КОБАЛЬТ И КОРРИНОВДЫ В БИОЛОГИИ PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII Рыжкова, Евгения Петровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Физиология прокариот— центральное направление микробиологии, формирующее целостное представление о жизнедеятельности организма Изучение фнэиолого-биохимическнх свойств практически значимых микроорганизмов актуально в плане решения общечеловеческой задачи -улучшения качества жизни. Пропноновокислыс бактерии (ПК Б) имеют разнообразное практическое применение. Достаточно напомнить. что Propionibucierium fretidenreichii subsp ъЫ-гтапИ (далее - P. freutiwrcichti) -основная и незаменимая культура, используемая в мировом производстве «твердых» сырое, а в России - и в производстве витамина В_(;, однако обпасти применения ПКБ этим не ограничены. Поэтому биология ПКБ находится под постоянным «прицелом» специалистов разных профилей. Регулярно проводится международный тематический симпозиум "Propionibactcria". Научный интерес вызывает неоднозначность метаболизма ПКБ, например их отношение к молекулярному кислороду. Исходя из основного способа получения энергии (пропионовокислого брожения, ПБ) и способности развиваться при доступе кислорода, - это аэро толерантные анаэробы (Определитель бактерий Берджн, девятое издание. 1997). но их относят к микроаэрофильным организмам (Воробьева, 1958; 1976; Pritchard ct al., 1977; Ye ct at., 1999). Актуальным является вопрос, каким образом ПКБ обеспечивают свою аэротолсрантность; и в этом направлении ранее была проделана большая исследовательская работа, однако многое оставалось не выясненным.

Существует проблема метабол ігч ее кого лимитирования экспрессии генов в корме (Голов л ев, Головлева, 2000); одновременно расширяется представление о роли альтернативных ферментов в пластичности метаболизма бактерий (Якунин и др., 1999). Выявление естественной модификации (перестройки) метаболизма прокариот под действием факторов внешней (и внутренней) среды наряду с изучением метаболического лимитирования биохимических реакции актуально в связи с активным развитием метаболической инженерии. Главной задачей этого нового направления биотехнологии является «оптимизация экспрессии генов» с использованием целенаправленной переориентации потоков вещества (энергии) так.

что, активно продуцируя целевой метаболит, '«'"Т'гч'Дтия* іп_Т№і f^vp-іна^ гвгцл

! UMG НОСА |

жизнеспособность. Этот подход принципиально отличен от «максимизации экспрессии целевых генов» в клетках, погибающих в результате сверл продукции метаболита или чужеродного бока, в которых заинтересован только человек ІДсбабов. 199!); Машко и др.. 2002J

В последнее десятилетие значительно возросло знание функции корринонлов (соединении группы витамина В₁₂) в биологин прокариот. Являясь древними полнфункциональными (бно)катэлизаторами они вовлечены в центральные метаболические процессы современных прокариот, такие как МБ. мстаногенез, гочоанстогенез. сулъфатредукция. биосинтез мстноннна и дезоксирибоз ильных предшественников ДНК и другие. К настоящему времени открыто и изучено более тридцати биохимических реакций, катализируемых корринокдеодержащими ферментами. Открытие новых функции корринонлов продолжается ІРьгакова (Иордан), 2003]. Проблемам биосинтеза и функций корринонлов посвящают международные конференции (последняя происходила в 1996 году в Австрии), но, несмотря на обнаружение всё новых биохимических реакций, протекающих при участии корринонлов, актуален вопрос о физиологическом значении его высокого естественного уровня образования в клетках некоторых бактерий и архей. Новый взгляд на роль кобальта и корринонлов в жизнедеятельности /». freudenreichii неизбежно ускорил бы шученис этого явления у других прокариотическнх организмов.

Соетошше вопроса. В исследованиях В.Я. Быховского значительное внимание было уделено роли кобальта и кобаламина {истинного витамина В,;) в биосинтезе корринонлов - соединений группы витамина B_t; (Быховский и др., 1969 а,б; 1975; Бычовский. 1979; Быховский, Зайцева. 1989; Bykhovsky et al„ 1997). Значение ионов кобальта и корринонлов хп жизнедеятельности бактерии в целом оставалось вне поля зрения авторов. Вместе с тем потребность в ионах кобальта для роста культур (и образования корринонлов) в свое время отмечали у представителей p. Rhizobhtm (Klicwer, Evans, 1963: Cowles ct al„ 1969) и некоторых шіанобактернй (Fogg ct al.. 1973; Beck. 1982).

