Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время роли нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека в регуляции различных систем хозяина (иммунной, сердечно-сосудистой, кроветворной, эндокринной, нервной) уделяют особое внимание.
Именно бифидофлоре принадлежит ведущая роль в поддержании и нормализации микробиоценоза кишечника, поддержании неспецифической резистентности организма, улучшении белкового и минерального обмена и др. Дефицит бифидобактерий вызывает развитие дисбиозов, он ведет к нарушению минерального обмена, процессов кишечного всасывания, белкового и жирового обмена, к формированию хронических расстройств (Гончарова Г.И. 1986г. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. 198бг, Лянная A.M., Левченко Т.Д., Сильч нко Н.А. 1994, Soavedra J.M., BaumanN.A., Oung I. et. all, 1994).. Имеются сведения о том, что бифидобактерий являются "поставщиком" ряда незаменимых аминокислот, в том числе триптофана, витаминов, установлена их антиканцирогенная и антимутагенная активность, способность снижать уровень холестерина в крови, ответственной за утилизацию лактозы и др. (Hyghes D.В.,Hoover D.G. 1991, Hull R.R., Conwoy P.L. 1992, Teruakl A,. Che Oing-Ming et ell. 1994, Bartram et all., 1994, Naokl N.. Kohji 0 et all,. 1996). Бифидобактерий способны оказывать выраженный ингибиторный эффект на микроорганизмы, метаболиты которых воздействуют 'отрицательно на функцию всего желудочно-кишечного тракта (Mitsuhashi S, Murata N.J. 1991).Ингибирование происходит не только за счет молочной, уксусной кислот, но и за счет синтеза особых антибактериальных веществ-бактериоцинов(МедГіГоиз J.,Euloge P.et.all,1990, Gibson, Wang,1994, ЧешеваВ.В., Манвелова M.A. 1994).Все эти положительные эффекты в свое время позволили рассматривать бифидобактерий как основу для создания препаратов, обладающих многофакторным стимулирующим" воздействием на общую резистентность и обмен веществ. Многолетние клинические наблюдения по лечебному и профилактическому применению бактерийных препаратов,в состав которых включены бифидобактерий, лактобактерии, колибактерии, показали, что отсутсвуют побочные эффекты при их длительном применении (Гончарова Г.Н. и др.1979, 1983., Семенова Л.П. и др.1983, ТУ-49^9784,1984., Хамагаева Н.С., Хамнаева Н.И. и др.,1986, тендеров Б.Д., Манвелова М.А.,1994). Многофакторное стимулирующее
воздействие бифидосодержащих молочных продуктов способствовало развитию нового научного направления- функциональное питание. К продуктам функционального питания относятся молочные и немолочные продукты, содержащие специально подобранные штаммы бифидобактерий и молочнокислых с установленным лечебным и профилактическим действием (Лянная A.M., Левченко Т.А., Сильченко М.А.1994).
Для поддержания жизнеспособности и стабильности культур би-фидобактерий к ним добавляют другие микроорганизмы, наиболее часто ацидофильные лактобактерии и термофильные стрептококів (Taka-no, Saito, Futaml, Haykawa, 1989, Morinaga, 1990), а так же имеются сведения, что при совместном выращивании бифидобактерий B.blfldum и пропионобактерий Proplonibacterlum freudenrelchll активизируется рост и развитие бифидобактерий (Kaneko Т. Mori Н, Iwata М., Meguro S. 1994).
Штаммы, предназначенные для использования необходимо отбирать по целому ряду признаков: способность ингибировать рост патогенных и условно-патогенных кишечных бактерий, способность наращивать микробную массу в короткие сроки культивирования, способность и длительность колонизации желудочно-кишечного тракта, устойчивость к низкой рН и к повышенной концентрации желчи, фенолу, способность кислотообразования и сквашивать молоко, устойчивость к антибиотикам (Семенова Л.П., Гончарова Г.И., Лянная A.M., 1989, Пахомова М.В., Гончарова Г. И.', Лянная A.M., 1991). Такими высокими требованиями можно объяснить факт, что только немногие из выделенных культур бифидобактерий могут быть производственными. В настоящее время только 4 штамма бифидобактерий используются в производстве лечебных препаратов и лечебно-диетических продуктов. Все эти штаммы выделены и изучены в Московском научно-исследовательском институте им.Габричевского Г.Н.. Столь же ограничено количество штаммов и за рубежом. Однако бактерийные препараты, выпускаемые в нашей республике, на основе российских штаммов бифидобактерий не всегда достаточно эффективны. Тем не менее, в Узбекистане до настоящего времени отсутствовали исследования, касающиеся экологии бифидобактерий я "сишечнике местного населения, их изоляция из состава микрофлоры кишечника, получение чистых культур, изучение особенностей биологии с учетом экологического действия окрулгащей среды и особенностей типа питания местного населения. Эти исследования крайне важны для нашего региона из-за ши-
рокого распространения дисбактериоза кишечника у детей и взрослых. Так, при обследовании детей первого года жизни 63,4Z страдают дисбактериозом (Денисова 0.У., Азизова В.К., 1994, Нурузова З.А. 1995, Нурматов В.А. и др. 1994). Факторами, вызывающими дефицит бифидобактерий,являются высокая солнечная инсоляция, насыщенность пищевых продуктов пестицидами, минеральными удобрениями, высокое содержание солей тяжелых металлов в воде, бессистемное использование антибактериальных препаратов и многое другое. Поэтому, разработка новых бактерийных препаратов и кисломолочных продуктов на основе местных, высокоэффективных штаммов бифидобактерий представляется весьма актуальной.
