов типов А, В и Е используются Пермским областным центром Госсанэпиднадзора с 1991 года для диагностики ботулизма в г. Перми и Пермской области.
-
На основании проведенных исследований разработана технология производства иммуноферментных тест-систем для определения антигенов ботулинических токсинов типов А, В и Е. Оформлена нормативно-техническая документация: экспериментально-производственный регламент, проект временной фармакопейной статьи и инструкция по применению тест-систем, утвержденная НТС НПО «Биомед» и направленная на рассмотрение и утверждение в ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на итоговых научных конференциях Пермского НИИВС (1990, 1991, 1994), научной конференции, посвященной 85-летию Томского НИИВС «Актуальные вопросы медицинской биотехнологии» (Томск, 1991).
Диссертационная работа прошла экспертизу и апробирована на расширенном заседании Научно-технического совета Пермского НПО «Биомед» (25 февраля 1998 года).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Серологическая индикация ботулинических токсинов-анатоксинов
типов А, В и Е в реакции коагглютинации и иммуноферментном анализе.
2. Принципы, получения стабильных противоботулинических СНСР
различных модификаций. РКОА с СНСР - информативный, экспрессный и
экономичный тест оперативной оценки ботулинических антигенов в
производственных условиях.
3. Технология изготовления иммуноферментных тест-систем с
использованием антительных препаратов, дифференцирующих
ботулинические токсины типов А, В и Е. Индикация ботулинических токсинов
типов А, В и Е в иммуноферментном анализе для клинико-
эпидемиологического выявления бытового ботулизма.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, описания материалов и методов, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, включая 16 рисунков и 27 таблиц. Указатель цитируемой литературы содержит 170 источников, из них 80 отечественных и 90 иностранных авторов.