Известно, что среди неполимерных соединений корринокды - сложнейшие молекулы с уникальной кобальт-углеродной связью, обратимое расщепление которой определяет их множественные химические и биохимические функции

(Рыжкова, 2(103). Биосинтез корриноидов требует значительных затрат нентроболнтов и энергии, однако некоторые бактерии и археи способны к естесівенному образованию и внутриклеточной аккумуляции коррлноидов в количествах, в 100 - 101Ю pat превышающих обычные уровни их содержания в клетках (единицы - десятки мит на грамм ЛСБ). Вопрос о биологическом значении этого явления был впервые поставлен в отношении Л freudenreichii (Barker et aL 195H; Wcisbach ct al., 1959). Открывали всё новые биохимические (коферментные) функции коррииоидов, изучали механизмы их действия, но на главный вопрос ответа не было.

Неоднозначность метаболизма иропноковокнелых бактерии, возможность его перестроек, констатирована при изучении влияния молекулярного кислорода на энергетический обмен ПКБ, в котором помимо основного процесса - ПБ, включающего в себя электрон-транспортную цепь с использованием фумарата в качестве конечного акцептора электронов, определённое место занимает дыхание кислородное. Фактором перестройки энергетического обмена ПКБ, в том числе и Р. frcudenrcichii, служит молекулярный кислород При ограниченной аэрации у Р. freutlenreichti функционирует дыхательная цепь, которая имеет, прежде всего, предохранительное (от токсического действия кислорода) значение (De Vries et al„ 1У72; Бонариева, 1973; Брюхачева и др., 1975; Pritchard, 1977; Pritchard, Asmumlson, 1980, Скулачёв. 1997; Edwards et al., 20(10), Обнаружение ферментов знтиокнелнгсльной защиты клеток (ФАОЗ): супероксиддисмутазы (СОД), каталаїьі и пероксидазы — позволило подойти к объяснению аэротолсрантностн Л freufknreichii (Воробьёва, 1976; Крзева, Воробьёва, 1981; Воробьёва и др.. 1986). однако вопрос о причинах устойчивости бактерии к действию молекулярного кислорода не был исчерпан.

ПКБ обладают эффективным и пластичным конструктивным обменом. Они синтезируют все необходимые аминокислоты и другие компоненты клетки, развиваясь на минеральных средах с одним из многих Сахаров (или иным источником органического углерода) к некоторыми витаминами (ауксотрофи по пантотеновон кислоте нбногину). Вместе с тем ПКБ используют для роста аминный или молекулярный азот (Баранова. Климонтович, 1971; Баранова, Гоготов, 1974),

В поле трения всегда оставалось удивительная способность /* /retuienrcichn подвидов shermarui л freuJenrekhu к накоплению в клетках больших количеств корриноилов (соединений группы витамина В);, кобамндов, СЬа), среди которых доля кобаламина (СЫ) - истинного витамина В_1;. в молекулу которого входит азотистое основание 5,6-диметилбензимкаазол (Krautlcr. 199К а), составляет — К>% (Бычовскин. Зайцева, Ш9; Bykhovsky ct al., 1997).

Сушествовало представлен и с о «настройке» метаболизма P. freudenmchii исключительно на высокий уровень их образования как физиологической особенности бактерии (Воробьева. 1995; Vorobjcva. 1999, 200()). Высказывалось также противоположное мнение о лсрегуляцки биосинтеза этих соединений, однако для его отрицания появлялись всё новые наблюдения, например постоянство содержания СЫ r клетках экспоненциально растущей культуры (Воробьёва, 1976), регулируемость биосинтеза корринонлов (БыховскиН. 1979; Bykhovsky el al., 1997). К началу наших исследований в метаболизме P. freudenrcichti были известны две биохимические реакции, катализируемые кобамид-зависимыми ферментами: ключевая реакция ПБ (изомеризация сукциннл-КоА в метилмалоннл-КоА) и биосинтез метионина. Ферменты этих реакции используют кобамиды в качестве коферментов, но проявляют разную специфичность к форме кобамида (Overath ct al., ІУ62; Skupin ct al., 1970; McKie et al., 1990; Chowdhury ct al., 200I).