Дель работы. Выделение и изучение морфолого-культуральных, физиолого-биохимических, антибактериальных свойств, подбор удовий культивирования, лиофилизации и использование наиболее высокоэффективных местных штаммов бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и кисломолочных продуктов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
изучение бифидофлоры кишечника детей первого года жизни, находящихся на грудном и искусственном вскармливании на ограниченном контингенте детей;
выделение местных штаммов бифидобактерий из фекалий здоровых детей, изучение -кислотообразующих и молокосвертывающих свойств;
изучение морфологических, культуральных, физиолого-биохими-ческих свойств с целью определения таксономического положения культур. Отбор культур бифидобактерий,- представляющих практический интерес;
исследование антимикробных свойств бифидобактерий к нежелательной микрофлоре кишечника, устойчивости к ингибирующему действию повышенной концентрации желчи, соли, феноіг,"'. антибактериальным., препаратам:
изучение "влияния различных бифидогенных факторов среды на рост, развитие, кислотообразовапие, включая и синтез длинноцепо-чечных жирных кислот;
разработка состава среды и условий культивирования бифидобактерий, пригодных для ферментации микроорганизмов в больших емкостях, подбор параметров культивирования, обеспечивающих активное накопление живых особей бифидобактерий;
подбор условий лиофилизации бифидобактерий для длительного
- б -
хранения с учетом степени выживаемости и сохранности основных технологических свойств в разные сроки хранения.
Научная новизна работы. Впервые осуществлено выделение местных штаммов бифвдобактерий из фекалий здоровых детей грудного возраста. Из 72 накопительных культур отобрано 4 высокоэффективных штамма бифидобактерий.
На основании морфологических, физиолого-биохимических признаков проведена идентификация чистых культур.. Они отнесены к роду Bifidobacterium - видам bifidum (9С), longum (В*. 17х), adoles-centis (30). Все культуры отличаются интенсивностью и высокой скоростью роста при культивировании на среде Елаурокка.
Местные штаммы бифидобактерий обладают высокими антагонистическими свойствами по отношению к кишечным патогенам (E.coli С-600, S/typhimurium - В-869, 207; P.vulgaris В-1667, К.pneumoniae В-І823; P.aeruginosa В-1484).
Одной из особенностей местных штаммов бифидобактерий является их устойчивость к высокой концентрации желчи ( 40Х), фенола (0,5%), соли (6,5%), некоторым антибиотикам (гентамицин, метицил-лин, стрептомицин, левомицетин, метронидагол).
Наиболее ценным свойством местных штаммов бифвдобактерий является их высокая молокосвертывающая активность (В.longum, B.ado-lescentis), поэтому культивирование в обезжиренном молоке и различных молочных средах с биодобавками (дрожжевой, печеночный, кукурузный экстракты) обеспечивают высокий титр живых клеток.
Для выращивания бифидобактерий в больших емкостях рекомендуется более дешевая, чем общепринятые среды Блаурокка или кукуруз-но-лактозная, модифицированная нами гидролизатно-молочная среда, основу которой составляют протосубтилиновый перевар белков молока или трипсиновый перевар казеина молока, с добавлением разработанного нами нового источника ростактивирующих веществ.Показано, что по сравнению с культивированием в термостате, выращивание бифвдобактерий на различных средах в анаэростате' в атмосфере' природного газа значительно увеличивает титр живых особей бифидобактерий. Подобранный режим лиофилизации также обеспечивает сохранение высокого титра клеток в процессе- длительного хря^епия (1 год).
Практическая ценность работы. Путем отельного отбора получены промышленно зажныв штаммы бифидобактерий, перспективные для Енедрения в фармацевтическую и пищевую промышленность. Впервые
разработаны питательные среды, микроаэрофильные условия культивирования бифидобактерий, максимально приближенные к производственным, определены параметры выращивания микроорганизмов с высокой скоростью роста; полученные данные легли в основу приготовления нового бактерийного препарата "Бифидумбактернн PL" и продуктов лечебно-профилактического действия "Бифилон М" и "Бифилон КМ".
Апробация работы. Материалы работы докладывались на II! Всесоюзном семинаре на тему: "Актуальные проблемы получения антибиотиков и других биологически активных соединений микробного происхождения" (Степногорск, 1991), на научной конференции, посвященной 5-летию независимости Республики Узбекистан и 660-летнему юбилею Амира Темура (Ташкент, 1996) и на 1 съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент,1997).
Публикации.По материалам диссертации опубликованы 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы. Материалы изложены на 100 страницах машинописного текста, включая 31 рисунок, 21 таблицу. В списке литературы 142 наименований, из них 93 отечественных, 42 иностранных. .
Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатории "Генетика молочно-кислых бактерий" Института микробиологии АН РУз. Чувствительность бифидобактерий к антибактериальным препаратам исследовали в лаборатории .микробиологии Научного центра хирургии им. акад. Вахидова В. МЗ РУз, биохимические исследования проводили в Институте биохимии АН РУз.