Цель її задачи неслеловашгіі. Цель диссертационной работы была определена как поиск и раскрытие биологи¹! ее кого смысла способности Propionibactenum freudenreichii subsp. shermarui к образованию внутриклеточных корринонлов в высоких* концентрациях в период активного развития, что свойственно и некоторым другим прокариотам. Поэтому в целом работа была направлена на изучение роли кобальта и корриноидоп в жизнедеятельности бактерии. Принципиальный методологический подход состоял в выявлении различий в физиологическом состоянии бактерии: ее развитии, выживании и метаболическом статусе - при нормальном (физиологическом) уровне образования корринонлов и при снижении последнего, вплоть до глубокого (1000-кратного) дефицита в клетках.

Основные задачи, на решение которых была направлена работа, заключались в следующем:

I. Исследовать последствия изменения концентрации соли кобальта в среде для

5 развития /'. freudenretchii в разных условиях культивирования в связи с изменяющимся уровнем эндогенных корриноидов — соединении группы витамина Ві: (кобамилов). Установить физиологически значимый или нормальный (соответствующий наиболее активному развитию бактерии) уровень ич образования в клетках.

1. Оценить возможность развития бактерии при свободном доступе воздуха (аэротодерантность) в сравнении с аноксическими условиями на разных средах, а также устойчивость клеток к летальному действию УФ-нзлученкя в норме и при лимитировании клеток по содержанию корриноидов,

2. Определить уровни эндогенных кобамидов. необходимые для эффективного пропионовокислого брожения, биосинтеза метноннна и образования нуклеиновых кислот в клетках бактеріт.

3. Проанализировать воздействие разных форм корриноидов иа образование ДНК в клетках дефицитной по ним бактерии. Доказать прямое специфическое вовлечение кобаламина (истинного витамина В і;) в процесс и показать его метаболическое лимитирование кобаламином в полноценных по содержанию суммарных корриноидов клетках.

4. Объяснить участие кобаламина в анаболизме ДНК. с одной стороны, и не прекращающийся биосинтез ДНК при глубоком дефиците корриноидов в клетках, с другой.

5. Исследовать функциональные и некоторые структурные свойства альтернативных (в отношении зависимости от аденози л кобаламина) рибонуклеотидредуктаз (РНРаз. КФ 1,17.4,-), ответственных за формирование пула дезоксирибози льны х предшественников ДНК.

6. На примере системы РНРззы выявить регудяторное действие кобаламина: показать его функцию как фактора физиологической (метаболической) перестройки бактерии.

Научная новіші» и шачнмость работы. 6 результате обобщения полученных в настоящей работе экспериментальных данных и имеющихся научных предпосылок возникло новое представление о двойственном характере физиологии PnipionibacKrnimfreudenreichii, определяемом ионами кобальта в среде и уровнем образования корриноидов в клетках.

Бактерия представляет собой пример прокариота, у которого кобальт не только контролирует (и стимулирует) образование корриноидов. но в определенных условиях служит фактором роста. Концентрационную зависимость роста лрокарлогического органи-іма от соли кобальта в среде проследили впервые (Иордан и др., 1<Щ); позже она была исследована у SUthanosarcina barkeri (Kumar ct al., 19K7). Нам представляется, что это должно быть учтено в отношении других микроорганизмов, обладающих способностью к образованию корриноидов в значительных количествах.

Установили, что естественный высокий уровень образования корриноидов, на 2 - 3 порядка превышающий таковой у многих прототрофов по витамину Вц. существен для аэротолерантностн и УФ-резистентности бактерии, что, видимо, отражает особенность предков ПКЬ, их первичную среду обитания и экологическую нишу в условиях древней Земли. Впервые корринонды рассматриваются как возможные (дополнительные) факторы зашиты прокариотнческон клетки от стрессорного (токсического) действия кислорода.

Выяснит!, что для нормальной интесивносги П5 Я, freudenreichii достаточно ~ 1% синтезируемых ею кобамндов, что объясняется широкой специфичностью ключевого фермента ПБ к разнообразным формам кобамндов. С Ы-зависимая реакция биосинтеза мстнонина сохраняет свою эффективность при снижении общего содержания кобамндов иа порядок. Вместе с тем. биосинтез ДНК в клетках P. freudenreichii метаболически лимитирован по СЫ даже при высоком уровне образования корриноидов. Стимулирующий эффект СЫ в отношении биосинтеза ДНК показан нами для представителей других видов ПКБ и некоторых сгреггтомииетов. Пришли заключению, что с уровнем СЫ может быть связано непостоянство содержания ДНК в прокариотнческои клетке. Установленное нами прямое н специфическое во:действие СЫ на образование ДНК позволяет прогнозировать его участие в физиологическом контроле репликации (и генетических процессов, которые репликацию включают) у многих прокариот, сктезирующих или требующих витамин В_1г (условие необходимое).

Впервые получены экспериментальные данные, свидетельствующие о вовлечении метилкобаламина (МсСЫ) в качестве донора метильных групп в транс метилирование ДНК альтернативно по отношению к S-аденозилмстионину.

Это третья биохимическая реакция в метаболизме P. frewknrvtchii. протекающая при участии витамина В_!;. Обнаруженное нами зависимое от аденозилкобаламина (AdoCbl) превращение рибонуклеотида в дсюксирибонуклеотид явилось четвертой рсаішисй, известной в настоящее время в метаболизме P. frettdcnreichii. в которой участвует кобам ид

Для /'. fremienreichii впервые показано, что РНРаза. катализируя первую специфическую и скорость лимитирующую реакцию анаболизма ДИК, облигзтко требует аленозилированнын кобаламин (AdoCbl). при этом естественный уровень кобамидов (кобаламнна) в клетках бактерии в норме ограничивает ее активность. Обнаружение этого фермента позволило объяснить прямую и специфическую зависимость образования ДНК от кобаламнна у бактерии и дало возможность преодолевать метаболическое лимитирование процесса по нему. Функционирование AdoCbl-РНРазы в клетках - условие достаточное для того, чтобы сїимулировать биосинтез ДНК у того или иного прокариота витамином B_l; (AdoCbl).

Впервые обнаружили, что P. freudenreMnl, в отличие, например, от Khizobtum теіїШі (Cowles ct al„ 1969), способна активно развиваться на «бескобальтовой» среде, практически не синтезируя корринонды. При этом она испытывает потребность в дополнительных факторах роста, например циетеине, метионнле. восстановленном г.зутатионе или триптоне. и перестраивает метаболизм. При глубоком дефиците корриноидов в клетках изменяется характер ПБ: образование ДНК происходит без участия кобаламнна. причём AdoCbl в этом случае подавляет процесс. Установили, что основной «мишенью» служит дублирующая РНРаза. зависимая от ионов марганца и активируемая молекулярным кислородом, активность которой AdoCbl ннгибирует. Альтернативные РНРэлы в клетках одного организма показаны впервые (Иордан и др.. 1975; 1986; 20Ш; Иордан и др., 1986; Иордан, Петухова, 1989; Иордан, 1992). Полученные нами результаты были подтверждены на примерах других бактерий (Barlow, 1988; Fontecave et al., 1989; Jordan et al„ 1999; Borovok ct a!.. 2002).

Мы также впервые наблюдали обратимую перестройку метаболизма Р. frettdenreichii под действием ионов кобальта или кобаламнна. Ионы кобальта, добавленные в среду, на которой активно развивается испытывающая глубокий дефицит корриноидов (кобаламнна) бактерия, возвращают ей первоначальное

я физиологическое состояние: возобновляется биосинтеза корринонлов и способность бактерии развиваться на минимальной среде в присутствии воздуха. Экзогенный кобаламіні (AiloCbl) вызывает перестройку в системе альтернативных РНРаз бактерии, действуя на уровне активности ферментов и биосинтеза белка. Способность P. freudenreichii к альтернативным физиологическим состояниям в зависимости от обеспеченности клеток кобальтом и корриноидами (кабаламином), является проявлением сё метаболической пластичности, обусловленной этими факторами, что. видимо, способствует освоению бактерией новых сред обитания.

Практическая кешшеть. Некоторые установленные в настоящей работе закономерности биологии Р, freudenreichii нашли практическое применение. В зависимости от конкретной задачи рекомендовано либо поддерживать высокий уровень образования коррнноидов в клетках бактерии, либо значительно снижать его.

1. Для получения лропионовой кислоты, используемой в качестве антисептика в пншевой промышленности и сельском хозяйстве, на основе иммобилизованных клеток P. freudenreichii, синтезирующей витамин Bi;. создан биокатализатор и предложен способ его реактивации (Воробьёва и др., 1978; Иордан и др., 1979).

2. Изобретения способов приготовления теста м защиты хлеба от «картофельной болезни» при использовании в заквасках P. freudenreichii (с заданным уровнем витамина В^в клетках) внедрены в хлебопекарной промышленности (Богатырева и др., 19X8; 1990),

3. На основе пермеабилизованных клеток P. freudenreichii, трансформ крующих рибонуклеоткды в дезоксирибонуклеотиды благодаря активности AdoCbl-РНРазы. разработан способ получения дезоксирибонуклеотидов (Иордан, Прянишникова, 1997).

4. В связи с началом работ по генетической модификации штаммов бактерии, применяемых в производстве «твёрдых» сыров типа «Швейцарский», практически значимыми явились рекомендации по культивированию бактерии в условиях активного биосинтеза ДНК, зависимого от обеспеченности клеток кобаламином (Ryzhkova (Jordan). 2001).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на республиканских конференциях молодых ученых (Ташкент, 1976, 1978; Рига. 1977);

заседаниях секции и Сьсідс ВМО (Москва, 1У80, 19Н2: Ллма-Лта. 19X5): всесоюзных конференциях: «Биосинтсі ферментов микроорганизмами» (Кобудсш, 1986). «Л цитирование и ингибнреванне роста микроорганизмов» (Пушино, 191W); международных конференциях, симпозіумах и конгрессах: FEMS International Symposium "Einironmenial regulation of microbial metabolism" (Puschino, USSR. 19K3): 14* International Congress of Microbiology (Manchester, England. 1980); First International Congress on Vitamins and Biofactors in Life Scincc (Kobe. Japan, 1989); 4^tt International Conference "nth International Conference "Thioredoxins and і el a led proteins" (S тої с nice — Bratislava, Slovak Republic, 2000); 3 International Symposium on Prcpi on і bacteria (Zurich, Switzerland, 2001).

Сірукгура и обьЕм диссертации. Диссертация состоит ні введения, дсвяііі глав (обюр литературы, описание объектов и методов исследовании, изложение экспериментов с обсуждением и ззключешимн. общее заключение), основных виполоп н списка цитируемой литературы. Лиссерташія изложена на 266 страницах, содержит 19 таблиц н 4К рисунков. Список цитируемой литературы включает 3X5 работ.

Нубликашш. Опубликована 51 работа: етатсіі 33, изобретений (авторских свидетельств и патентов) 4, тезисов и докладов на конференциях и снмпоиіумал 14.

Место проведении работы. В основном работа проведена на кафедре микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова при участии студентов, аспирантов и сотрудников кафедры. Ряд совместных робот выполнены: в Отделе функциональней биохимии биополимеров и в Огдслс лроматогрзфітческого анализа Института фиіико-химігчсской биологии им. А.Н. Белозерского (МГУ им. М.В. Ломоносова); ш кафедре микробиологии Бра ті і славе кого университета (Словакия); в Лаборатории основ действия радиации и биологически активных вешеств на клетку Института химической фишки им, Н.Н. Семёнова (РАН), а также — в ШИП Хлебопекарной промышленности (РАСХН).

Ociionittttc положения, выносимые на защиту 1. Высокий естественный уровень образования корриноидов. реализуемый в первичном обмене P. freudenreiehii при достаточной концентрации ионов кобальта в

10 срслс, имеет положительное (физиологическое) значение для бактерии в «жестких» условиях существования, при воздействии стрсссорных факторов среды.

2. Пропноновокислос брожение — основной энергетический процесс бактерии, не снижает интенсивности при значительной уменьшении содержания витамина В,_;, но для ефективного биосинтеза ДНК требуется высокий уровень образования корриноидов в клетках бактерии. В анаболиш ДНК прямо и специфически вовлечен кобаламин. который в норме лимитирует процесс иа уровне образования лредшествен н нков.

3. Бактерия, синтезируя на 2-3 порядка меньше корриноидов, чем в норме, способна развиваться; при этом она испытывает новые ростовые потребности и изменяет метаболизм.

4. Синтез ДНК при дефиците корриноидов в клетках бактерии не прекращается и происходит благодаря функционированию альтернативных ферментных систем формирования предшественников ДНК. среди которых ключевой является рнбонуклеотидредуктаза. независимая от кобалачина.

5. Кобаламин участвует в перестройке системы альтернативных рибон>'клеотидрсдуктаз у P. frettdcnreichii.